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培养基反浇法和贴膜法计数结果差异
仪器和材料：菌种
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、缺陷假单胞菌
试剂和培养基
胰酪胨大豆肉汤培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、生理盐水。 -
柠檬酸发酵工艺新进展
柠檬酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸，具有许多生物功能和生物活性，尤其在能量代谢方面对保护人类健康起着重要的作用。柠檬酸是一种重要的天然有机酸，TCA 循环中的重要一员，广泛应用于食品、医药及化工等领域。微生物发酵法生产柠檬酸具有许多优点和良好的应用前景。柠檬酸广泛用于食品工业，医药工业和化学工业，可利用的糖质如土豆和地瓜中的淀粉，在多种霉菌及黑曲霉的作用下，在较低的温度和pH值较高的通气量和糖浓度用发酵法制得。
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产B类伏马菌素黑曲霉菌株基因水平鉴定研究
目的 建立基于基因水平的产B类伏马菌素黑曲霉菌株的鉴定方法.方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和反转录-PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)对产B类伏马菌素黑曲霉基因簇中8个关键基因的DNA和mRNA提取方法、扩增条件等进行优化,并对其表达产物进行分析.结果 检测的19株黑曲霉菌株均携带与B类伏马菌素合成相关的8个关键基因的DNA.其中与产毒量相关性较强的基因为fum6 、fum1和fum19,但不同产毒水平黑曲霉菌株中8个关键基因的mRNA表达量各异.结论 DNA水平不足以鉴别黑曲霉菌株B类伏马菌素的产毒能力,需要结合mRNA表达水平综合分析.
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臭氧被服消毒机杀菌效果的试验研究
为了解臭氧被服消毒机杀菌效果,采用载体定量杀菌试验方法,对肯格王被服消毒机杀菌效果进行了试验.结果,该机在空载的情况下,开机40 min,对布片上金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭率均达99.90%以上;开机60 min,杀灭率均达100%;开机60 min,对布片上白色念珠菌的杀灭率达99.90%以上;开机80 min,杀灭率达100%.在负载情况下,该机开机60 min,对布片上金黄色葡萄球菌的杀灭率达99.90%以上;开机120 min,对布片上黑曲霉菌的杀灭率达99.90%以上.该机开机120 min,对棉絮上的自然细菌杀灭率达94.65%,对棉絮上的自然霉菌杀灭率达94.89%.在空载的情况下,25%小牛血清对该机杀菌能力有轻度影响,50%小牛血清有中度影响.结论,臭氧被服消毒机对布片上细菌繁殖体及霉菌均有良好的杀灭作用.
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基于菌落形态、显微特征、DNA条形码三种策略鉴定僵蚕表面真菌
目的:检测北京市零售药店僵蚕饮片表面所含真菌的种类,为临床安全用药提供参考依据.方法:培养僵蚕表面真菌,进行纯化,获得单一菌株.结合真菌菌落形态、显微结构特征、DNA条形码三种方法鉴定僵蚕表面真菌.结果:从僵蚕饮片表面共获得真菌227株,共计10种.其中的8种真菌得到准确鉴定结果,2种真菌为未知菌株.结论:初步了解北京市零售药店僵蚕表面真菌情况,为临床安全用药提供参考依据.
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黑曲霉菌丝体抗菌活性及石油醚部分化学成分
目的:对黑曲霉Aspergillus niger xj抗菌活性及化学成分进行研究以筛选天然抗菌药物.方法:采用滤纸片扩散法对黑曲霉菌丝体石油醚、醋酸乙酯和水提取物进行抗菌活性测定,并对石油醚部位活性部位进行硅胶柱色谱,甲酯化,通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其化学成分进行分析.结果:菌丝体石油醚部分具有一定抗菌活性,从中鉴定出10个化合物.结论:黑曲霉菌丝体的石油醚部分存在抗菌活性物质,其化学成分以脂肪酸占较大比例.
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黑曲霉生物转化黄酮类成分研究进展
黄酮类化合物具有多种药理活性,包括抗炎、抗氧化、抗血栓、抗菌、抗病毒、降血脂等,而黑曲霉作为世界公认的安全食用性的低等真核生物而广泛应用于微生物转化,并在黄酮类成分生物转化中发挥着重要的作用.该文综述近15年来国内外关于黑曲霉生物转化黄酮类物质及其衍生物的研究进展,以期为黑曲霉的进一步开发应用提供参考.结果表明以黑曲霉为菌种转化黄酮类化合物的主要类型包括黄酮类、黄酮苷类、二氢黄酮类、查尔酮类、多甲氧基黄酮类、异黄酮类等,主要发生羟基化、脱羟基、甲基化、脱甲基、羰基化、脱羰基、糖基化、去糖基化等反应,转化机制可能是在黑曲霉产生丰富广泛酶系的参与下,发生酶促反应后产生相应转化产物.通过黑曲霉生物转化黄酮类成分研究进展,对黑曲霉应用到黄酮类成分转化的实际生产中提供理论指导,也为微生物高效转化具有药理活性的化学成分奠定理论基础和参考.
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黑曲霉孢子悬液贮存期的验证
目的：对贮存期的黑曲霉孢子悬液的质量进行考察和研究。方法：采用计数法及药敏实验对黑曲霉孢子悬液在贮存期的变化进行分析。结果：低温（4℃）保存6个月内黑曲霉孢子悬液菌落计数结果稳定，药物敏感性未出现变化，符合药典的规定。结论：在实验中，验证过的储存期内黑曲霉孢子悬液可直接稀释使用。
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黑曲霉Aspergillusniger对人参皂苷Re的微生物转化
目的:筛选长白山人参土壤中的活性微生物,转化单体人参皂苷产生稀有人参皂苷成份.方法:从长白山人参根际土壤中分离各类菌株,对单体人参皂苷Re进行微生物转化,通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化,采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定.结果:从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株,3株真菌对三醇组人参皂苷Re具有转化作用,其中黑曲霉Aspergillus niger的转化活性较强,转化产物为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1.结论:首次报道黑曲霉能将人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1这一转化过程.
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空气净化与消毒装置除霉菌检测方法的研究
目的 研究空气净化与消毒装置除霉菌的检测方法.方法 以黑曲霉为指标菌,通过空气消毒试验,研究了菌种处理对孢子悬液分散效果的影响,以及使用不同的培养基采样分析培养基的适用性,并分析试验舱湿度对自然衰减率的影响.结果 0.05％浓度吐温80已经能够达到较好的分散效果;黑曲霉孢子在PDA上生长情况优,活性强,并且生长速度快,另外对3种培养基采样的黑曲霉自然消亡率x2检验,P＞0.05,差异无统计学意义;相对湿度＞50％时,自然衰减率下降至稳定状态,约为50％.结论 使用0.05％吐温80制备黑曲霉孢子悬液,马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)采样,实验舱工作的相对湿度范围控制在50％～70％时,黑曲霉孢子气溶胶具有较好的稳定性.
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半夏曲中4种优势微生物的荧光定量PCR方法的建立
目的 对半夏曲中4种优势微生物建立快速、有效的荧光定量PCR检测方法.方法 以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis、黑曲霉Aspergillus niger的重组质粒为标准质粒,设计特异性引物并进行特异性、灵敏性及重复性实验.结果 4种优势微生物的熔解曲线峰单一.枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的低检测限度分别为584、622、0.272、500拷贝/μL.不同质量浓度的标准质粒变异系数(CV)均小于5％.结论 建立的枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于发酵类中药中微生物的检测及定量.
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基于成分分析及抗菌活性的百药煎炮制工艺研究
目的 采用正交试验法,优选百药煎的炮制工艺,确定佳工艺参数.方法 采用L9(34)正交试验法,以百药煎中的主要有效成分没食子酸、二聚体鞣花酸的质量分数和体外抗菌活性为评价指标,通过多指标综合加权评分法,考察3因素3水平,即因素A酵曲种类(根霉曲、安琪曲、黑曲霉)、因素B茶叶种类(绿茶、红茶、普洱茶)、因素C物料比(原药量-菌种量-茶叶量分别为25∶7.5∶2.5、25∶6.25∶1.1、25∶2.5∶1.9)对百药煎炮制工艺的影响.结果 百药煎的佳炮制工艺为A1B2C1,即菌种选用根霉曲,茶叶选用绿茶,原药量-菌种量-茶叶量为25∶7.5∶2.5.结论 该炮制工艺可操作性强,可为百药煎的炮制工艺提供研究数据.
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葛根的化学成分研究
目的从豆科葛属植物云南葛藤Pueraria peduncularis中分离得到10个化合物.方法通过波谱和化学方法分别进行鉴定.结果它们的化学结构为:3-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯苷]-3β,15a,23-三羟基齐墩果-12-烯-16-酮(Ⅰ),大豆素(Ⅱ),染料木素(Ⅲ),大豆苷(Ⅳ),染料木苷(V),3β,15a-二羟基齐墩果-12-烯-16-酮(Ⅵ),羽扇醇(Ⅶ),桦木酸(Ⅶ),α-菠甾醇葡萄糖苷(Ⅸ)和α-菠甾醇(X).结论化合物Ⅰ对黑曲霉具有抑制活性.
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侵袭性肺曲霉病的诊断治疗进展
曲霉菌(aspergillus)以腐物寄生的形式广泛存在于自然环境中,为条件致病菌,引起人类感染约20多种,常见的有8种[1],包括烟霉(Alfumigatus)、黄曲霉(Alflavus)、构巢曲霉(Alnidulans)、黑曲霉(Alniger)、土曲霉(Alterreus)等.烟曲霉为常见,约占80%～90%[2].肺曲霉病是曲霉属感染或吸入曲霉属病原引起的一组急慢性肺部病变,近几年由于广谱抗生素、新的免疫抑制剂、抗癌药的不断涌现以及艾滋病和器官移植患者的增多,有关此病的报道逐渐增加.
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5种快速提取黑曲霉基因组DNA方法的比较
黑曲霉是发酵工业广泛应用的重要菌种,可产生葡萄糖氧化酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖酸、柠檬酸等重要物质,且产量较高.通过基因工程方法进行表达已成为提高产物产量主要的方法之一,而从黑曲霉中提取高纯度的DNA是基因克隆的前提条件.黑曲霉属于丝状真菌,因其细胞壁多糖与几丁质含量较高,细胞壁结构坚固,提取DNA的过程中破壁困难,对提取DNA的纯度与质量会造成一定的影响.目前,提取黑曲霉基因组DNA的方法较多,本实验旨在对实验室常用的5种快速提取黑曲霉基因组DNA的方法进行比较,为今后合理选择DNA提取方法及方法的改进提供实验依据.
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黑曲霉实时荧光PCR检测方法的建立
目的 建立黑曲霉实时荧光PCR检测方法.方法 对6种主要病原曲霉(黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉)的GAPDH基因序列进行比对分析,选择黑曲霉特异位点设计引物和探针,对黑曲霉进行实时荧光PCR扩增,并检测该方法的灵敏度及特异性.结果 该方法可检出2.78×10-10μg/ml的黑曲霉基因组DNA;对亲源关系较近的11株不同种曲霉及4株其他属临床常见的病原真菌进行实时荧光PCR检测.未发现有交叉反应.结论 已建立了灵敏度高、特异性好的快速检测黑曲霉的实时荧光PCR方法.
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布洛芬混悬剂的特殊功效
目的:探讨布洛芬混悬剂微生物限度检验的检验方法.方法:采用五种菌分别验证.结果:微生物限度检验细菌计数方法适用培养基稀释法,其它常规法.结论:在验证过程中发现洛芬混悬剂有杀灭和抑制黒曲霉生长的特殊功用,直得研究.
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β-呋喃果糖苷酶的性质研究
研究了低聚果糖产生菌黑曲霉(Aspergillus niger)SIPI-602的β-呋喃果糖苷酶(1)的性质.1水解蔗糖的Km和Vmax分别为0.025 mol/L和1.39 mmol*L-1*min-1.果糖是1的竞争性抑制剂,Ki=10.05 mmol/L.通过对菌丝体、β-果糖基转移酶(2)与1的混合物及纯的2转化蔗糖的反应进程的比较,考察了1对2反应进程的影响.结果表明,1对低聚果糖生成速率和终产率均有影响.结果还提示在用菌丝体转化蔗糖过程中低聚果糖可能会诱导出更多的1.
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β-果糖基转移酶和β-呋喃果糖苷酶的分离纯化
用球磨机Dyno-Mill破碎低聚果糖产生菌黑曲霉(Aspergillus niger)SIPI-602的菌丝体,其离心上清液经硫酸铵分级沉淀、Octyl-Sepharose CL-4B疏水层析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶过滤等步骤得到了在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单带的两种酶:β-果糖基转移酶与β-呋喃果糖苷酶.前者可将蔗糖转化成低聚果糖,而后者则催化蔗糖和低聚果糖的水解反应.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得两者的分子量分别为98.86kD和84.92kD.
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生物技术文摘
B33-01通过重组带棒链霉菌NRRL3585脱乙酰头孢菌素C合成酶体外转化青霉素N类似物为头孢菌素SimJ等[EnzymeMicrobTechnol,2001,29(4-5):240]青霉素N类似物体外转化成头孢菌素在带棒链霉菌NP1的静息细胞和无细胞提取物中首次获得证实.本研究通过详细鉴定其所需辅因子,优化了高表达可溶性重组带棒链霉菌NRRL3585脱乙酰头孢菌素C合成酶(scDAOCS)产物的转化率.研究发现在该试验的特定反应条件下,0.2～16mmol/L二硫苏糖醇和0.2～10mmol/L抗坏血酸会抑制scDAOCS的活性.用一个改进的新反应条件,包括50mmol/Ltris-HCl(pH7.4)、0.8mmol/LATP、1.28mmol/Lα-酮戊二酸和1.8mmol/LFeSO4,可将两种青霉素N类似物--青霉素G和氨苄青霉素的转化率分别提高20和35倍.[龚家玮摘朱春宝校]B33-02粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)突变株利用蔗糖糖蜜生产β-胡萝卜素BhosaleP等[JIndMicrobiolBiotechnol,2001,26(6):327]通过考察蔗糖糖蜜培养基中菌体的生长、产生类胡萝卜素(1)及β-胡萝卜素(2)的比例等指标,筛选了几株红酵母菌(Rhodotorulasp.)的野生菌株和突变株,并且从总还原糖(TRS)浓度、pH两个因素对其中较好的突变株-32产生1的发酵条件进行了优化.在以糖蜜为唯一营养源、TRS浓度为40g/L、pH6的摇瓶培养过程中,1产量为14mg/L,其中2占70%.在一14L搅拌罐中,在简单的糖蜜培养基中观察到torulene的含量增加了20%.但添加酵母抽提物后这种效应就逆转了,观察到2的含量增加了31%.将突变株-32在简单糖蜜培养基中进行恒溶氧分批培养,在二倍或三倍浓度的糖蜜培养基中产生的1总量分别为71和185mg/L.当培养基中补加酵母抽提物后1的总产量分别为97和183mg/L,其中2含量增加了30%,而同时torulene的比例却降低了40%.二倍和三倍浓度培养基的分批培养可以获得高浓度的菌体.[吴大治摘朱春宝校]B33-03利用黑曲霉生产组织纤溶酶原激活剂(t-PA)WiebeMG等[BiotechnolBioeng,2001,76:164]以一株蛋白酶缺陷的黑曲霉菌株作为宿主生产人t-PA(1).在合成培养基中进行分批培养和补料培养,1产量可达0.07mg/g生物量.在分批培养的第一次生长末期添加葡萄糖后菌体出现二次生长,1产量增加了2～3倍.在合成培养基中添加大豆蛋白胨后1产量可达1.9mg/g生物量.在补加大豆蛋白胨的分批培养物中1产生速率为0.2～0.6mg/(L·h),可以与在高产量的哺乳动物细胞或昆虫细胞培养物中所观察到的生成速率相媲美.在添加大豆蛋白胨、限制葡萄糖浓度的恒化培养中,1以0.7mg/(L·h)的速率生成.黑曲霉表达1蛋白后导致涉及去折叠反应的三个相关基因(bipA,pdiA,cypB)的高表达.但1生产菌株中cypB基因过量表达后,1产量却没有增加.在黑曲霉中产生的1被剪切成两条分子量和人黑素瘤的双链t-PA相近的链.这两条链在宿主菌的培养上清液中至少稳定16h.[吴大治摘朱春宝校]B33-04用小分子化合物使耐药菌对万古霉素重新敏感ChiosisG等[Science,2001,293:1484]病原性肠球菌正在对目前临床使用的抗生素产生耐药性,包括对万古霉素(1)这一作为抗革兰阳性菌感染的后一线药物.细菌对1的抗性主要是由于构成细菌细胞壁的肽聚糖的前体的末端发生改变,使其不能结合1而导致细菌耐药.研究发现一些有定向性亲核、亲电基团并与肽聚糖末端手性互补的小分子,能有选择性地催化肽聚糖前体缩酚肽(depsipeptide)的裂解.据此设计了一些小分子化合物,其中有代表性的是SproC5.与1联合用药的试验表明,它能将一株耐1的肠球菌的低抑菌浓度从500μg/ml降到62.5μg/ml.这种能使耐药菌对1重新敏感的小分子化合物可能是对付耐药菌感染的一个有希望的手段.[龚家玮摘朱春宝校]B33-05脂类包被的脂肪酶在水-有机两相系统中作为一种有效的水解催化剂MoriT等[BiotechnolBioeng,2001,76(2):157]脂类包被的脂肪酶(1)在有机溶剂中可溶,在无水有机溶剂中可充当有效的酯化催化剂.研究发现,1在水-有机两相系统中也可作亲脂性酯的有效水解催化剂.1和底物均可溶于有机相,与水相中水分子发生反应.在天然脂肪酶的反应系统中,由于酶和底物分别位于水相和有机相,反应只发生在两相界面.因此,在水解反应时,用1的水解反应速率比天然脂肪酶快40～100倍.1催化的水解速率不受水相pH和两相搅拌速度的影响.1的酶活可与PEG修饰的脂肪酶相媲美,本研究还对两相反应的米氏动力学进行了考察.[杨正茂摘朱春宝校]
