首页 > 文献资料
-
SYBR greenⅠRQ-PCR定量检测DNA方法的改良与建立
目的探讨用改良SYBR greenⅠ实时定量PCR(RQ-PCR)技术消除引物二聚体(PDs)对定量分析的影响,建立准确的定量检测DNA含量的方法.方法以β-actin 为目的基因,通过对扩增产物和PDs熔解曲线的分析找出各自的解链温度(Tm),选择在高于PDs Tm但低于目的片段 Tm的温度时检测荧光信号,建立改良SYBR greenⅠRQ-PCR方法.结果该法可消除PDs对SYBR greenⅠRQ-PCR的影响.用此法构建所得标准曲线斜率为-3.178 866,相关系数为-0.980 535,PCR反应动力学范围达5个log值(102～106);精确性检测中,DNA含量实测值与预测值的差异无统计学意义(P>0.05);稳定性检测中,3种不同浓度标本的批内变异和批间变异分别为1%、3%、2%和2%、4%、4%.结论改良SYBR greenⅠRQ-PCR可有效消除PDs对定量分析的影响,对目的基因DNA拷贝数进行PCR反应线性范围广、敏感性、精确性和稳定性好的定量检测.是一种简便实用的DNA定量检测的方法.
关键词： 聚合酶链反应 SYBR greenⅠ DNA定量 -
人类SUZ12基因实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的:建立SYBR GreenⅠ实时荧光PCR定量检测人类SUZ12基因的方法.方法:将SUZ12 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测SUZ12,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的低拷贝数为14.2,线性范围为1.42×101-1.42×108拷贝,相关系数r为-1.00,1.42×107拷贝/L标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.8%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(melting temperature,Tm)为(81.37±0.16)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测SUZ12基因,快速有效、灵敏度高、特异性好.
关键词： SUZ12 SYBR greenⅠ 实时荧光定量PCR -
半夏曲中4种优势微生物的荧光定量PCR方法的建立
目的 对半夏曲中4种优势微生物建立快速、有效的荧光定量PCR检测方法.方法 以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis、黑曲霉Aspergillus niger的重组质粒为标准质粒,设计特异性引物并进行特异性、灵敏性及重复性实验.结果 4种优势微生物的熔解曲线峰单一.枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的低检测限度分别为584、622、0.272、500拷贝/μL.不同质量浓度的标准质粒变异系数(CV)均小于5％.结论 建立的枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于发酵类中药中微生物的检测及定量.
-
三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较
目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板，应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段，纯化回收产物，定量，并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释，作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量，再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增，每个浓度3复孔。标准曲线拟合，结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97），10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0，2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2，而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大，且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。
-
实时荧光定量RT-PCR检测急性白血病中Bmi-1基因mRNA的表达及意义
[目的]建立荧光实时定量RT-PCR ( FQ RT-PCR)检测Bmi-1基因mRNA的方法并研究该基因在急性白血病细胞中表达的意义.[方法]根据 Genbank提供的序列,设计目的基因Bmi-1及内参基因GAPDH的扩增引物,将 Bmi-1及GAPDH RT-PCR扩增片段克隆入载体pMD18-T simple,经测序鉴定正确后,进行纯化、定量及系列稀释,应用 SYBR GreenⅠ荧光染料,建立检测Bmi-1 mRNA的FQ RT-PCR方法,并对其线性及特异性进行评价.应用此方法检测21例急性白血病及10例健康人外周抗凝血中Bmi-1 mRNA的表达水平.[结果]该方法的线性范围为1.0×103～1.0×108copies/μL,相关系数为-1.00,熔解曲线分析扩增产物显示单一的峰,熔解温度(Tm)为80.4℃.急性白血病患者的相对表达量为0.56±0.12,健康对照组中Bmi-1 mRNA的相对表达量为0.19±0.08,两者的表达差异有统计学意义(P<0.05).[结论]实时荧光定量RT-PCR方法检测Bmi-1基因表达,具有高敏感性和高特异性等优点,可作为进一步研究 Bmi-1基因的方法.Bmi-1基因参与急性白血病的发生,可能是一种新的肿瘤标志物.
-
茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用
目的 建立茎环状逆转录引物(简称茎环引物)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),并作初步应用.方法 应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4+T细胞株的miR-155,初步验证方法 的可行性.用所建立的方法 对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型别的关系,其聚合酶链反应(PCR)反应产物通过电泳验证产物特异性.结果 所建方法 能特异的检测到miR-155的扩增信号,低检出限为10-7 nmol/L, 在10-1～10-6 nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数(r)为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性.CD4+T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性, PCR反应产物电泳可获得单一条带.宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关(P<0.05),但与本研究涉及的HPV基因型别无关(P>0.05).结论 所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础.
关键词： 微小RNA 逆转录聚合酶链反应 miR-155 SYBR greenⅠ -
实时定量PCR检测内质网应激相关基因方法的建立
从人外周血白细胞中扩增目的 基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数.所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段.
关键词： 实时定量PCR SYBR greenⅠ 内质网应激 -
SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲型H1N1与季节性流感病毒方法的建立
目的 建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法.方法 设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,同时进行熔解曲线和Tm值分析,并作灵敏度和重复性试验.结果 该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应.构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为:95.588%,检测灵敏度为101 copies/反应体系,结果重现性好.成功地验证性检验了32份盲样标本.结论 本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测.
关键词： 甲型H1N1 实时荧光定量PCR SYBR greenⅠ -
猪嵴病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立
目的 本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法.结果 该方法检测PKV的3D基因在6.42×102 ~ 6.42×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为(84.94±0.24)℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强.所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%~1.14%,组间变异系数0.63%~1.79%,重复性好.结论 本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染水平和确定感染靶器官提供新的检测方法.
关键词： 猪嵴病毒 SYBR greenⅠ 实时荧光定量RT-PCR -
实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立
目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.
关键词： EZH2基因 SYBR greenⅠ 实时荧光定量PCR -
一种新的引物二聚体形成机制
目的 通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR无模板测试技术,阐明引物二聚体形成的机制,解决PCR反应中引物二聚体形成的问题,推动SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术的应用.方法采用 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测不同特点的典型引物对形成引物二聚体的Ct值,检测特异的反义核苷酸、短寡核苷酸对二聚体的影响,测试优化方案在HBV DNA定量检测中的效果.结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR测试发现,3′端连续6~7碱基反向互补的引物对的Ct值:5.0、10.0、11.0;与另一引物中部连续6个碱基反向互补的Ct值:30.0、28.0、29.5;与另一引物5′末端连续6个碱基反向互补的引物对的Ct值:32.0、29.5、31.0.普通引物对测试的Ct值:27.5、29.0、31.0;中间部分同向相同的引物对测试的Ct值:36.5、43.0、39.0;同向相同的引物对未形成二聚体,反向相同引物对测试Ct值是30.5.低温预处理的短寡核苷酸促进二聚体形成,而在热启动PCR反应中无作用,特异的反义核酸抑制二聚体.PCR增效剂推后普通引物对的二聚体1个循环,推后部分同向相同的引物对的二聚体10个循环.中间部分相同的引物对检测低浓度质粒标准品比普通引物对检测结果更精确.结论 提出一种新的引物二聚体形成机制:引物对在3′末端碱基反向互补结合的基础上,借助剩余序列的同向互补力量拉近彼此在空间上的距离,从而进行延伸反应形成引物二聚体.中间偏3′端同向相同的引物对可以有效抑制引物二聚体,并且该作用可以被其他优化方法加强.
关键词： 实时荧光定量PCR SYBR greenⅠ 引物二聚体 形成机制 -
SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR在染色体常见非整倍体诊断中的应用
目的 探讨SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR技术用于非整倍体诊断的可行性.方法 选择13号染色体上的ABCC4基因、18号染色体上的TYMS基因、21号染色体上的DSCR3基因、X染色体上的HPRT2基因和Y染色体上的SRY基因为目的基因,以12号染色体上的管家基因GAPDH为参照基因,选取SYBR Green Ⅰ作为荧光染料,采用双标准曲线相对定量PCR法进行检测,并与核型分析结果进行比对.结果 检测13号染色体时,计算目的基因与参照基因比值,正常标本组(0.90±0.31)与三体标本组(1.39±0.12)的差别有显著意义(P=0.003);检测18号染色体时,正常标本组(1.07±0.44)与三体标本组(1.66±0.12)的差别有显著意义(P=0.000);检测21号染色体时,正常标本组(0.84±0.27)与=三体标本组(1.73±0.54)的差别有显著意义(P=0.000);检测X染色体时,45,X组(0.62±0.12)与46,XY组(0.63±0.25)比值无差别(P=0.965).46,XX组(1.32±0.37)与47,XXY组(1.20±0.35)比值无差别(P=0.326),单个拷贝X(包括45,X、46,XY)(0,63±0.23)与两个拷贝X(46,XX、47,XXY)(1.26±0,36)比值差别有统计学意义(P=0.000);检测Y染色体时,正常女性(46,XX)无目的基因扩增,正常男性组(46,XY)(1.57±0.54)与三体标本组(47,XYY)(3.08±0.15)比值差别有统计学意义(P=0.003).结论 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量技术可用于快速诊断染色体非整倍体.
关键词： 非整倍体 实时荧光PCR SYBR greenⅠ -
3种常见核酸染料的安全性和灵敏度研究
目的 探讨Gold View、溴化乙锭(EB)、SYBR GreenⅠ 3种实验室常用核酸染料的安全性与灵敏度,筛选出具有较高安全性和灵敏度的核酸染料.方法 采用正常人胚肾细胞为研究对象,对比研究Gold View、EB、SYBR GreenⅠ对细胞增殖和细胞周期的影响;分别使用3种核酸染料对凝胶中的DNA进行染色,比较其灵敏度.结果 SYBR GreenⅠ对HEK-293细胞的周期与增殖影响小,Gold View的影响大.SYBR GreenⅠ和Gold View对DNA染色的灵敏度相当,略低于EB.结论 SYBR GreenⅠ具有较高安全性和较高的灵敏度.
-
利用羧化纳米磁株抽提微量DNA及荧光定量检测方法的研究
利用实验室制备的表面修饰有羧基的Fe3O4纳米磁珠对DNA的分离进行了研究,确立了快速、高效、安全、经济的分离纯化方法.利用荧光染料Sybr Green Ⅰ对微量DNA进行定量检测,具有灵敏度高、重复性好及操作简单的优点.
关键词： 羧基 纳米磁株 循环DNA SYBR greenⅠ -
SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法分析结直肠癌患者肠道菌群变化
目的 应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法分析结直肠癌患者肠道菌群的变化,探讨肠道相关分子微生态在其发病中的作用及意义.方法 根据细菌的16S rRNA基因序列设计双歧杆菌属、乳酸杆菌属和大肠杆菌的特异性引物,根据细菌的ddl基因序列设计粪肠球菌及屎肠球菌的特异性引物.收集结直肠癌患者术前粪便标本30份(结直肠癌组)及正常对照标本30份(正常对照组),提取细菌基因组DNA,应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应测定5种细菌的数量.结果 正常对照组与结直肠癌组粪便中细菌数量分别为双歧杆菌属: 9.25±0.83比4.52±0.49,乳酸杆菌属: 7.45±0.37比5.46±0.12,结直肠癌组的数量明显减少(P<0.05); 大肠杆菌: 4.68±0.32比5.82±0.47,粪肠球菌: 4.95±0.24比10.60±0.30,屎肠球菌: 5.03±0.43比5.74±0.16,结直肠癌组的数量明显增多(P<0.05).结论 结直肠癌患者粪便中双歧杆菌及乳酸杆菌数量较正常对照明显减少,而大肠杆菌,粪肠球菌和屎肠球菌的数量较正常对照明显增多,提示结直肠癌的发生、发展与肠道菌群有一定关系.
关键词： 结直肠癌 肠道菌群 实时荧光定量PCR SYBR greenⅠ -
肠道菌群失调对结直肠癌发生的影响研究
目的：用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，分析结直肠癌患者肠道菌群变化并探索肠道菌群在发病过程中的作用。方法：依据细菌基因序列，设计较具代表性的五种细菌的特异性引物，并收集结直肠癌患者的粪便标本三十份及正常对照组标本三十份。提取细菌基因组的 DNA，并且应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法测定细菌的数量，得出结论然后进行研究。结果：对照组与实验组粪便中细菌的数量为双歧杆菌属：9.15±0.73比4.42±0.39，乳酸杆菌属：7.35±0.27比5.26±0.02，结直肠癌组的数量明显减少(P<0.05)；大肠杆菌：4.58±0.22比5.72±0.37，粪肠球菌：4.85±0.14比10.50±0.20，屎肠球菌：5.13±0.33比5.64±0.06，结直肠癌组的数量明显增多(P<0.05)。结论：通过对比对照组，结直肠癌患者粪便中数量减少的菌群有双歧杆菌和乳酸杆菌；数量增多的菌群有大肠杆菌，粪肠球菌以及屎肠球菌，由此可以看出肠道菌群的失调对结直肠癌的发生有一定的影响。
关键词： 结直肠癌 实时荧光定量PCR 肠道菌群 SYBR greenⅠ
