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骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究
目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.
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鹿茸多肽对抗骨关节炎软骨细胞氧化损伤作用的实验研究
目的:研究鹿茸多肽对骨关节炎软骨细胞的氧化损伤的逆转作用,探讨鹿茸多肽保护软骨细胞的主要作用机制.方法:选15只5月龄日本大耳白兔,采用内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板的Hulth骨性关节炎动物模型制作方法,体外分离培养软骨细胞.以假手术组细胞为正常对照组细胞,造模组细胞为骨关节炎软骨细胞,分别加入6.25、12.5、25μg/ml鹿茸多肽低、中、高剂量,从第9周(2个月)开始,每周处死1组动物,分离培养软骨细胞,连续8周,DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平,Griess法测定细胞培养上清中NO、SOD和GSH-Px含量.结果:DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平,对照组平均5.46±0.46,模型组平均12.08±0.74,两组比较,P<0.001;鹿茸多肽低、中、高剂量组分别为(9.81±0.59)、(7.83+0.63)和(6.89±0.71),与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).骨关节炎模型组中NaN02、SOD、GSH-Px分别为(5.60±0.45)μM、(38.56±12.53)U/ml和(151.90±25.60)U,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.05).NaNO2水平鹿茸多肽低剂量组(4.34士0.39)μM,中剂量组(3.67±0.36)μM,高剂量组(3.20±0.27)μM,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01);SOD水平鹿茸多肽低剂量组(49.91±5.77)U/ml,中剂量组(54.05±5.27)U/ml,高剂量组(57.44±5.70)U/ml,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05);GSH-Px水平鹿茸多肽低剂量组(172.50±18.65)U,中剂量组(202.10,21.60)U,高剂量组(315.80±10.50)U,中剂量组及高刺量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01).结论:鹿茸多肽对骨关节炎软骨细胞的氧化损伤有逆转作用,且在一定范围内呈现剂量依赖性.鹿茸多肽这种抗氧化损伤作用,具有研发成为骨性关节炎治疗药物的潜能.
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京尼平苷对硝普钠诱导软骨细胞凋亡与细胞周期的影响
目的:研究京尼平苷(Geniposide)对硝普钠(SNP)诱导软骨细胞凋亡与细胞周期的影响.方法:3周龄SD大鼠,用于分离培养软骨细胞.将第Ⅱ代软骨细胞进行分组,噻唑兰染色(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,硝酸还原酶法检测培养液中NO含量.结果:京尼平苷干预SNP诱导软骨细胞凋亡后,细胞处于GO/G1期的百分比减少,S及G2/M期的细胞百分比增加；同时显著降低软骨细胞凋亡率及培养液中NO含量(r=0.917,P＜0.01).结论:京尼平苷干预SNP诱导软骨细胞凋亡,可降低培养液中NO含量,促进细胞增殖,这可能是京尼平苷治疗骨性关节炎的作用机制之一.
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Piezo1蛋白在人退变软骨细胞应力模型中的表达特点
目的:探索新型机械敏感性离子通道Piezo1蛋白在人退变软骨细胞应力模型中的表达特点.方法:构建人退变软骨细胞体外培养-应力刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统FX-4000T 处理软骨细胞,根据预试验结果 加载0.5 Hz的加载频率和20％的细胞拉伸率.按细胞的处理时间分成0 h,2 h,12 h,24 h和48 h机械应力组.采用RT-PCR 技术,Western-blot检测Piezo1蛋白在周期性牵张应力作用下的表达水平.利用激光共聚焦显微镜检测Piezo1蛋白荧光的强弱.结果:(1)RT-PCR 结果 显示,2 h牵张应力组Piezo1的基因相对表达量较0 h牵张应力组增加(F=13.917,q=0.037 1,P<0.05),24 h牵张应力组Piezo1基因相对表达量达峰值, 而48 h牵张应力组Piezo1基因相对表达量较24 h牵张应力组降低,差异有统计学意义(F=13.917,q=0.049 5,P<0.05).(2)Western-blot结果 显示,2 h牵张应力组Piezo1的蛋白表达量较空白对照组(0 h牵张应力组)略有增加(F=19.341,q=0.037 1,P<0.05),24 h牵张应力组的Piezo1蛋白的表达量多,而48 h牵张应力组的Piezo1蛋白表达量较24 h牵张应力组降低(F=19.341,q=0.017 7,P<0.05).(3)Piezo1蛋白表达于髓核细胞的细胞质与细胞核,并且随着加力时间的增加,蛋白的荧光强度也有相应的增加.结论:在人类退变软骨细胞中,新型机械敏感性离子通道Piezo1蛋白有微量表达,加载周期性机械拉伸力后,Piezo1蛋白的表达量增多,并且呈现时间依赖性.
关键词： Piezo1蛋白离子通道 机械牵张应力 软骨细胞 -
关节软骨破坏的分子生物学机制
软骨组织无血管、神经分布,成熟的关节软骨包含少量的软骨细胞和其周围的大量的细胞外基质(extracellar matrix,ECM).由于关节软骨具有这种富含基质的组织学特征,因此基质的破坏几乎与软骨破坏同义.在关节破坏的研究中,过去认为,关节炎症时,激活的蛋白酶起重要作用,其后,不断有报告发现细胞因子、前列腺素、氧自由基等物质或炎症介质直接或间接参与了关节的破坏.近一氧化氮的作用,更令人关注.业已证明,各种因子决不是各自单独作用,而是不断形成网络互相影响.然而,各种因素的相互作用机制尚未完全阐明.
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MicroRNA在软骨损伤退变中作用机制的研究进展
MicroRNA (miRNA)是一种在转录后水平调控基因表达的非编码蛋白的RNA分子,参与了各种重要的细胞生物学过程,如细胞增殖、分化、凋亡和脂代谢等.软骨损伤退变可引起多种骨关节疾病,尚无有效的治疗手段.目前研究已发现,miRNA在软骨细胞增殖分化以及合成与分解代谢中起重要作用.随着miRNA新的靶目标的研究发现,其重要作用进一步被证实.本综述总结了miRNA的合成与功能,及其在软骨损伤退变中的具体作用及调节机制.认为miRNA在软骨损伤退变所致疾病的发病机制中起重要作用,在诊断和治疗中有重要的潜在价值,为治疗退变性疾病提供了一种新的思路.
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Wnt/β-catenin信号通路调节软骨代谢作用于骨坏死疾病的研究进展
越来越多的学者认为骨坏死疾病的发生与软骨细胞代谢异常有关,而Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin 的激活能促进软骨细胞分化,同时也能促进软骨分化中的细胞死亡.因此暗示该通路能够通过调节软骨代谢影响骨坏死疾病的发生发展.其次,软骨细胞特异性β-catenin基因条件敲除小鼠模型的成功建立,有助于阐明Wnt/β-catenin 信号通路调节软骨代谢的作用机制,为骨坏死疾病的病机阐述以及针对性治疗提供支持.本文就Wnt/β-catenin信号通路、软骨代谢与骨坏死三者间的关系展开综述.
关键词： 软骨细胞 代谢 骨坏死 Wnt/β-catenin信号通路 综述文献 -
力学刺激对软骨细胞整合素亚单位的调控
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是以关节软骨退变、关节缘骨质增生为主要改变的疾病.机械应力可以调节细胞的多种功能,而整合素作为细胞表面应力受体之一.主要介导细胞与细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)间的黏附,在传导力学信号从而调节细胞的生理功能方面起着重要作用.因此,在软骨病变早中期选择适当的良性刺激(如推拿手法)作用于软骨,调控整合素的表达影响软骨细胞的功能,修复损伤的软骨细胞,延缓关节软骨退变,这对于骨关节炎的治疗有重要意义.
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Wnt信号通路与骨关节炎
Wnt信号通路广泛地存在于各种属生物体中,调节控制着许多生命过程,如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、凋亡等.随着对其研究的不断深入,发现Wnt信号通路对早期软骨的化生与形成、体外软骨细胞的增殖与分化具有重要的作用,并已成为骨关节炎(osteoarthritis,OA)发病机制研究的新热点.
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软骨细胞周基质对软骨细胞作用的研究进展
软骨细胞周基质(pericellular matrix,PCM)是软骨细胞周围的狭窄基质条带,与其包绕的软骨细胞共同组成软骨单位.大量研究表明PCM富含蛋白多糖、胶原蛋白和纤维蛋白,且在调节软骨细胞代谢微环境方面发挥着重要作用.用微管吮吸技术直接检测软骨单位发现,PCM与软骨细胞和软骨细胞外基质的力学特性明显不同.然而,关于PCM的功能还不是十分明确,仍需进一步研究.
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触按叩听诊断髌骨软骨软化症
透明软骨是组成滑膜关节的核心.它光滑的表面便于运动,富有弹性能吸收震荡,表层有丰富而稠密的胶原使之具有韧性和抗磨损,保护关节软骨,加上滑液之润滑作用,使之成为任何材料都不能替代的关节结构.但软骨没有血管,其营养来自滑液和骨板终末血管之渗透.软骨细胞不能再生,因此创伤、劳损以及随年龄增长的自然磨损消耗,都会使软骨软化和退行性变.
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硒对家兔实验性骨折愈合过程影响的病理研究
目的研究硒对骨折愈合的影响.方法应用40只家兔做成双侧肱骨中段实验性骨折,随机分为2组:对照组饲常规饲料;实验组每日加饲微量元素硒0.6mg.术后2、3、4、5周取材,进行骨痂横截面积测量,光镜及电镜观察.结果实验组2～4周骨痂内的软骨细胞、成骨细胞等及基质的变化较对照组出现早,且功能活跃.结论饲料中加硒可促进兔骨折愈合,这可能与硒刺激软骨细胞的蛋白合成有关.
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益气化瘀方对椎间盘软骨细胞凋亡相关因子的作用
目的:探讨益气化瘀方对椎间盘软骨细胞凋亡状态下Bax、Bcl-2及Caspase-8表达的调控作用.方法:清洁级雄性1月龄SD大鼠20只,酶消化法获取椎间盘软骨细胞,用抗Fas抗体诱导其发生凋亡,通过益气化瘀方及其拆方益气方、化瘀方药理血清干预,免疫组化法(SP)检测分析大鼠椎间盘软骨细胞不同状态下Bax、Bcl-2及Caspase-8的表达.结果:相对正常组,凋亡模型组的Bax和Caspase-8表达明显,而Bcl-2轻度表达,有显著差异(P＜0.01).益气化瘀方、益气方和化瘀方均能降低椎间盘软骨细胞的Bax、Caspase-8的表达,而上调Bcl-2的表达,3种中药组与诱导凋亡组相比有显著差异(P＜0.01).结论:中药益气化瘀方、益气方和化瘀方都可以调控凋亡的大鼠椎间盘软骨细胞内Bax、Bcl-2、Caspase-8的表达,其治疗颈椎病的机制与其对凋亡相关因子的调控有关.
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关节软骨愈合和再生研究的现代进展(二)
3关节面损伤的恢复根据关节面(包括关节软骨和软骨下骨)损伤的生物学恢复进行研究,即可发现要想达到关节面恢复可提出两种可能.一种方法是增强关节软骨和软骨下骨的自身愈合能力;另一种方法是通过软骨细胞、软骨原细胞或具有生长新软骨能的组织移植,再生新的关节面,即关节面生物学重建.下面就这两种方法分别加以讨论.
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牛膝提取物对碘乙酸钠诱导的软骨细胞保护作用
目的:探讨牛膝提取物对碘乙酸钠(MIA)诱导的软骨细胞保护作用.方法:通过Ⅱ型胶原酶消化SD大鼠软骨,获得软骨细胞,实验分为5组,分别为正常组,模型组(4 μmol· L-1 MIA),牛膝提取物低剂量组(10 mg·L-1 +4 μmol·L-1MIA),牛膝提取物中剂量组(30 mg·L-1 +4 μmol· L-1 MIA),牛膝提取物高剂量组(100 mg·L-1 +4μmol·L-1 MIA),造模与给药分别为24 h;MTT法检测各组软骨细胞活力;Hoechst 33258染色法检测各组软骨细胞形态变化;分光光度法检测各组软骨细胞中Caspase-3活性;Western blot分析各组AKT激活状况及下游靶分子Bax,Bcl-2的表达.结果:与正常组比较,模型组中软骨细胞活力下降,细胞核发生皱缩或裂解,细胞中Caspase-3活性和Bax表达量上升,Bcl-2表达量下降,AKT磷酸化程度降低,差异均具有显著性意义(P＜0.01).与模型组比较,牛膝提取物中、高剂量组可改善软骨细胞活力,恢复软骨细胞形态并抑制Bax表达;牛膝提取物低、中、高剂量组皆能降低大鼠软骨细胞中Caspase-3活性,提高Bcl-2表达,并促进AKT磷酸化,差异具有显著性意义(P＜0.01).结论:牛膝提取物具有保护MIA诱导的软骨细胞作用,是通过抑制软骨细胞凋亡实现的,可能与PI3 K/AKT信号通路有关.
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独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞代谢,BMP-7及SIRT1表达的影响
目的:观察独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎(KOA)大鼠关节软骨细胞代谢、骨形成蛋白-7(BMP-7)及沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)的影响,为独活寄生汤的临床应用补充理论依据.方法:采用Huhh法建立KOA模型大鼠,模型成功后采用酶原消化法培养KOA软骨细胞;另将40只大鼠分为独活寄生汤低、中、高剂量组(0.85,1.7,3.4 g·kg-1)及硫酸氨基葡萄糖组(硫酸氨基葡萄糖胶囊0.3 g·kg-1),灌胃14 d后处死取血清;将培养细胞分为正常组、模型组、独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组(对应剂量组大鼠血清培养)及硫酸氨基葡萄糖胶囊组(硫酸氨基葡萄糖组大鼠血清培养);采用结晶紫法检测各组软骨细胞增殖能力;采用荧光原位末端转移酶标记法(TUNEL)法检测各组软骨细胞凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组软骨细胞中基质金属蛋白酶-13(MMP-13),MMP-3,Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ),聚集蛋白聚糖(Aggrecan),BMP-7及SIRT1 mRNA的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测各组软骨细胞中MMP-13,MMP-3,ColⅡ,Aggrecan,BMP-7及SIRT1的表达.结果:①与正常组软骨细胞比较,模型组细胞增殖能力明显降低,与模型组细胞比较,独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组软骨细胞增殖能力提高(P＜0.01);②与正常组软骨细胞比较,模型组细胞凋亡数量明显增加,与模型组软骨细胞比较,独活寄生汤低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组细胞凋亡数量明显降低(P＜0.01);③与正常组软骨细胞比较,模型组细胞MMP-13,MMP-3表达升高,ColⅡ,Aggrecan,BMP-7及SIRT1下降(P＜0.01);与模型组比较,低剂量组细胞中MMP-13,MMP-3 mRNA及蛋白表达无明显变化;硫酸氨基葡萄糖组及中、高剂量组细胞中MMP-13,MMP-3 mRNA及蛋白表达明显下降,且剂量越高上述蛋白及mRNA表达越低;硫酸氨基葡萄糖组及低、中、高剂量组细胞中ColⅡ,Aggrecan,BMP-7及SIRT1表达升高,且随剂量的增高而升高(P＜0.01).结论:独活寄生汤含药血清可通过增加KOA软骨细胞内BMP-7及SIRT1的表达,增加KOA软骨细胞合成代谢、抑制分解代谢,从而起到抑制KOA软骨细胞凋亡,促进软骨细胞再生的作用,进而起到治疗KOA的目的.
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骨灵膏及其拆方制剂对骨关节炎动物模型体外培养软骨细胞的作用
目的:通过骨灵膏及其拆方制剂对骨关节病(OA)体外培养软骨细胞的作用,探讨其对OA的作用机制.方法:SD大鼠随机分为骨灵膏、骨膏、灵膏、塞来昔布、模型及正常组6组,冷固法建立OA模型,造模成功后,各治疗组给予相应药物灌胃,其余组给予0.9％氯化钠溶液灌胃,给药10周后,用大鼠含药血清对体外传代培养的OA大鼠软骨细胞进行处理;镜下方格法计数细胞密度,免疫荧光检测Ⅱ型胶原的表达,CCK8检测软骨细胞光吸收值,收集各组大鼠脾脏和胸腺计算其指数.结果:4用药组含药血清处理的软骨细胞密度明显高于模型组(P＜0.01);骨灵膏与模型组、骨膏组、灵膏组及塞来昔布组比较,软骨细胞的OD显著增加(P＜0.01);与正常组比较,模型组大鼠脾脏指数(SI)及胸脾指数(TI)显著降低(P＜0.01);骨灵膏组与模型组、骨膏组、灵膏组及塞来昔布组比较大鼠的SI、TI显著增加(P＜0.01).结论:骨灵膏可提升局部软骨细胞增殖活力,阻止OA关节软骨退行性变,其作用明显优于其拆方制剂及塞来昔布.
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龟鹿二仙胶及其拆方对豚鼠软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白多糖合成的影响
目的:通过观察龟鹿二仙胶及其拆方对豚鼠软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的影响,探讨龟鹿二仙胶的配伍机制.方法:体外培养豚鼠膝关节软骨细胞,免疫组化染色检测龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响,Alcian Blue染色检测软骨细胞蛋白多糖合成.结果:龟鹿二仙胶促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达极显著(P＜0.01),龟板和鹿角均能显著提高Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达(P＜0.05),但药效显著低于龟鹿二仙胶(P＜0.05)；人参和枸杞对Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达均无明显促进作用.结论:龟鹿二仙胶可显著促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达,这是其保护软骨细胞,延缓软骨退变的作用机制之一.龟鹿二仙胶发挥此作用的主要药物是龟板和鹿角；人参和枸杞本身并不能促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达,而与龟板和鹿角配合,可明显增强龟板和鹿角的促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的作用.
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龟鹿二仙胶及其拆方对SD大鼠膝骨关节炎的影响
目的:通过观察龟鹿二仙胶及其拆方对SD大鼠膝关节软骨退变的影响,探讨龟鹿二仙胶的配伍机制.方法:切除SD大鼠双侧卵巢、双膝内侧副韧带和前交叉韧带、实验跑台跑步4周,制作退化膝骨关节炎模型.中药灌胃2、4、8周后放射免疫法检测血清雌二醇(E2)、免疫组化检测Bax、Bcl-2、白介素1β (IL-1β)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、Ⅱ型胶原(Collagen-Ⅱ)的表达.结果:8周时龟鹿参组可显著提高大鼠血清E2水平,龟鹿杞组可显著抑制Bax、促进Bcl-2表达,龟鹿参组可显著地抑制软骨细胞产生IL-1 β和MMP-13、提高Collagen-Ⅱ的表达,其效果均与龟鹿二仙胶作用相同.结论:龟鹿配伍人参可提高血清E2水平、抑制关节软骨产生炎症、促进软骨细胞Collagen-Ⅱ合成;龟鹿配伍枸杞可以抑制软骨细胞凋亡.
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独活寄生汤干预骨关节炎软骨细胞凋亡的机制
骨关节炎的病因病机不清,软骨退变是骨关节炎的主要病理改变,而细胞凋亡在软骨退变过程中发挥重要作用.线粒体凋亡、内质网应激性凋亡、细胞自噬在骨关节炎的发病过程中发挥重要的调控作用.目前,骨关节炎主要对症治疗为主,中医药在治疗骨关节炎有着独特的优势,独活寄生汤长期应用临床,效果良好,但作用机制及药效物质基础有待于深入研究,故文章从线粒体凋亡、内质网应激性凋亡、细胞自噬方面探讨独活寄生汤干预骨关节炎软骨细胞凋亡的可能作用机制.
