17β-雌二醇对人的类成骨细胞HOS TE85胞内游离钙、IP3及钙调蛋白影响

目的观察17-β雌二醇(E2)对成骨细胞胞内游离钙([Ca2+]i)、1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)含量及钙调蛋白(CaM)含量的影响.方法以Fluo-3/AM为钙荧光指示剂,采用激光共聚焦显微系统测定细胞内钙荧光值的改变,以反映[Ca2+]i含量的变化.用阳离子交换法测定IP3含量.以测定钙依赖的磷酸二酯酶活性方法测定CaM含量.结果给予0.1、1.0 nmol/L E2后50 s胞内钙荧光值分别增加4.7和6.1倍,持续80～160 s;以100 nmol/L thapsigargin预处理细胞,E2仅使胞内钙荧光值升高1.5倍.加入1.0 nmol/L E2,IP3含量在给药后20～30 s和60～70 s呈双峰升高.同样剂量的E2可使CaM含量增加85.2%.他莫西芬不能阻断E2引起的胞内钙荧光值、IP3及CaM含量升高的作用,而磷脂酶C抑制剂使E2的作用部分或完全抑制.结论E2作用于胞膜引起胞外钙内流,并通过IP3导致[Ca2+]i进一步增加,激活CaM从而调节细胞功能.

卡前列甲酯合并酪氨酰肼对小鼠的抗早孕作用

目的观察卡前列甲酯(PG05)合并酪氨酰肼对小鼠抗早孕作用.方法小鼠于妊娠第7～9天给药,观察妊娠率;用放射免疫法测定血清孕酮水平.结果小鼠口服90 mg/kg酪氨酰肼(3 d)能显著增强皮下注射0.2 mg/kg PG05(2 d)的抗早孕作用,并协同PG05降低孕小鼠血清孕酮的水平.30 μg/ml酪氨酰肼对大鼠黄体细胞3β-HSD的活性有明显的抑制作用.口服150 mg/kg酪氨酰肼(3 d)对假孕大鼠子宫孕激素受体数目无显著影响.结论酪氨酰肼抑制体内孕酮的生成可能是其协同PG05抗早孕作用的主要机制.

脊髓髓内肿瘤的鉴别诊断与手术时机

目的探讨各种脊髓髓内肿瘤的临床和影像学的鉴别诊断,选择合理的手术时机.方法以运动功能障碍分级,对经显微外科手术及病理证实的147例(160个肿瘤)髓内肿瘤进行统计学分析,并比较它们的影像学表现.结果主要的脊髓髓内肿瘤的临床表现无明显不同,而其影像学上各有其特点.无运动功能障碍组的肿瘤明显小于发生运动功能障碍组.手术前、后运动功能障碍的分级呈线性正相关.结论磁共振影像(特别是对比剂强化后的)能对大多数室管膜瘤、星形细胞瘤和血管网状细胞瘤加以鉴别.及时地微创性的显微手术切除肿瘤,可以获得满意疗效.

甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实验研究

目的采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗.方法将2.2 kb的重组人甲胎蛋白(AFP)基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的上游,构建逆转录病毒载体LX2.2CD.再以此载体和另一不含AFP基因调控元件的逆转录病毒载体pCD2分别转染3种肝癌细胞系和1种肺腺癌细胞系,筛选出整合CD基因的抗G418克隆,并进行细胞生长抑制实验.结果5氟胞嘧啶(5FC)对用LX2.2CD转染的AFP阳性肝癌细胞具有特异杀伤作用,而对AFP阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无杀伤作用.结论在细胞水平实现了对AFP阳性肝癌细胞的靶向性基因治疗.

河豚鱼基因组格式化粘粒文库的构建

目的构建河豚鱼基因组文库,为人类基因组的研究提供资料.方法以红鳍东方豚的精子DNA为材料,采用含有“外显子捕获”元件的粘粒(sCOGH2)作为载体,构建河豚鱼的基因组粘粒文库.结果该文库共有57 600个克隆,分别被保存在600块96孔细胞培养板中,插入片段的大小平均为35kb,相当于5.0个库容量,即从本文库中筛选到河豚鱼基因组任一单拷贝序列的机率为99.2%.该文库能承受10次以上的反复冻融,重组粘粒克隆在传代中仍保持高稳定性.以河豚鱼基因组DNA为探针进行Southern印迹分析,结果显示出强阳性的杂交信号.结论该文库符合粘粒文库的质量要求.

入hsp90p基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系.方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Jurkat细胞内的活性和非活性染色质,然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人hsp90β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Northern印迹杂交的方法研究热休克诱导下的hsp90β mRNA表达.结果发现热休克诱导使细胞内人hsp90β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的hsp90βmRNA表达水平一致.结论首次证实人hsp90β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控,为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型.

化疗药物不同配伍诱导人胰腺癌细胞株细胞凋亡

目的通过对临床常用化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、丝裂霉毒(MMC)、卡铂(CBP)、阿霉素(ADM)和表阿霉素(E-ADM)相互配伍诱导人胰腺癌细胞株细胞凋亡的观察,探讨化疗药物抑制胰腺癌细胞生长的作用机制,为临床制定合理的化疗方案提供理论依据.方法不同配伍的化疗药物作用于胰腺癌细胞后,以倒置显微镜和荧光显微镜观察其形态变化;以流式细胞仪检测细胞DNA含量的变化,计算出凋亡细胞的比例;提取细胞DNA,进行凝胶电泳确定细胞凋亡的发生.结果联合化疗可以诱导胰腺癌细胞凋亡,与引起细胞坏死相比,诱导肿瘤细胞凋亡的化疗药物剂量小、作用时间短;随作用时间的延长和药物剂量的增加,凋亡细胞的比例也增加;不同配伍的化疗药物诱导不同胰腺癌细胞株细胞发生凋亡的情况是不完全相同的.结论诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物抑制胰腺癌细胞生长的主要机制,能否诱导胰腺癌细胞发生凋亡可作为判断不同配伍的化疗药物抑制胰腺癌细胞生长能力的重要指标之一.

小鼠红细胞分化相关因子cDNA片段的克隆与分析

目的克隆与小鼠红细胞终末分化相关因子的基因,并对其表达特性进行分析.方法用致贫血Friend病毒(FVA)诱导BALB/c小鼠脾脏产生大量FVA原红细胞,后者经分离纯化并在促红细胞生成素作用下进行体外培养.采用减除杂交与PCR相结合的方法,用未经培养的FVA诱导的原红细胞(0 h FVA原红细胞)的cDNA对培养36 h的FVA诱导的成红细胞(36 h FVA成红细胞)的cDNA进行多次减除杂交和PCR扩增,构建上述36 h cDNA的质粒减除文库并进行差异筛选.对阳性克隆进行核苷酸序列测定及Northern印迹分析.结果获得1个472 bp的cDNA片段,其中含有1个309 bp的开放阅读框架,编码102个氨基酸.经GenBank进行同源比较,未发现同源序列,已被GenBank接受,(编号AA¨4369).Northern印迹分析表明,该cDNA在培养36 h的FVA中、晚幼红细胞中呈差异表达,其mRNA全长约为500～600bp左右.将其暂命名为小鼠红细胞分化相关因子(MEDRF)基因.结论 MEDRF基因在红细胞分化的中、晚幼阶段特异表达,表明MEDRF是一个新的与红细胞终末分化相关的因子.

入免疫缺陷病毒1型蛋白酶抑制剂的微生物筛选模型的建立

目的采用基因工程方法,建立人免疫缺陷病毒1型蛋白酶(HIV-1 PR)的微生物检测法.用以筛选抗HIV PR抑制剂.方法合成编码HIV-1 PR识别序列24 bp低聚核苷酸片段,并将其插入质粒pBR322四环素耐药基因tetr,经亚克隆构建含突变之四环素耐药基因mtett的pACYC184M.以后者转染含HIV-1 PR表达载体(pPOLO)的大肠杆菌,构建能同时表达四环素耐药蛋白及HIV-1 PR之工程菌(TLV331).结果在选择培养基内,TLV331生长受HIV-1 PR控制,HIV-1 PR表达时可破坏TLV331四环素抗性;HIV-1 PR活性受到抑制时,其四环素抗性则恢复.此特性经HIV-1 PR的已知抑制剂验证并以该法对31个化学合成样品进行筛选.结论通过基因工程方法建立了HIV-1 PR的微生物检测法,该法可作为抗HIV PR抑制剂之初筛模型.

ICAM-1在缺氧-再氧化引起的白细胞内皮细胞粘附中的作用

目的探讨细胞间粘附分子(ICAM-1是否介导缺氧-再氧化引起的中性粒细胞(PMN)和血管内皮细胞(VEC)的粘附反应.方法血管内皮细胞(VEC)经缺氧再氧化(H/R)处理后,加入PMN,用计数法检测粘附率,以细胞免疫化学及原位杂交法检测ICAM-1及ICAM-1 mRNA表达.结果VEC经H/R处理后,PMN与其粘附率增高1倍(P＜0.01),ICAM-1单克隆抗体(mAb)与CD11a/CD18 mAb可明显降低粘附率的增高,H/R能增加VEC的ICAM-1及ICAM-1 mRNA表达.结论ICAM-1介导H/R后的PMN-VEC间粘附反应.

早发冠心病患者甲烯四氢叶酸还原酶基因的C677T多态性研究

目的探讨同型半胱氨酸代谢过程的关键酶之一——甲烯四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与早发冠心病发病的关系.方法采用限制性内切酶片段长度多态性方法检测患者的MTHFR基因C677T位碱基突变.结果67例患者中T纯合基因型占34.3%(23/67)、杂合基因型占43.3%(29/67),C纯合基因型占22.4%(15/67);T等位基因频率为55.9%(75/134),C等位基因频率为44.1%(59/134);与正常对照组比较,差异均有显著性意义(P＜0.05).结论MTHFR基因C677T点突变可能是中国人早发冠心病发病的危险因素之一.

女性下生殖道癌与人乳头瘤病毒类型相关性分析

为进一步探讨不同类型人乳头瘤病毒(HPV)与下生殖道癌的不同组织学类型的相关性,本研究采用病理检查和多聚酶链反应(PCR)技术,对54例宫颈癌和33例外阴鳞癌标本的HPV感染情况与临床病理特征之间的关系进行研究.

人维甲酸受体RAR α基因在大肠杆菌中的表达

采用T7RNA启动子将RAR α cDNA定向亚克隆至PT7-7质粒,构建了重组维甲酸受体RAR α表达质粒PT7-RAR α并在大肠杆菌中得到稳定表达. 方法(1)载体构建:将PT7-7,RAR α分别用EcoR I酶切后,电泳回收1.9 kbRARα并与PT7-7相连接,酶切筛选出正向连接子(PT7-7-RAR α+);用Bal I酶切PT7-7～RAR α(MSC I为同裂酶),在其两端加上Nde I连接子;纯化后用Nde I酶切并使其自连接.(2)DNA序列分析:用PE公司生产的DyeTerminater TM测序试剂盒,以T7启动子通用引物对RAR α插入片段进行核苷酸序列分析.(3)重组RAR α受体的表达及提取:将PT7-RAR α K38(含PGP1-2)菌株,在含50μg/ml氨苄青霉素及50μg/ml卡那霉素的SR培养基中30℃培养12 h后收集菌体,细菌经超声破膜、离心,收集上清置-20℃备用.(4)Western印迹分析含受体表达载体的K 38大肠杆菌提取物,经15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳分析,然后用RARα单克隆抗体进行Western印迹分析.(5)人重组维甲酸受体配体结合活性测定:用竞争性结合方法测定其受体结合活性,并进行Scatchard分析.

胃肠外营养支持疗法治愈难治性良性乳糜腹水1例报告

乳糜腹水属少见病,查阅我院74年内住院患者病案显示,患有单纯乳糜腹水者仅26例.乳糜大量漏出,可导致重度营养不良及T淋巴细胞功能低下等并发症,因此乳糜腹水病死率亦很高.本文报道1例男性42岁乳糜腹水病例.病程3个月,曾用抗结核治疗2个月,症状未见缓解.查体:消瘦,腹部呈蛙状,平脐腹围74cm,腹水乳糜试验(+),血浆总蛋白3.8 g/L,白蛋白2.4 g/L.双侧下肢淋巴管造影显示,右侧髂总淋巴管以上未见显影.腹部B超、CT及消化道内窥镜检查均排除肿瘤可能性.对其乳糜漏病因进行分析,初步认为系腹腔淋巴管先天畸形自发破裂.入院后低钠、低脂高蛋白饮食,并间断静脉输注白蛋白,利尿治疗;但腹水不见消退.先后两次行双侧腹股沟淋巴管-大隐静脉分支淋巴转流,左髂外静脉旁淋巴管-静脉分支和左精索静脉-淋巴管转流术.

大鼠精子发生中一种新的阶段性表达基因全长cDNA的分离

精子发生是一系列基因严格按照时空顺序相继转录表达的过程.寻找和研究不同时期、不同发育阶段的差异表达基因,将有助于终阐明精子发生的机理.由于大鼠生精细胞在曲细精管内的排列极为有序,本研究采用曲细精管分段分离结合差异显示PCR(DDRT-PCR)的方法,寻找精子发生中差异表达的基因.

入淋巴细胞CD2胞内区结合蛋白的分子克隆

CD2分子,又称E受体,分布于胸腺细胞及所有成熟T淋巴细胞和大部分NK细胞的表面,是T淋巴细胞的粘附和信号分子,在T淋巴细胞分化、成熟、识别、粘附、激活和凋亡等方面都具有重要作用.CD2分子的胞内区含有能调节细胞识别作用、粘附作用和细胞信号传递作用的不同功能区.近年的研究发现,CD2与其配体CD58、CD48的结合介导T细胞识别、粘附和激活作用.而以抗CD2不同抗原决定簇的单克隆抗体处理T细胞,则引起T细胞的不同应答反应.T112和T113处理T淋巴细胞引起细胞激活,而T11l和D66处理T淋巴细胞引起细胞激活后凋亡(activation induced cell death),其原因尚不明了.本实验室在多年研究的基础上推测,CD2胞内区可能传递不同的刺激信号,从而引起不同的细胞应答反应.为了验证这一假说,本研究采用酵母双杂交系统(two hybrid system),首次克隆得到了一与CD2胞内区结合的下游蛋白,并对该蛋白的功能进行探讨,结果如下:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人外周血淋巴细胞mRNA中扩增了CD2胞区cDNA片段,并将其命名为CD2c.

局麻下腹腔镜手术治疗卵巢良性囊肿

1989年11月～1995年5月本科在局麻下腹腔镜手术治疗卵巢良性囊肿58例. 临床资料女性患者58例,年龄19～53岁(40岁以下占86.2%),其中3例未婚,10例不孕.1例为双侧卵巢冠囊肿,故实际囊肿数为59个.术前10分钟静脉注射50 mg度冷丁、25 mg非那根,及口含20μg盐酸二氢埃托菲(20 μg);皮肤切口处以普鲁卡因局麻,盆腔内脏器用100 mg 0.5%地卡因喷布做表面麻醉,卵巢或输卵管系膜处用普鲁卡因(内含1:16万肾上腺素)浸润麻醉.59个囊肿经腹腔镜诊断后,即行局麻下腹腔镜手术.所行手术有卵巢囊肿剥除术、卵巢冠囊肿剥除术、开窗术和卵巢切除术.其中56个囊肿完全剥除(94.9%),2例行开窗术,1例行卵巢切除术.术后病理诊断为卵巢冠囊肿33例,单纯囊肿14例,皮样囊肿12例.所有患者术中或术后均无并发症,术后住院1～3 d.全组术后随诊6～72月,平均24月,无复发.10例不孕患者中有2例妊娠.

聚合酶链反应快速检测眼部疱疹病毒感染

近年来随着抗生素、激素和免疫抑制剂的广泛使用,疱疹病毒(herpresvirus,HV)引起的眼部感染逐渐增多[1,2].与眼病有关的HV主要包括6种:单纯HV1型和2型(HSV-1,HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、水痘-带状HV(VZV)和人疱疹病毒6型(HHV-6).HV引起的眼部感染多种多样,其临床表现常不典型,单凭临床所见往往无法明确诊断;而治疗HV眼部感染的关键在于早期诊断.采用PCR技术检测HV是一种快速而准确的方法.近年国内虽有应用PCR对HSV角膜炎进行检测的报道,但只能检测1～2种HV.本研究选择HV科病毒DNA多聚酶基因区中的一对引物,一次PCR同时扩增HSV-1、HSV-2、EBV和CMV4种HV相应的DNA片段[3],并对临床诊断或拟诊HV眼部感染的32例患者进行了PCR检测.

先天性脊柱后凸畸形的外科治疗

目的总结先天性脊柱后凸畸形的手术治疗经验和失败的教训.方法回顾性分析对比本院33例先天性脊柱后凸畸形患者,经外科治疗术后6月～14年(平均5年6个月)的随访结果.结果33例患者手术时平均年龄16.5岁,平均后凸角度90.2°,4例行单纯前路手术,7例行单纯后路手术,22例联合前后路手术,术后畸形矫正率分别为32.7%、34.4%和41.2%.9例合并不全截瘫患者,术后除2例外,其余均恢复正常.结论联合前后路手术的矫形效果优于单纯前或后路手术.

自身免疫病的喉部损害

自身免疫性疾病常为多器官的全身性疾病,临床表现多种多样,也可有喉部损害,但常不被重视,国内文献报道也不多.近两年来笔者对门诊32例自身免疫病患者进行观察,发现其中11有喉部改变.

《国家重点基础研究发展规划》启动