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维药买朱尼含药血清对IL-1β作用下大鼠软骨细胞MMP-13、Type-Ⅱ Collagen表达的影响
目的:观察维药买朱尼含药血清对IL-1β作用下体外培养的大鼠关节软骨细胞Type-Ⅱ Collagen、MMP-1、MMP-13表达的影响,并进一步探讨维药买朱尼防治OA的作用机制.方法:从1周龄SD大鼠关节软骨中分离培养原代软骨细胞,经鉴定后选用第二代细胞随机分为空白对照组、模型组、维药买朱尼组,培养第3d时模型组、维药买朱尼组采用细胞因子IL-1β(10ng/ml)继续培养,分别在培养后第24h、36h、48h采用Real Time PCR方法检测并分析各组软骨细胞中MMP-13、Type-Ⅱ Collagen的表达情况.结果:在第24h时各组MMP-13表达增加,Type-Ⅱ Collagen有一定降低,但无统计学差异；而在第36h和48h时空白对照组与模型组MMP-13、Type-Ⅱ Collagen表达差异均有统计学意义(P＜0.05),维药买朱尼组较模型组MMP-13与Type-ⅡCollagen的表达在48h、72h时间点有显著性差异(P＜0.05).结论:维药买朱尼可抑制IL-1β对Type-Ⅱ Collagen的降解和破坏作用,并能抑制IL-1β对MMP-13的诱导和激活作用.
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膝痛消方对膝关节软骨细胞凋亡和增殖的影响
目的:探讨膝痛消方对促进软骨细胞增殖和抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡的作用.方法:体外培养膝关节软骨细胞,用阿利新蓝染色方法检测软骨细胞蛋白多糖,用Ⅱ型胶原免疫荧光染色检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达,以鉴定软骨细胞;用MTS检测软骨细胞的增殖;用IL-1β 诱导软骨细胞凋亡,Annexin V/PI双染检测细胞凋亡.结果:膝关节剥离得到的细胞形态为多角形或梭形,阿利新蓝与Ⅱ型胶原免疫荧光染色均呈阳性,证明分离培养的细胞为软骨细胞.MTS实验结果发现膝痛消方提取物处理软骨细胞后检测到的OD值随浓度增加而增加且显著高于对照组.此外,IL-1β 处理诱导软骨细胞凋亡,而膝痛消方提取物能够有效地抑制IL-1β 引起的细胞凋亡.结论:膝痛消方能促进软骨细胞的增殖,抑制IL-1β 诱导的软骨细胞的凋亡.以上发现为膝痛消方临床上治疗膝关节骨性关节炎提供药理作用依据.
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补骨脂素对大鼠腰椎间盘软骨细胞炎性退变的影响
目的 探讨补骨脂素延缓椎间盘退变的内在机制.方法 体外分离1月龄雌性SD大鼠腰椎间盘软骨板,采用组织块法培养,通过HE染色、甲苯胺蓝染色和免疫荧光进行细胞辨别、鉴定.通过细胞增殖实验和RT-PCR法进行补骨脂素佳浓度筛选.取第3代生长状况良好的椎间盘软骨细胞,以每孔1×105的浓度将细胞置于6孔板内,分为空白对照组、白细胞介素-1β (IL-1β)诱导组(10 ng/ml)、补骨脂素组(IL-1β 10ng/ml+补骨脂素佳浓度),每组3孔,检测各组Ⅱ型胶原基因(Col2a1)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS-5)、IL-1β和环氧化酶-2(COX-2) mRNA的表达.结果 补骨脂素浓度在100、150、200、400 μM时,细胞活性较浓度为0时明显减弱(P＜0.01).补骨脂素在12.5、25 μM时较浓度为0时能上调Col2a1 mRNA表达(P＜0.05或P＜0.01).补骨脂素组Aggrecan mRNA高于空白对照组(P＜0.01);与IL-1β诱导组比较,补骨脂素组Col2a1 mRNA升高,ADAMTS-5 mRNA降低(P＜0.01).结论 补骨脂素可以一定程度缓解IL-1 β诱导的椎间盘软骨细胞的退变进程,并对IL-1β炎性信号通路的相关因子产生影响.
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透明质酸及其衍生物在骨组织应用中的研究进展
随着生物材料工程学不断发展，生物材料对骨科的发展起到非常重要的作用。由于透明质酸具有高度黏弹性、可塑性、超强的持水性、渗透性和良好的生物易吸收性等优势，同时改性的透明质酸不仅保持了原来的性能，还要完善它易降解、力学性能差等功能，使之更能适应人体，因此成为近生物材料研究的新热点。本文就透明质酸及其衍生物在软骨缺损、骨修复等方面的研究现状，包括细胞在透明质酸的生长、动物试验、临床进展等进行概括，并分析了存在的问题及今后的发展方向。
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猪软骨细胞老化过程中Aggrecan的表达及其糖链分子结构的改变
本实验旨在探讨体外培养软骨细胞在老化过程中,aggrecan的表达水平与分子结构的变化及其间的相互关系.取体外培养P1～P5各代猪耳软骨细胞,RT-PCR检测aggrecan球间区域(interglobular domain, IGD)mRNA的表达状况;阿利新兰(Alcian Blue)法检测糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)的含量和糖链的分子结构.结果显示aggrecan IGD mRNA的表达在P4、P5细胞内明显降低(P＜0.05);GAG的合成也在P4、P5时显著减少(P＜0.05),但这2项指标的变化趋势之间无显著相关性.而长链/高度硫酸化的GAG由P4软骨细胞开始,绝对含量和相对含量均显著减少(P＜0.01),其与aggrecan IGD mRNA的变化趋势有显著相关性(P＜0.01) .由此可见,体外培养软骨细胞中aggrecan的表达合成和细胞老化有密切关系.aggrecan IGD mRNA的表达降低与aggrecan中长链/高度硫酸化GAG的合成代谢过程受阻可能是影响老化细胞成软骨能力的重要因素之一.
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转染hIGF-1基因增强软骨细胞聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原的表达
目的探讨人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-1)基因对软骨细胞分泌聚集蛋白多糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原的影响.方法构建并鉴定携带hIGF-1基因的重组腺病毒(Ad/CMV-hIGF-1),采用1、10、100及500感染复数单位(multiplicity of infection,MOI)的Ad/CMV-hIGF-1转染软骨细胞,PBS为阴性对照,100μg/L hIGF-1生长因子为阳性对照,转染后4 d进行aggrecan、Ⅱ型胶原免疫组化,参照文献分析免疫组化阳性单位.结果在1～100MOI范围内,随着Ad/CMV-hIGF-1滴度增加,aggercan、Ⅱ型胶原表达递增,500 MOI Ad/CMV-hIGF-1转染后,aggrecan表达骤减;Ⅱ型胶原表达下降不明显.结论 hIGF-1基因对软骨细胞aggrecan、Ⅱ型胶原的表达有影响;100 MOI Ad/CMV-hIGF-1优于100 μg/L hIGF-1生长因子的作用.
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PDBu对大鼠生长板软骨细胞增殖和分化的影响
目的 探讨蛋白激酶C(PKC)对生长板软骨细胞增殖、细胞外基质合成和转录因子SOX9表达的影响.方法 分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(RGC),分别采用倒置显微镜、同位素掺入、RT-PCR和Western blot方法检测1、10和100 nmol/L的PKC激动剂PDBu对第一代无血清培养RGC的细胞形态、增殖、胶原和蛋白多糖的合成及COL2A1和AGGRECAN的转录及转录因子SOX9表达的影响.结果 100 nmol/L PDBu的处理,使无血清培养RGC的细胞形态接近于血清组(10% FBS);抑制增殖并促进胶原和蛋白多糖的合成,3H-TdR、3H-proline和35S-sulfate掺入量分别是无血清对照组的83%、152.6%和146.5%(P＜0.05);促进COL2A1和AGGRECAN的转录和SOX9的表达.结论 PKC的活化抑制了生长板软骨细胞增殖,促进其分化.
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慢病毒介导uPA-siRNA重组表达载体的构建及促进兔软骨细胞增殖
目的 构建筛选出靶向特异uPA-siRNA慢病毒表达载体,感染软骨细胞后观察其对软骨细胞增殖及代谢的影响.方法 根据siRNA原理设计、构建4对靶向兔uPA siRNA序列(P1、P2、P3和P4),用RT-PCR筛选出高效靶向的P2序列.各序列经慢病毒包装后,通过Lipofectamine 2000转染入兔软骨细胞后,用RT-PCR和Western blot法分别检测uPA-siRNA对细胞内uPA mRNA和蛋白表达水平的抑制效果,用CCK-8法检测uPA-siRNA对软骨细胞增殖的影响.结果 成功构建4对uPA-siRNA序列并筛选出用于后续实验的高效靶向P2序列,各序列经慢病毒载体包装并成功转染到原代软骨细胞中,在感染复数(MOl)为100时感染率达到85％以上.P1 、P2 、P3和P4均可抑制软骨细胞中uPA基因及蛋白的表达,但P2沉默效果好,基因抑制率达到70％,感染后软骨细胞的增殖受到促进.结论 成功构建高效靶向uPA-siRNA慢病毒载体,证实其可稳定转染软骨细胞并高效抑制uPA基因表达并促进软骨细胞增殖.
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SIRT1过表达可抑制衣霉素诱导软骨细胞内质网应激
目的 探究SIRT1对衣霉素诱导的软骨细胞内质网应激的影响.方法 分离人正常软骨细胞和骨关节炎(0A)软骨细胞,观察细胞形态,免疫细胞化学染色检测Ⅱ型胶原表达,Western blot检测SIRT1表达.将培养的软骨细胞分为对照组(OA软骨细胞、正常软骨细胞)、正常软骨细胞组(衣霉素组、SIRT1过表达组和衣霉素+SIRT1过表达组).24 h后,Western blot检测ERS相关蛋白(CHOP、p-eIF2α和ATF4等)、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax和caspase-3等)以及p-P38的表达.ELISA检测NF-κB活性.结果 与人正常软骨细胞相比,OA软骨细胞增殖缓慢,Ⅱ型胶原和SIRT1表达均显著降低(P＜0.05).与正常软骨细胞对照组相比,OA对照组和0.5 mg/L衣霉素组CHOP、p-eIF2α、ATF4和p-P38表达上调,NF-κB活性增加,Bcl-2表达明显下调,Bax和caspase-3表达明显增加(P＜0.05).SIRT1过表达处理则显著逆转上述蛋白表达.结论 SIRT1过表达可抑制衣霉素诱导的软骨细胞内质网应激和细胞凋亡,并下调P38/NF-κB活化.
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沉默FSTL1减少衣霉素诱导软骨细胞内质网应激及细胞凋亡
目的 探讨沉默卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)对衣霉素诱导软骨细胞内质网应激(ERS)及细胞凋亡的影响.方法 取兔膝关节软骨,收集并培养软骨细胞,将细胞分为对照组、衣霉素组、衣霉素+siRNA-FSTL1组和衣霉素+siRNA-NC组;MTT法检测细胞增殖;流式细胞计量术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞中FSTL1、Bcl-2和Bax mRNA含量;Western blot检测细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达.结果 与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖能力显著提高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05);细胞中FSTL1和Bax mRNA相对表达量均降低,而Bcl-2 mRNA相对表达量均升高(P<0.05);细胞中PERK和eIF2α蛋白相对表达量均升高,而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相对表达量均降低(P<0.05).结论 特异性沉默软骨细胞中FSTL1可有效减少ERS及细胞凋亡,其机制可能与抑制PERK信号通路有关.
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RNA干扰沉默BAX基因抑制大鼠软骨细胞凋亡及其可能机制
目的 研究RNA干扰沉默BAX基因表达对经线粒体途径大鼠软骨细胞凋亡的影响.方法 体外分离培养SD大鼠软骨细胞；BAX siRNA干扰沉默BAX基因表达.RT-PCR检测BAX mRNA；MTT法检测细胞活力；Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率；Western blot检测BAX、BCL-2、细胞色素C蛋白的表达.结果BAX siRNA干扰24h后,BAXmRNA表达为1.030±0.153,对照组为1.836±0.164；蛋白质的表达为0.359±0.089,对照组为0.766±0.082,实验组较对照组明显下调(P＜0.01).细胞凋亡受到明显抑制,对照组、model组、model+ BAXgiRNA组和model+ control siRNA组细胞凋亡率分别为2.87％、20.07％、9.21％和21.19％,并且在BAX基因沉默的细胞中,细胞色素C蛋白表达水平降低,同时BCL-2蛋白表达水平升高.结论RNA干扰沉默BAX基因可抑制大鼠软骨细胞凋亡并且促进其存活,其机制可能与线粒体途径相关.
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胰岛素样生长因子- I与透明质酸促人关节软骨细胞增殖的作用
为了探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和透明质酸(HA)联合培养对人关节软骨细胞增殖的影响,在人关节软骨细胞培养液中分别加入不同浓度的IGF-I、HA、IGF-I和 HA,用四氮甲基唑蓝(MTT)法及流式细胞术测定软骨细胞增殖活性的变化.结果显示,10μg/L浓度的IGF-I即可明显促进软骨细胞的增殖,IGF-I浓度为50μg/L时,其促增殖作用达大值;单独应用HA对软骨细胞的增殖无影响; IGF-I+HA组吸光度值为0.377,较IGF-I组增加10.7%;IGF-I组促增殖的高峰时间为72h,IGF-I+HA组的高峰时间为96h,培养96h后,IGF-I+HA组吸光度值0.389,细胞的增殖指数为28.79±1.24%,较对照组升高更明显.说明IGF-I具有促软骨细胞增殖作用,与HA联合培养促增殖能力更强,具有协同效应,并能延长促丝裂作用的时间.
关键词： 软骨细胞 胰岛素样生长因子-1 透明质酸 -
骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中miR130α的表达
目的 诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,初步探索miR130α在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的调控作用.方法 体外TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,免疫荧光法和免疫组化染色鉴定Ⅱ型胶原,阿辛兰染色鉴定氨基葡聚糖.用Real-time PCR法检测细胞miR130α的表达.结果 骨髓间充质干细胞在TGF-β1诱导下可分化为软骨细胞.培养7 d后,诱导培养组细胞miR130α表达的水平显著低于培养前的水平(P＜0.05).结论 骨髓间充质干细胞体外诱导可以分化为软骨细胞,在向软骨细胞分化的早期,miR130α表达降低伴随着软骨细胞的分化,提示与软骨形成的过程有关.
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维生素C对大鼠肋骨生长板软骨细胞增殖和胶原合成的影响
探讨不同浓度的维生素C(Ascorbic Acid, Asc)对培养大鼠肋生长板软骨细胞(rat costochondral growth plate chondrocyte, RGC)增殖和胶原合成的影响.分离、培养RGC,以组织化学和免疫组织化学的方法鉴定第2代RGC的表型;分别用3H-TdR和3H-Proline掺入法检测25、50和100 mg/L Asc对第2代RGC增殖和胶原合成的影响. 3种浓度的Asc均能促进RGC胶原合成(P＜0.05),25 mg/L和50 mg/L Asc的促胶原合成作用明显强于100 mg/L(P＜0.05);25 mg/L和50 mg/L的Asc促进RGC增殖(P＜0.05),100 mg/L的Asc抑制RGC的增殖(P＜0.05). 因此一定浓度的Asc具有促进RGC增殖和胶原合成的作用,25 mg/L～50 mg/L是较为合适的添加浓度.
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miR-140在软骨分化与骨关节炎的研究进展
骨关节炎(OA)是以关节软骨退行性变,关节内滑膜炎症以及周围关节和软骨下骨改变为特征的一种疾病.在OA组织中可观察到软骨细胞凋亡的分子特征,这表明软骨细胞的死亡在OA的发病机制中发挥关键作用.因此,对软骨分化的调控在延缓OA的发展中起到了至关重要的作用.miR-140在关节软骨中特异表达.越来越多的证据表明,miR-140通过抑制转录后水平的基因表达,在软骨细胞分化与OA中发挥重要分子作用.研究miR-140可为发现OA机制及治疗新靶点提供新的借鉴.
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炎性反应在骨关节炎软骨退变中的作用
慢性炎性反应是骨关节炎软骨破坏的一个主要原因.骨关节炎性环境下,软骨细胞异常活跃,细胞外基质重塑加快,引起软骨细胞生物力学环境的改变,进而推动病理进程.细胞外基质成分和结构的异常改变干扰骨髓间充质干细胞的成软骨分化,从而使软骨的修复无法进行.
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脊柱终板软骨组织蛋白质提取技术
软骨组织由少量软骨细胞和大量细胞外基质组成,绝大部分细胞外基质由胶原和糖蛋白构成,功能性蛋白含量较低,在对软骨组织进行蛋白质分析时,这些问题的存在会严重影响蛋白质电泳的进行.在以往的研究中,对于软骨组织蛋白质的提取通常采用细胞培养的方法,即通过细胞的传代、繁殖获取软骨细胞样本,然后提取细胞蛋白质.
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兔小肠黏膜下层与软骨细胞体外培养
目的 观察软骨细胞在兔小肠黏膜下层(SIS)上的生长特性,为使SIS作为软骨组织工程化的载体打下基础.方法 用物理和化学方法处理兔小肠黏膜下层,将不同浓度的兔软骨细胞与SIS进行体外共培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察.结果 经物理和化学处理的SIS纯度高、孔隙多,胶原纤维未受损;软骨细胞在SIS材料上生长、黏附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分.结论 SIS细胞相容性良好,不影响软骨细胞的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,是一种较理想的软骨细胞载体.
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间充质干细胞分化潜力与免疫调节的研究
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于成体间质组织中的一类多能干细胞群体,早是从骨髓组织中分离得到的,随后的研究发现从其他多种组织中也能分离得到,例如脂肪组织、脐带、胎盘等.它具有两个重要的生物学特征,即多能性和免疫调节能力.多年的研究显示,间充质干细胞在体外适当条件下可以大量扩增,并保持它向多种组织类型细胞分化的潜能,例如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞、以及神经组织细胞.对间充质干细胞免疫调节能力的研究显示,间充质干细胞可以对免疫系统的多种类型功能细胞的增殖、功能等产生影响,研究多的是对免疫系统的核心抗原提呈细胞树突状细胞和淋巴细胞产生影响.
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组织工程软骨研究进展
组织工程学是20世纪80年代末期发展起来的一门新兴边缘学科.它是综合应用工程学和生命科学的基本原理、理论和技术,在体外预先构建有生命的种植体,然后植入体内修复组织缺损,替代组织器官的一部分或全部功能.软骨为单一细胞(软骨细胞)构成组织,透明软骨、弹性软骨和纤维软骨组成人体重要结构,具有十分重要的生理功能.组织工程软骨是第一个组织工程化组织,在矫形外科和整形外科领域,组织工程软骨研究受到高度重视,发展迅速.本文介绍矫形外科领域中组织工程软骨研究发展.1 种子细胞
