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腺病毒介导HSP70-HBsAg嵌合基因转染树突状细胞及生物学特性分析
目的 分析携带热休克蛋白70(HSP70)和乙肝表面抗原(HBsAg)嵌合基因的腺病毒表达载体感染人外周血诱导培养树突状细胞(DC)后其生物学特性的改变.方法 从正常人外周血中分离单个核细胞,经Ad-HSP70-HBsAg感染刺激后.在含细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的培养液体中体外诱导培养DC;采用荧光倒置显微镜、RT-PCR、流式细胞仪(FACS)和混合淋巴细胞反应(MLR)试验对人外周血来源的DC进行生物学特性分析.结果 Ad-HSP70-HBsAg感染后的DC能够有效表达示踪蛋白GFP和转录基因HSP70-HBsAg,病毒感染组和对照组的DC在细胞形态、DC细胞表面分子表达和刺激同种异体的人外周血幼稚型T细胞增殖能力的方面无明显差别.结论 Ad-HSP70-HBsAg可有效转染DC,感染后的病毒对DC的生长和生物学特性无显著影响.
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腺病毒载体介导EB病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响
目的探讨腺病毒载体介导EB病毒(EBV)潜伏期膜蛋白2A(LMP2A)基因转染树突状细胞(DC)对其功能的影响.方法通过同源重组法构建带有EBV-LMP2A基因的重组腺病毒Ad5-LMP2A,用不同感染滴度(MOI)的Ad5-LMP2A转染成熟的DC,用流式细胞术(FACS)检测DC的LMP 2A蛋白表达细胞百分率及用台盼蓝染色计数DC死亡百分率,选择佳MOI;用佳MOI的Ad5-LMP2A转染成熟的DC,FACS检测转染前后DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80及HLA-DR的变化;并用3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力及荧光定量PCR检测表达IL-12 P40 mRNA等功能的改变.结果 MOI 200为Ad5-LMP2A转染DC的佳滴度,此时约80%的DC表达LMP2A蛋白及92%以上细胞为活细胞.Ad5-LMP2A转染成熟DC前后对细胞表面共刺激分子及特征性表面标志无影响;转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和表达IL-12 P40 mRNA的功能.结论腺病毒载体能高效介导EBV LMP2A基因在DC中表达,Ad5-LMP2A转染成熟DC对其功能无明显影响,便于进一步用于EBV相关肿瘤的免疫治疗.
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母亲不同HBV感染状态所生新生儿树突状细胞亚群及功能研究
目的 探讨新生儿mDC、pDC频数及表面分子表达,以及母亲不同HBV感染状态对新生儿树突状细胞生物学特性的影响.方法 采集HBsAg阳性/HBeAg阳性HBV感染母亲、HBsAg阳性/HBeAg阴性HBV感染母亲以及HBV感染标志物阴性母亲所生新生儿脐带血、健康成人外周血,采用流式细胞仪检测mDC的频数及其CD86的表达、pDC的频数及其CD80、CD83、CD86表达、并采用FlowJo软件进行分析,比较各组间上述指标的差异.结果 分别采集HBsAg阳性/HBeAg阳性、HBsAg阳性/HBeAg阴性和HBV感染标志物阴性母亲所生新生儿脐带血14、12和13例,健康成人外周血7例.新生儿mDC频数(0.29±0.16)及其CD86阳性率(10.72±10.01)显著低于成年人(分别是0.81±0.17和32.13±7.46),(t=-7.86,P=0.00和t=-5.36,P=0.00)；新生儿pDC频数(0.15±0.07)以及pDC表面CD86/CD83阳性率(31.61±12.81,42.66±20.83)显著低于成年人(0.30±0.07;74.96±9.78;82.00±6.94),(t=-5.43,P =0.00;t=-8.49,P=0.00;t=-4.90,P=0.00).结论 新生儿脐带血mDC、pDC频数以及表面功能分子表达低于成人外周血,HBeAg可能降低生新生儿mDC表面CD86的表达.
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Ⅱ型树突状细胞在慢性乙型肝炎患者中的功能检测及其临床意义
目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血中Ⅱ型树突状细胞(pDC2)的数量及其功能的变化与疾病的发生发展的关系.方法 采用流式细胞分析技术对27例慢性乙型肝炎患者和15例健康人外周血中pDC2数量的变化以及其产生α干扰素的能力进行了检测,同时与T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的比值进行了比较分析.结果 肝炎患者外周血pDC2的百分数(0.096±0.086)较正常人(0.304±0.093)明显降低,两者差异有统计学意义(P＜0.001),特别是慢性肝炎患者pDC2产生IL-12及IFNα的能力明显低于正常人群(P＜0.001);而CD4+/CD8+的比值则明显高于正常人(P＜0.01).同时发现在HBV DNA(+)的患者中其pDC2的百分数和CD4+/CD8+的比值分别为0.087±0.054和1.95±0.562,均明显高于HBV DNA(-)患者(分别为0.043±0.031和1.44±0.476),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 与正常人相比,慢性乙型肝炎患者外周血中pDC2的数量和其产生细胞因子的能力降低,后者可能与慢性乙型肝炎患者病程的进展以及血清中HBV DNA阳性有关.
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慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后外周血树突状细胞和淋巴细胞亚群的变化及意义
目的分析慢性乙型肝炎患者拉米夫定抗病毒治疗前后外周血树突状细胞和淋巴细胞亚群变化.方法对16例拉米夫定抗病毒治疗有效的慢性乙型肝炎患者动态观察48周,在治疗前、后对外周血单核细胞来源的树突状细胞进行体外培养,用流式细胞仪检测DC表面分子及淋巴细胞亚群水平,观察治疗前、后的变化.结果16例患者中,11例治疗持续有效,未发生YMDD变异,5例发生变异.无变异组的慢性乙肝患者,治疗12周时,HLA-DR水平较治疗前降低(P＜0.05);治疗48周时,CD8o、CD40和CD1a与治疗前比明显提高(P＜0.05)而HLA-DR恢复至治疗前水平.变异组患者,治疗12周时,CD83及HLA-DR降低(P＜0.05);治疗48周时,HLA-DR仍低于治疗前(P＜0.05).无变异组患者,治疗12周时,CD+4T细胞、CD+8 T细胞、NK细胞、CD19+B细胞和CD+4/CD+8 T细胞比值均无明显变化;48周时,CD+4T细胞比例增高,NK细胞比例下降(P＜0.05).而变异组患者的淋巴细胞亚群则无显著改变.结论拉米夫定治疗持续有效组,DC表面共刺激分子CD80、CD40可随着HBV被长时间有效抑制而得到部分恢复,治疗过程中有DC表面的HLA-DR暂时降低,而后HLA-DR水平恢复和CD1a明显提高,同时外周血CD+4T细胞比例上升和NK细胞比例下降.而发生YMDD变异组,DC表面HLA-DR呈现持续性降低.
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温热对HPV感染皮肤LC成熟功能的影响
目的 探讨不同局部温热条件对人乳头瘤病毒(HPV)感染皮损朗格汉斯细胞(LCs)CD1a/CD83表达变化的影响,为病毒疣的治疗提供理论依据.方法 采用共聚焦显微镜检测正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损内LC CD1a/CD83的表达变化;利用37℃,42℃,45℃不同温热条件处理正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损,采用流式分析技术检测游走至培养液中CD1a~+/CD83~+LC的数量变化.结果 正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损内只见CD1a~+LC,无CD83~+LC;正常皮肤组织和尖锐湿疣组织游走细胞中CD1a~+/CD83~+LC的百分比均随局部温度升高而逐渐增多.温热对尖锐湿疣组织游走LC中CD1a'CD83表达影响显著高于正常皮肤组织.结论 局部温热可能通过促进LC的迁移和成熟,在局部细胞免疫应答中发挥作用.
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肠道病毒71型体外感染人树突状细胞后启动免疫应答反应的研究
目的 研究肠道病毒71型(EV71)体外感染人树突状细胞(DCs)后启动免疫应答反应的机制,为探讨EV71感染及宿主免疫应答提供理论依据.方法 健康成人外周血单核细胞诱导衍生获得DCs,流式细胞术检测病毒感染前后DCs表面分子,PCR芯片分析DCs感染EV71 2 h和8h后CD分子及细胞因子类基因差异表达,Luminex液相芯片技术检测感染组细胞上清液中细胞因子含量,混合淋巴细胞反应(MLR)检测病毒感染后的DCs对初始T细胞的刺激活性.结果 EV71感染刺激后DCs的CD80和CD83表达率分别提高了8.2％和35.4％.PCR芯片显示EV71感染2h和8h后CD80、CD83、IL-1α、IL-6和ICAM-1基因表达显著上调2.08～5.49倍,而IL-18则下调5.12倍.与对照组相比,EV71感染DCs组细胞上清液中IL-6和IL-12的含量明显升高(P＜0.05).而MLR未观察到EV71感染的DCs刺激初始T细胞增殖现象.结论 EV71感染能增加DCs活力,延长其存活时间,促使其活化、成熟并分泌细胞因子,启动宿主细胞相应的免疫应答.
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抗原活化慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的对比研究
目的 探讨不同抗原在体外活化慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)及诱导特异性T细胞应答的能力.方法 用无血清培养基从慢性乙型肝炎患者外周血中分离培养DC,在DC成熟前,分别加入HBsAg多肽、HBcAg多肽刺激,用流式细胞仪检测DC表型,用液闪计数仪观察DC对T细胞的增殖作用,用ELISA法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中IL-12的分泌水平.结果 经HBcAg多肽刺激DC的CD86表达率为(92.20±5.18)%,明显高于HBsAg多肽刺激组(76.19±3.90)%和未加抗原组(62.37±4.24)%,P＜0.01;经HBcAg多肽刺激组DC诱导同种异体静止T细胞增殖的能力每分钟液闪计数值cpm为34 326±3088,明显高于HBsAg多肽刺激组20 306±2897和单个核细胞组3454±409,P＜0.01;经HBcAg多肽刺激组DC MLR中IL-12(348±42.8)ng/L,分别高于HBsAg多肽刺激组(226±30.6)ng/L和未加抗原组(116±15.6)ng/L,P＜0.01.结论 使用HBcAg多肽刺激DC可比HBsAg多肽更有效地提呈病毒抗原,提高诱导特异性T细胞应答的能力.
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含HPV16 E6E7突变融合基因DC疫苗的抗肿瘤效果研究
目的 探讨含一种密码子优化HPV16 E6E7突变融合基因的树突状细胞(DC)疫苗的抗相关肿瘤免疫效果.方法 对经密码子优化的HPV16 E6E7融合基因的关键位点进行突变,获得在E6 L57G、C113R及E7 C24G、E26G、C58G位点突变的HPV16 omfE6E7基因,并检测了该基因的去致瘤性;利用含HPV16 omfE6E7重组非复制型腺病毒感染树突状细胞构建DC疫苗(DC-HPV16omfE6E7),并利用动物模型对该疫苗进行了抗相关肿瘤免疫研究.结果 HPV16 omfE6E7基因对NIH3T3细胞无转化作用,含该抗原基因的DC-HPV16 omfE6E7疫苗有效激发特异性CTL反应,与对照组相比,疫苗免疫的小鼠成瘤时间推迟,并且成瘤率明显下降,成活率显著增加.结论 DC-HPV16omfE6E7疫苗可望用于抗肿瘤免疫治疗.
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慢性乙型肝炎干扰素治疗前后树突状细胞的变化及其与疗效相关性研究
目的 探讨慢乙肝干扰素α(IFNα)治疗前后髓样树突状细胞(mDC)和浆样树突状细胞(pDC)的变化及其与病毒学、生化学指标的关系.方法 采集30例HBeAg阳性慢乙肝患者IFNα治疗前和治疗12周时的外周血,用流式细胞仪检测mDC和pDC的频数及CD86表达水平.根据IFNα治疗后生化学指标和病毒学指标变化,把患者分为ALT复常组、ALT未复常组及病毒学应答组、病毒学无应答组,分析IFNα治疗前后不同组DC变化.结果 (1)IFNα治疗12周时ALT复常组pDC频率(0.25％±0.14％)较基线(0.18％±0.09％)升高(P =0.023),ALT未复常组mDC频率(0.58％±0.34％)及表面CD86阳性率(61.80％±22.52％)则较基线(分别为0.88％±0.51％,79.92％±25.94％)下降(P =0.025；P=0.036).(2)IFNα治疗12周时病毒学应答组pDC表面CD86阳性率(46.86±12.22％)较基线(29.42±15.16％)升高(P =0.002),病毒学无应答组的mDC频率(0.51％±0.22％)及表面CD86阳性率(59.63％±22.94％)则较基线(分别为0.94％±0.58％,80.11％±29.34％)下降(P =0.006；P =0.049).结论 慢乙肝干扰素α治疗后,生化和病毒应答与pDC频率和功能增强相关,而mDC频率及功能的降低与IFN治疗后无生化和病毒应答相关.
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烫伤法克隆小鼠巨噬细胞来源的趋化因子基因
巨噬细胞来源的趋化因子(macrophage-derived chemokine, MDC)是1997年由Godiska R 等首次从人单核细胞来源的巨噬细胞cDNA克隆随机片段分离得到的,具有趋化单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和TH2细胞等功能.鼠MDC曾称为ABCD-1.MDC也称为CCL22,属于CC趋化因子家族,已经证实的MDC受体是CCR4.
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白细胞介素13在支气管哮喘发病机制中的作用
白细胞介素13(IL-13)是由T细胞、嗜酸粒细胞、浆细胞及树突细胞产生的细胞因子,通过促进T淋巴细胞的IgE合成以及嗜酸粒细胞的肺内聚集等机制参与支气管哮喘发病.
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自体树突细胞与混合T淋巴细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的护理
目的 探讨乙肝患者使用自体树突细胞和混合T淋巴细胞疫苗(简称抗HBV-DC-MTL)治疗慢性乙型肝炎的临床采血与回输的护理.方法 取乙肝患者的肝素抗凝外周静脉血50 ml,通过实验室生物免疫技术培养获得成熟的树突细胞和混合T淋巴细胞疫苗,培养第7天将收获的DC、第14天收获的抗HBV-MTL分别回输给患者.并对38例乙肝患者采集细胞与回输的护理进行观察.结果 38例患者好转36例,无效1例,治愈1例.结论 采用肝素抗凝的50 ml注射器加9号输液头皮针在大血管处采血,采血成功率高；标本4℃左右冷藏保存,2h内分离培养,是收获细胞疫苗成功的关键；回输的方法,安全度高,并发症少.
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DC-CIK联合硼替佐米治疗多发性骨髓瘤患者的临床观察
目的：：研究树突状细胞-细胞因子诱导T细胞( DC-CIK)过继免疫联合硼替佐米为基础的化疗治疗多发性骨髓瘤( MM)患者的临床疗效。方法：将29例MM患者随机分为两组：化疗组患者14例，给予含有硼替佐米的化疗方案；联合组患者15例，除接受含硼替佐米的化疗外，还给予DC-CIK免疫治疗。考察两种疗法的疗效及不良反应。结果：治疗后，联合组患者的生活质量、临床指标[瘤细胞百分比为(23.23±6.38)%；β2微球蛋白表达水平为(6.77±2.03) mg/L；肌酐水平为(79.4±13.63)μmol/L]、总体缓解率(86.7%)与化疗组[(19.11±5.67)%；(8.39±3.11) mg/L；(110±21.07)μ mol/L；71.4%]比较，均有所提高(P值均<0.05)。联合组患者感染带状疱疹的感染率(0%)低于化疗组(21.4%)。结论：DC-CIK免疫治疗联合以硼替佐米为基础的化疗安全有效，不良反应小，耐受性好，适用于MM患者。
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HSP70-抗原肽负载的DCs对肺癌细胞杀伤作用的实验研究
目的 探讨肿瘤热休克蛋白70-多肽复合物（heat shock protein 70-peptide complexes,HSP70-PCs）负载的树突状细胞（dendritic cells,DCs）对肺癌细胞（SPC-A-1）的杀伤效果,并与未加抗原的DCs进行比较.方法 用加热、ADP亲和层析法提取肺癌细胞HSP70-PCs作为抗原,使之与DCs共同培养,检测其对肺癌细胞的杀伤作用.结果 与未加抗原的DCs比较,加入HSP70-PCs的DCs对肺腺癌细胞SPC-A-1的杀伤效果明显升高.结论 负载HSP70-PCs的DCs对肺腺癌细胞SPC-A-1的杀伤效果明显高于未加抗原的DCs.
关键词： 树突细胞 热休克蛋白质70/治疗应用 肺肿瘤/治疗 -
环孢素对小鼠树突细胞体外成熟及同种免疫刺激活性的影响
目的:观察环孢素(cyclosprine A,CSA)对小鼠树突状细胞(dendritic cell,DC) 体外成熟和免疫学功能的影响,以期进一步探讨CSA免疫抑制作用机理.方法:在小鼠DC体外培养时加入两种剂量(0.5 μg/ml和1.0 μg/ml) 的CSA处理,观察DC的生成情况,以流式细胞仪分析各处理组细胞的免疫表型,并作体外混合淋巴细胞反应观察其对同种T细胞的刺激增殖能力.结果:经CSA培养后,DC的生成和形态没有影响,表达低水平的共刺激分子CD40,CD80,DC的抗原呈递功能和刺激同种T细胞的功能显著下降.结论:CSA在早期阶段干扰免疫应答是通过影响DC的活化而实现,DC是CSA初的作用位点.
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小肠系膜滤泡树突状细胞肉瘤1例报告并文献复习
目的:探讨小肠系膜滤泡树突状细胞肉瘤的病理组织学与免疫组化特点,提高对此病的认识.方法:运用组织病理学和免疫组化观察小肠系膜滤泡树突状细胞肉瘤的特点,并复习相关文献加以分析总结.结果:瘤细胞呈弥漫性排列,细胞境界不清,呈"合体细胞"样,核椭圆形,染色质淡,空泡状或点彩状,有小核仁,并见病理性核分裂;瘤细胞CD21、CD35、CD68、S-100、LCA、CD56均阳性,CD117局灶阳性,Ki-67增殖指数为20%,HHF35、CD34、CD30、CK、CD20、CD3、CD43均阴性.结论:小肠系膜滤泡树突状细胞肉瘤是一种少见的中度恶性肿瘤,诊断主要依据组织病理学和免疫组化标记.
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树突状细胞介导的以p53为靶向的肿瘤免疫治疗
进入21世纪以来,肿瘤成为威胁人类健康的头号杀手.而对于恶性肿瘤的治疗,传统方法有手术治疗、放射治疗和化学药物治疗,这些疗法对早期肿瘤可获得较为满意的疗效,但对于晚期肿瘤伴有局部扩散和远处转移者往往难以取得满意疗效.自20世纪80年代兴起的生物治疗发展迅速,已经成为继上述3种疗法之后的第4种抗肿瘤措施.90年代初,生物治疗发展到基因治疗阶段.已证实p53基因突变是至今已知与人类肿瘤相关的普遍的基因变化.近年,随着树突状细胞(DCs)瘤苗的抗瘤应用研究的开展,DCs已成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一,本文将对DCs介导的以p53为靶向的肿瘤免疫治疗作一综述.
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吲哚胺2，3双加氧酶与调节性T细胞诱导移植免疫耐受的研究进展
如何有效克服移植排斥反应、成功诱导移植免疫耐受是目前器官移植领域面临的大难题。免疫抑制剂仍然无法解决移植物的慢性排斥问题，需终身服用且有较大的毒副作用［1］。移植免疫耐受是受体在无免疫抑制剂应用的情况下移植器官具有功能而不成为破坏性免疫攻击对象的状态。免疫应答过程包括一个高度抗原特异性的启动阶段和一个相对的非抗原依赖的效应阶段。为了有效地限制非特异性的破坏性效应，免疫系统发展了一系列的免疫调节机制。调节性T细胞（ regulatory T cell ， Treg）在这种调节机制中发挥了重要作用［2］。研究表明［3］，过表达细胞毒T淋巴细胞相关抗原（ cytotoxic T lymphocyte associate antigen-4，CTLA-4）的Treg激发树突细胞（dentritic cell，DC）表达有活性的吲哚胺2，3双加氧酶（ indoleamine 2，3-Dioxygenase， IDO）产生耐受性DC（tolerogenic DC，Tol-DC），进而诱导免疫耐受，提示在色氨酸分解代谢为基础上的IDO与Treg的相互调节作用可能是免疫耐受的关键介导因素之一。本文就IDO与Treg在诱导移植免疫耐受中的研究进展作简要综述。
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树突状细胞肿瘤疫苗的研究及实践进展
癌症是威胁全球人民健康的头号杀手之一，传统治疗手段（如手术、放疗、化疗）虽有进展，但癌症患者的预后仍不令人满意。发展新治疗策略仍迫在眉睫。由于树突状细胞疫苗为基础的免疫治疗能活化机体免疫细胞，通过识别肿瘤相关抗原特异性杀灭肿瘤细胞，而不伤及正常细胞，目前已经成为肿瘤治疗的一个热点。
