结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法临床应用价值

目的 评价结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法的临床应用价值.方法 应用实时荧光PCR技术对420例标本进行临床试验研究,并与抗酸杆菌涂片和分枝杆菌培养方法对照比较.结果 结核分枝杆菌核酸检测灵敏度为48.5%(其中菌阳标本灵敏度为95.8%,菌阴标本灵敏度为14.5%),特异度99.3%,阳性预测值为99.1%,阴性预测值为55.5%;临床试验388例痰标本中检测出1例非结核分枝杆菌核酸阳性,经测序确认,准确率100%;同时对32例非结核分枝杆菌临床分离株进行核酸检测,并经测序确认,准确率100%.结论 应用实时荧光PCR技术,能实现在1支管内同时进行结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌的核酸检测.该方法具有简单快速、特异性好污染性少的特点.可作为实验室辅助检测结核/非结核分枝杆菌核酸方法之一.

结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂临床试验研究要点解析

结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂具有提高痰涂片阴性肺结核的检出率及肺结核诊断的特异度的优点,并可相对快速地鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌.结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂在临床试验中应注意临床试验机构、对比试剂、样本等的选择,以及样本前处理方法和核酸提取方法的临床验证等问题.作者将主要对该类试剂在临床试验中的上述重点问题进行阐述.

核酸类保健食品申报与审评规定(试行)

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸载量的测量不确定度构成分析

目的 研究实时荧光定量PCR用于HBV核酸载量检测时的测量不确定度构成.方法 采用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清标本中HBV核酸载量,收集检测过程中的各类数据,计算以下6种来源的测量不确定度,对该方法的测量不确定度构成进行评估.(1)标本浓缩的不确定度(uenrich);(2)核酸提取的不确定度(uex);(3)扩增反应体系的不确定度(upcr);(4)热循环仪的不确定度(uins);(5)数据处理的不确定度(uana);(6)加样枪的不确定度(upip).其中热循环仪的不确定度检测样本数为7份,其他各种不确定度检测的样本数为10份.结果 核酸浓度为5.610E+07拷贝/ml的标本,其浓缩过程来源的相对不确定度达0.437核酸提取来源的浓度真值无偏估计在6.585E+03、9.067E+04、7.223E+06拷贝/ml样本的相对不确定度分别为0.249、0.173、0.140;热循环仪和数据分析来源的相对不确定度分别为0.020和不大于0.050.结论 标本制备过程中的浓缩和DNA提取步骤所带来的不确定度是实时荧光定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的主要分量,因此标本制备处理的方法与标准操作程序能否有效地提取核酸并去除PCR反应的抑制物对于该项检测十分关键;起始模板浓度与测量不确定度相关,低浓度的样本显示出更大的相对不确定度.

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和丙型肝炎病毒核酸联合检测试剂的评价

目的了解人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)和丙型肝炎病毒(HCV)核酸联合检测试剂检测的敏感性、特异性以及检测中国不同亚型样品的适应性.方法用酶联免疫试剂对来自于不同地区的HIV感染者或可疑感染者献血员样品进行HIV抗体和HCV抗体检测,对HIV抗体阳性者进行抗体确证.用HIV-1和HCV核酸联合检测试剂对样品进行检测,对初次检测阳性者,用HIV RNA和HCV RNA鉴别试剂单独检测,区分是HIV RNA阳性或是HCV RNA阳性.结果74份HIV和HCV抗体均阳性的样品,HIV/HCV RNA检测也为阳性,5份HIV和HCV抗体均阴性的样品,HIV/HCV RNA检测也为阴性;84份HIV抗体确证为阳性的样品,有82份检测为HIV RNA阳性,7份HIV抗体阴性的样品检测均为HIV RNA阴性,12份HIV抗体不确定的样品,有6份检测为HIV RNA阳性;81份HCV抗体阳性样品中有70份检测为HCV RNA阳性,22份HCV抗体阴性样品中有18份检测为HCV RNA阴性,4份检测为HCV RNA阳性.结论该试剂的灵敏度较高,尤其在HCV抗体阴性样品中检出HCVRNA阳性者.因此,可用于献血员筛查,减少窗口期的传播.

应用简便逆转录环介导等温扩增方法检测麻疹病毒核酸

目的 应用简便快速的核酸检测新方法--逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)检测麻疹病毒核酸,并与巢式逆转录多聚酶链式反应(nest-RT-PCR)方法进行比较.方法 比较RT-LAMP方法与nest-RT-PCR方法对吉林省历年麻疹病毒分离株以及临床疑似麻疹咽试子中麻疹病毒核酸检测的检出率.结果 两种方法对23株麻疹分离株麻疹病毒核酸阳性检出率均达到100%.针对18份麻疹病毒分离阴性的临床疑似麻疹咽试子分别利用RT-LAMP和巢式RT-PCR两种方法进行麻疹核酸检测,RT-LAMP方法阳性率为56.52%,巢式RT-PCR方法阳性率为47.83%.结论 RT-LAMP方法比巢式nest-RT-PCR方法更敏感.

2012年发现的新冠状病毒分子检测方法的建立与探针优化

目的 建立2012年确定的新冠状病毒的分子检测方法,并筛选优化引物与探针.方法 依据先发表的208 bp长的新冠状病毒1b片段核酸序列,比对分析后设计合成常规RT-PCR引物1对及荧光定量RT-PCR引物1对与TaqMan探针2条(TZ1,TZ2),同时合成锁核酸修饰的TaqMan探针2条(LNA-TZ1,LNA-TZ2).建立检测新冠状病毒感染的常规RT-PCR方法与4种荧光定量RT-PCR,分析比较其灵敏度与特异性,同时参照欧洲发表的2种荧光定量RT-PCR引物与探针对(upE,ORF1b)建立相应方法,以合成的阳性模板比较6对荧光定量RT-PCR引物与探针的检出灵敏度.结果 所合成的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR引物与探针皆有较好特异性,不能扩增其他人冠状病毒模板及常见呼吸道病毒模板,检出下限达50 ～ 500拷贝/反应.锁核酸修饰TaqMan探针可改善荧光定量PCR检测方法的反应性能,经锁核酸修饰的TaqMan探针与常规TaqMan探针相比,检出率提高10倍左右,其中LNA-TZ1与upE探针对具佳反应性能.结论 本研究所建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR可用于新冠状病毒的分子检测,并推荐使用LNA-TZ1与upE探针对.本研究为新冠状病毒分子检测方法应用与改进奠定了基础.

单检及16份混样检测模式对献血者核酸检测效果的比较研究

目的 探讨单份及16份混合标本2种检测模式对献血者血液病毒核酸检测(nucleic acid test,NAT)效果的影响.方法 2009年2至6月顺序留取北京无偿献血者标本,用诺华Procleix ULTRIO Assay进行单份(ID)或16份混合标本(P16)乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒-1( HIV-1)三项联合核酸检测.单份NAT反应性同时HBsAg、抗-HCV或抗-HIV血清学不合格的标本,血清学合格的单份NAT反应性经双孔NAT复检阳性的标本,以及混合NAT反应性/拆分NAT为阳性的标本,进一步用诺华Procleix HBV、HCV和HIV-1鉴别试剂进行鉴别试验.血清学合格、HBV NAT单独阳性标本进一步用Roche HBV定量实验加以验证和进行病毒含量测定、血清学分析、并进行稀释以模拟是否能被P16-NAT检出.阳性检出率进行四格表连续校正的x2检验.结果 (1)在7613份单份NAT (ID-NAT)标本中,检出NAT阳性26份,ID-NAT阳性率0.34％(26/7613)；(2)在16 064份共1004份P16混合标本NAT(P16-NAT)中,检出NAT阳性27份,P16-NAT阳性率为0.17％ (27/16 064)；(3)在血清学合格标本中,单份检测的NAT单独阳性检出率为0.12％ (9/7438),高于16份混样检测的NAT单独阳性检出率0.01％ (2/15 750)(x2=11.880,P＜0.05).9份ID-NAT及2份P16-NAT单独阳性标本经鉴别均为HBV NAT阳性,未检出 HCV NAT单独阳性或HIV NAT单独阳性；(4)9份ID-NAT HBV单独阳性血样模拟P16-NAT,仅有2份可被检出；(5)对8份ID-NAT及2份P16-NAT单独阳性标本进行Roche HBV定量测定,均可确证其核酸检测结果,但病毒含量很低.其中2份HBV病毒含量为472 IU/ml及15 IU/ml,6份含量＜12 IU/ml,另2份原倍不能定量经10倍浓缩处理后测得含量为＜ 12 IU/ml和14.3 IU/ml;(6)11份HBV NAT单独阳性标本中,3份(27.3％)为潜在的窗口期感染,其余8份(72.7％)抗-HBc阳性或抗-HBe阳性,但抗-HBc-IgM均为阴性,为隐匿性感染；(7) P16-NAT初检呈反应性需要进行拆分试验的混合样本比率为2.49％ (25/1004),其中由血清学合格标本所致初检反应性的混合样本比率为0.20％ (2/1004).结论 ID-NAT单独阳性检出率高于P16-NAT单独阳性检出率.为避免低病毒含量HBV的漏检,应选用灵敏度高的核酸检测试剂,并尽量采用小标本量混合检测,甚至采用单份检测方式.

核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价

目的对不同核酸提取方法在荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)含量中应用进行评价,为临床方法学选择和实验结果的评价提供理论依据.方法选用直接煮沸裂解法、NP-40煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法、磁珠核酸提取法等4种核酸提取方法提取乙型肝炎血清标本和含不同含量肝素的血清标本中HBV DNA模板,用荧光实时定量PCR法对其进行准确定量,从提取效率、抗干扰能力方面进行评价.结果 4种核酸提取方法中磁珠核酸提取法提取效率为高, 对数换算后,以此相对提取效率为100%,则直接煮沸裂解法为低81%(P<0.05)、NP-40煮沸裂解法为95%(P>0.05)、沉淀煮沸裂解法为88.7%(P<0.05);从抗干扰能力方面,当肝素含量为500 U/ml时,磁珠核酸提取法抗干扰能力强,沉淀煮沸裂解法次之、直接煮沸裂解法和NP-40煮沸裂解法为差,其HBV DNA含量抑制率分别为9.4%、13.5%、35.4%、52.7%.结论本实验结果认为磁珠核酸提取法为实验室首选的核酸提取方法.

微流控芯片技术的研究进展与应用展望

微流控芯片具有的精确流体控制、少量样品需求、快速反应及大规模集成的优势,使其成为临床诊断及疾病筛查的极具发展潜力的工具.集成化及自动化的微流控芯片系统目前已广泛用于核酸、蛋白及细胞等的检测及分析.近年来微流控芯片在核酸、蛋白质分析及细胞培养、分选及药物筛选等方面开展应用研究.微流控芯片可为生物标志物检测提供精确、高通量、易集成的研究及应用平台.

肿瘤标志物的临床应用与研究进展

恶性肿瘤严重威胁人类健康，提高恶性肿瘤的早期诊断水平，可有效降低其病死率、改善预后。肿瘤标志物的合理应用评价及高效诊断肿瘤的标志物筛选研究仍然是目前面临的重点和难点。各种技术平台特别是新一代测序技术及相关转化医学的发展与应用，肿瘤标志物研究在蛋白质、DNA和RNA水平等均取得了迅速进展。相信随着对肿瘤发生发展基础研究的不断深入，以及临床确证技术的进步，通过前瞻性多中心研究进行科学合理地评价，制定适用于我国人群不同肿瘤的肿瘤标志物诊断策略必将成为可能。（中华检验医学杂志，2014，37：641-644）

临床实验室建立TORCH检验程序的重要性

TORCH检验包括弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他相关病毒等的血清学和核酸检验,是妊娠期感染、器官移植和重症患者检测的重要指标,建立一个合理的检验程序和对结果作出恰当的解释,对于正确应用TORCH检验项目有莺要意义.

脑脊液核酸检测的研究进展

脑脊液(CSF)是与中枢神经系统关系为密切的体液.与其他样本相比,CSF的成分能够直接反映中枢神经系统(CNS)的病变.CSF病原体核酸检测对CNS感染的诊断效果明显优于传统的检测方法.CSF中循环肿瘤DNA(ctDNA)非常有希望成为原发性脑肿瘤和转移性脑肿瘤的诊断和监测标志物.

核酸检测 POCT 应用的现状与发展

POCT 因为其简单、快速，逐渐被临床医生和患者认可和接受，但目前的POCT产品和检测方法主要是基于免疫学反应和生化反应，检测蛋白质和小分子化合物（如毒品）为主的生物标志物。近年来，核酸POCT技术和方法得到了实质性进展，已经有成熟的产品。本文简单介绍几种国外常见的、相对成熟的、已经开发出应用产品的技术及其应用。 POCT检测核酸作为一个新的应用方向，值得关注。

HIV集合核酸检测在男男性行为人群中的应用评价

目的 评估集合核酸检测方法在男男性行为人群(MSM)中的应用,探索适合该人群的HIV早期感染检测策略及应用该方法估算新发感染率的可行性.方法 本研究共采集4 856份2008年4月至2009 年9月我国黑龙江省(4 156份样品)和北京市(700份样品)MSM人群的样品.分别经三代ELISA、四代ELISA和WB检测后,HIV阴性样品进行集合核酸检测.样品集合采用三级集合策略.并计算和比较"三代ELISA检测+WB"、"四代ELISA检测+WB"、"三代ELISA检测+WB+集合核酸检测"和"四代ELISA检测+WB+集合核酸检测"的HIV检测阳性率.4 156份黑龙江省MSM人群样品中符合条件的WB确认阳性样品纳入BED-捕获酶联试验 (BED-CEIA),并应用BED方法和集合核酸检测方法进行新发感染率估算.结果 4 856份样品中共有143份被判定为HIV阳性,其中经三代和四代ELISA检测为阳性的样品均为130份,窗口期感染样品13份.常规ELISA检测加核酸检测能有效检测出MSM人群窗口期感染者;4种检测策略的HIV检测阳性率分别为:2.68%(95%CI 为2.22%～3.14%)、2.82%(95%CI 为2.35%～3.29%)、2.94%(95%CI 为2.46%～3.42%)和2.94%(95%CI 为2.46%～3.42%),差异无统计学意义(χ2=0.854 3,P=0.836 4).4 156份黑龙江省样品中有88份纳入BED检测,41份样品被判为新近感染.应用BED检测方法和集合核酸检测方法估算的HIV发病率分别为2.36%(95%CI 为1.63%～3.08%)和2.92%(95%CI 为1.01%～4.83%).结论 HIV集合核酸检测技术能有效地筛查出窗口期感染者,可用于我国MSM人群窗口期检测.

慢性乙型肝炎抗病毒治疗的进展

慢性乙型肝炎是世界上常见的传染病之一,据统计全世界有3.5亿人患此病,慢性乙型肝炎易发生肝硬变及肝癌,预后极差.抗病毒药物直接作用于病毒复制的不同环节上,抑制其复制,以致消除感染.目前抗病毒药物包括两类:一是干扰素类,天然的或基因重组的α或β干扰素.另一类是核酸类似物如:阿糖腺苷Famciclovir, Lamivudine等.慢性乙型肝炎联合治疗有两种联合方案:一是不同抗病毒药物联合,一是与免疫调节药物联合.对这些治疗方法的评价值得注意及研究.近年来 Lamivudine在我国临床应用,取得了良好的开端,单用Lamivudine治疗或联合治疗的持久疗效如何是令人感兴趣的.

RON基因反义核酸真核表达载体的构建及其对A549的体外作用

目的肺癌的发生是多因素作用的结果,RON基因参与其中,但它在肺癌的基因治疗中意义尚不明确.本研究旨在探讨RON能否作为肺癌的基因治疗靶点及针对该基因跨膜区段(RONm)反义核酸对肺癌细胞的生物学功能的影响.方法从人肺鳞癌细胞提取总RNA进行RT-PCR、T载体克隆和测序,获得RON基因的跨膜区段,并将其反向插入真核表达载体中,转染肺癌细胞,利用ELISA检测细胞模型RON基因表达后的蛋白水平,同时利用MTT和细胞记数方法监测细胞的生物学活性的变化.结果用RT-PCR亚克隆RONm,测序结果与GenBank(X70040)一致.构建的RONm反义真核表达载体,转染后的肺癌细胞株A549 RON基因表达量和细胞活性明显降低.结论成功构建RONm反义核酸真核表达载体,RON能作为肺癌的基因治疗靶点;RONm反义核酸可有效抑制RON基因的表达阳性肺癌细胞的生长,为进一步研究将RONm反义核酸作为一种的肺癌基因治疗方法打下了分子生物学基础.

环氧合酶-2反义核酸抑制胃癌细胞的恶性表型

目的通过环氧合酶-2(COX-2)反义核酸基因转染,逆转COX-2高表达的人胃癌细胞系中其表达水平,观察细胞生物学行为的变化情况,以初步探讨COX-2表达在胃癌发生中的某些具体机制.方法使用脂质体介导的方法,用反义重组质粒及空载体分别转染COX-2异常高表达的人胃癌细胞系SGC 7901(转染细胞分别命名为7901-AS及7901-P细胞).通过免疫细胞化学及RNA斑点杂交试验检测反义核酸转染的细胞中COX-2的蛋白及mRNA表达水平.四唑盐(MTT)比色试验检测转染细胞的体外增殖速度.应用裸鼠成瘤试验比较转染前后细胞体内成瘤能力的差别.结果免疫细胞化学及RNA斑点杂交试验证实:在反义核酸转染的7901-AS细胞中COX-2的蛋白及mRNA水平均显著下调.MTT比色试验显示7901-AS细胞的增殖速度低于亲本SGC 7901细胞.裸鼠成瘤试验表明,反义核酸转染细胞成瘤潜伏期延长,成瘤体积减小.3组细胞接种裸鼠30d后,瘤体的平均重量(±s)分别为(826.67±77.67) mg(SGC 7901细胞),(776.67±300.06) mg(7901-P细胞)和(486.67±15.28) mg (7901-AS细胞).转染反义核酸的细胞成瘤性显著低于未转染细胞及转染载体对照细胞(P＜0.01).结论胃癌细胞中过表达的COX-2与细胞的恶性表型相关.用反义技术抑制COX-2的表达可以逆转胃癌细胞的恶性表型.

炎症性肠病中cGAS-cGAMP-STING识别病原体DNA的研究进展

生物体对病原微生物核酸(包括DNA与RNA)的识别是启动宿主免疫应答的重要途径.炎症性肠病中,机体对病原体核酸的识别异常是其病因与特征之一.近年来,针对RNA的识别机制以及相关分子学基础已愈加深入,而关于DNA如何激活胞内DNA受体并调控抗原提呈细胞的功能,进而介导黏膜免疫应答却罕有研究.本综述将首先介绍肠道树突状细胞的亚群与功能,探讨树突状细胞利用cGAS-cGAMP-STING识别外源性DNA的机制,进而鉴别炎症性肠病中与DNA识别异常高度相关的易感基因.

环氧合酶-2反义核酸对膀胱癌细胞恶性表型的抑制作用

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)反义核酸对膀胱癌细胞恶性表型的抑制作用.方法采用脂质体介导方法,分别构建转染COX-2反义真核表达载体和空载体的膀胱癌细胞系5637-AS细胞和5637-P细胞,RT-PCR及Western blot分析转染细胞COX-2 mRNA及蛋白表达水平.MTT比色实验、Boyden侵袭小室法和裸鼠成瘤实验分别检测转染细胞体外增殖速度、体外侵袭力和体内成瘤性.结果RT-PCR结果显示,5637-AS细胞COX-2/磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA比值(0.65)明显低于5637(0.92)和5637-P细胞(0.90);Western blot提示5637-AS细胞COX-2/β-actin比值(0.29)明显低于5637细胞(0.46)和5637-P细胞(0.44).MTT比色实验显示5637-AS细胞较5637-P、5637细胞生长速度减慢,三者倍增时间分别为3.6 d、2.9 d和2.9 d.体外侵袭实验结果表明,5637-AS侵袭细胞数显著低于5637细胞及5637-P细胞(18.20±5.97比45.40±8.12,18.20±5.97比44.10±6.47,P＜0.01).裸鼠成瘤实验中,5637-P、5637细胞接种裸鼠后第5天肿瘤长出,而5637-AS细胞第7天肿瘤长出;30 d后5637-AS细胞接种组瘤体重量(392.15 mg±33.58 mg)明显小于5637细胞(738.26 mg±66.32 mg),和5637-P细胞接种组(698.53 mg±88.76 mg),P＜0.01.结论膀胱癌细胞中COX-2过表达与细胞的恶性表型相关,反义技术抑制COX-2表达可以逆转膀胱癌细胞的恶性表型.