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沉默FSTL1减少衣霉素诱导软骨细胞内质网应激及细胞凋亡
目的 探讨沉默卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)对衣霉素诱导软骨细胞内质网应激(ERS)及细胞凋亡的影响.方法 取兔膝关节软骨,收集并培养软骨细胞,将细胞分为对照组、衣霉素组、衣霉素+siRNA-FSTL1组和衣霉素+siRNA-NC组;MTT法检测细胞增殖;流式细胞计量术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞中FSTL1、Bcl-2和Bax mRNA含量;Western blot检测细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达.结果 与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖能力显著提高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05);细胞中FSTL1和Bax mRNA相对表达量均降低,而Bcl-2 mRNA相对表达量均升高(P<0.05);细胞中PERK和eIF2α蛋白相对表达量均升高,而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相对表达量均降低(P<0.05).结论 特异性沉默软骨细胞中FSTL1可有效减少ERS及细胞凋亡,其机制可能与抑制PERK信号通路有关.
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沉默RohA基因对涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2增殖和侵袭的影响
目的:探讨沉默RohA基因对涎腺腺样囊性癌(SACC)细胞株ACC-2增殖和侵袭的影响.方法:培养ACC-2细胞,分为siRNA-RhoA组、siRNA-对照序列组和空白对照组,实时荧光定量PCR技术检测细胞中Rho基因表达,Western blot法检测细胞中RohA蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力.结果:与siRNA-对照序列组和空白对照组比较,siRNA-RhoA组细胞中RohA mRNA和蛋白相对表达量均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与siRNA-对照序列组和空白对照组比较,siRNA-RhoA组细胞在24、48、72、96h时吸光度A值均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与siRNA-对照序列组和空白对照组比较,siR-NA-RhoA组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与siRNA-对照序列组和空白对照组比较,siRNA-RhoA组迁移细胞数和侵袭细胞数均减少,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:特异性沉默RohA基因表达可明显减弱ACC-2增殖能力,促进细胞凋亡,抑制细胞转移和侵袭能力.
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siRNA沉默PKM2抑制胶质瘤U87细胞的增殖和糖代谢能力
目的 探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默M2型丙酮酸激酶(PKM2)基因表达对人脑胶质瘤U87细胞增殖和代谢的影响.方法 合成PKM2 siRNA并转染胶质瘤U87细胞,靶向抑制PKM2表达;将未转染和转染无义siRNA的细胞分别作为空白组和阴性对照组.MTT法检测U87细胞增殖,葡萄糖和乳酸检测试剂盒检测培养基代谢物.结果 PKM2 siRNA能有效抑制U87细胞PKM2表达.下调PKM2表达后,细胞增殖能力受到明显抑制,同时葡萄糖消耗量和乳酸生成量也显著下降.结论 干扰PKM2表达可显著抑制胶质瘤的增殖和代谢能力,可作为胶质瘤治疗的潜在靶点.
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靶向沉默Gata3对妊娠期哮喘小鼠树突状细胞表型及效应T细胞失衡表达的影响
目的：研究慢病毒介导siRNA靶向沉默Gata3基因表达对妊娠哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞( DC )抗原递呈及其免疫生物学特性的影响。方法：以脂质体DNA沉淀法将重组慢病毒干扰质粒与包装质粒共转染AD293细胞,包装生成慢病毒感染体外诱导DC,RT-PCR、Western blot分析其对siGata3基因的整合转录效果；流式细胞术观察细胞表型变化。通过尾静脉注射将pSH1/siGata3转移至小鼠体内,ELISA法测定其肺泡灌洗液( BALF)中的炎性因子含量；MTT法验证混合淋巴细胞反应( MLR)后T细胞增殖能力。结果：经重组、包装携有Gata3特异siRNA慢病毒感染DC成功,其siRNA靶点Gata3 mRNA及蛋白的转录表达分别下调87.30%和81.33%( P<0.05)；同时降低DCs膜表面CD86荧光强度( P<0.05)。减少pSH1/siGata3组小鼠BALF中IL-5、IL-17分泌而提升IL-12水平( P<0.05)；MLR 证实,共培养感染 DC 激活 T 细胞的能力明显不足( P<0.05)。结论：siRNA干扰可有效抑制模型小鼠免疫微环境特定Gata3通路,阻遏T细胞及其亚群分化由此来诱导DC免疫耐受,为妊娠期哮喘防治奠定基础并提供新的思路和手段。
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间皮素基因沉默对胰腺癌化疗药物作用的影响
目的 研究胰腺癌特异性抗原间皮素基因沉默对胰腺癌化疗药物的影响.方法 以间皮素siRNA和荧光标记的siRNA分别通过脂质体瞬时转染入胰腺癌PANC-1细胞,流式细胞仪和倒置相差荧光显微镜检测转染效率,Western blot检测间皮索基因沉默的效果.以胰腺癌化疗药物吉西他滨、顺铂、阿霉素和葫芦素E分别处理间皮素基因沉默后的PANC-1细胞,继续培养48 h后,MTT法检测细胞增殖情况.结果 流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测结果证明细胞转染成功;Westem blot检测结果显示间皮素基因沉默后,间皮素蛋白基本无表达;MTT结果显示间皮素基因沉默后细胞增殖减少(P<0.05);间皮素基因沉默后,能增强化疗药物的作用.结论 间皮素基因沉默对胰腺癌化疗药物的作用具有增强作用.
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GPR56基因在骨肉瘤组织中的表达变化及其对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
目的 探讨G蛋白偶联受体56(GPR56)基因在骨肉瘤发生、发展中的作用.方法 选取拟行手术治疗的骨肉瘤患者53例,术中留取骨肉瘤组织及其癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测组织GPR56 mRNA相对表达量,并分析其与患者临床病理参数的关系.将对数生长期人骨肉瘤细胞株MG-63随机分为三组,其中siRNA-GPR56组转染GPR56干扰序列,siRNA-对照组转染siRNA对照序列,空白对照组不作任何处理.采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞GPR56 mRNA相对表达量,CCK-8法和克隆形成试验检测细胞增殖能力(分别以培养24、48、72、96 h的吸光度值及克隆形成率表示),Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力(以迁移、侵袭细胞数表示).结果 骨肉瘤组织GPR56 mRNA相对表达量为1.86±0.14,癌旁正常组织为1.39±0.12,二者比较P<0.01.骨肉瘤组织GPR56 mRNA相对表达量与患者年龄、性别、发病部位、肿瘤直径、组织类型、血清碱性磷酸酶水平均无关(P均>0.05),与Enneking分期、肺部转移、软组织浸润均有关(P均<0.05).siRNA-GPR56组GPR56 mRNA相对表达量明显低于siRNA-对照组及空白对照组(P均<0.01).siRNA-GPR56组培养48、72、96 h吸光度值及克隆形成率、迁移细胞数、侵袭细胞数均低于siRNA-对照组及空白对照组(P<0.05或<0.01).结论 骨肉瘤组织中GPR56基因表达升高,GPR56基因可能通过影响细胞增殖、迁移和侵袭能力而参与骨肉瘤的发生与发展.
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siRNA干扰沉默EZH2基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响
目的 探讨小分子RNA(siRNA)干扰沉默靶基因EZH2对人肝癌HepG2细胞增殖的影响.方法 取对数生长期的HepG2细胞,分为转染组、阴性对照组及空白对照组,转染组与阴性对照组按照Lipofectamine2000使用说明分别瞬时转染EZH2 siRNA、荧光物FAM,对照组不予任何干预.分别采用MTT法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期;qRealtime-PCR和Western blot方法检测EZH2 mRNA和蛋白表达.结果 与阴性对照组相比,转染组细胞增殖明显受抑；与阴性对照组及空白对照组比较,转染组细胞凋亡率明显升高,G0/G1期细胞明显增多,S期明显细胞减少；转染组EZH2 mRNA和蛋白表达明显下调,P均＜0.05.结论EZH2 siRNA可抑制人肝癌细胞增殖活性,是一种潜在基因治疗新方法.
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小分子RNA干扰磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基 α基因对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖和侵袭能力的影响
目的 探讨小分子RNA干扰磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基 α(PIK3CA)基因对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 培养人骨肉瘤Saos-2细胞,将细胞随机分为siRNA-PIK3CA组、siRNA对照组和空白对照组,siRNA-PIK3CA组细胞转染siRNA-PIK3CA序列,siRNA对照组细胞转染siRNA对照序列,空白对照组细胞正常培养,不作任何干预.实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞中PIK3CA mRNA表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测各组细胞中PIK3CA、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化-PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化-Akt(p-Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷酸化-mTOR(p-mTOR)蛋白表达.结果 siRNA-PIK3CA组细胞中PIK3CA mRNA和蛋白相对表达量均低于siRNA对照组和空白对照组(P<0.05);siRNA-PIK3CA组细胞转染后24、48、72、96 h增殖能力均低于siRNA对照组和空白对照组(P<0.05);siRNA-PIK3CA组细胞凋亡率高于siRNA对照组和空白对照组(P<0.05);siRNA-PIK3CA组迁移细胞数和侵袭细胞数均少于siRNA对照组和空白对照组(P<0.05);siRNA-PIK3CA组细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量均高于siRNA对照组和空白对照组(P<0.05),而p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量均低于siRNA对照组和空白对照组(P<0.05).siRNA对照组与空白对照组细胞中PIK3CA mRNA和蛋白相对表达量、细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数及PI3K、Akt、mTORp-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 下调PIK3CA基因可减少人骨肉瘤细胞增殖,抑制细胞迁移及侵袭能力,增加细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关.
关键词： 骨肉瘤 小分子RNA干扰 磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α 细胞增殖 细胞侵袭 -
小分子RNA干扰沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响
目的:探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响.方法:培养人舌癌细胞SCC-4,随机分为siRNA-Tiam1组、siRNA-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测不同转染组细胞中Tiam1基因和蛋白表达,MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,利用流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡情况,Transwell法检测不同转染组细胞迁移和侵袭能力.结果:siRNA-Tiam1组细胞中Tiam1基因和蛋白相对表达量均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P＜0.05);MTT实验结果显示,与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-Tiam1组细胞24 h、48 h、72 h和96h时A值均降低(P＜0.05);流式细胞检测结果显示,siRNA Tiam1组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组(P＜0.05);siRNA-Tiam1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于siRNA对照序列组和空白对照组(P＜0.05).结论:特异性沉默Tiam1基因可有效抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖能力,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力.
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沉默Nogo66基因对小胶质细胞激活诱导的帕金森病模型的作用
目的 应用小分子RNA干扰(siRNA)技术沉默PD模型中的勿动基因Nogo66,观察其对小胶质细胞激活诱导的PD模型的影响. 方法 SD乳鼠体外原代培养小胶质细胞,通过免疫组化检测小胶质细胞表面特异性标记物OX-42筛选出小胶质细胞并分成4组,分别为空白对照组、PD模型组,Nogo66 siRNA组及阴性对照组.空白对照组不做任何处理;PD模型组通过添加不同浓度(0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1μg/mL)LPS诱导小胶质细胞建立PD模型;Nogo66 siRNA组在建模的基础上通过RNA干扰技术沉默Nogo66基因;阴性对照组在建模的基础上转染随机顺序的siRNA.采用Western boltting、实时荧光定量PCR检测细胞中Nogo66蛋白及mRNA的表达,ELISA检测多巴胺的含量. 结果 成功筛选出小胶质细胞并诱导PD模型.Nogo66 siRNA转染组转染24h后,小胶质细胞Nogo66基因表达明显减少,与阴性对照组比较,Nogo66基因阻断效率达92.5％±6.8％;转染72 h后,Nogo66基因阻断效率为88.3％±6.2％,差异均有统计学意义(P＜0.05).Nogo66蛋白表达呈现出相同的变化趋势.Nogo66 siRNA转染组转染24h、72h后多巴胺表达均明显升高,与PD组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 Nogo66基因可能是PD治疗的靶向基因.
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小分子RNA干扰人端粒酶逆转录酶对脑胶质瘤T98G细胞株生物学行为的影响
目的 研究人端粒酶逆转录酶对胶质瘤细胞系体外生物学行为的影响,以期寻找控制胶质瘤细胞恶性行为的有效途径.方法 应用小分子RNA干扰技术抑制T98G胶质瘤细胞系中端粒酶逆转录酶的表达,用MTT法、TUNEL法、Transwell分别检测T98G胶质瘤细胞中人端粒酶逆转录酶被抑制后对细胞体外增殖能力、细胞凋亡、细胞侵袭、迁移能力等生物学行为的影响.结果 人端粒酶逆转录酶小分子RNA干扰片段能够有效抑制酶活性,抑制T98G胶质瘤细胞增殖(P＜0.05)、诱导细胞凋亡(P＜0.05)并抑制细胞的迁移与侵袭(P＜0.05).结论 通过抑制人端粒酶逆转录酶的活性能够有效抑制胶质瘤细胞的体外恶性生物学行为,促进细胞凋亡.
