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乙肝病毒样颗粒在初始树突细胞进入I类和II类MHC抗原提呈通路
病毒样颗粒( VLP s )代表了有效地引发机体免疫的病毒蛋白的高密度展示方式,由乙肝病毒外膜蛋白组成的病毒样颗粒可以诱导机体的细胞免疫和体液免疫应答。然而,研究表明乙肝病毒外膜蛋白VLP s可以破坏树突细胞的功能。作者研究了乙肝病毒外膜蛋白VLP s和树突细胞亚类的相互作用及抗原在树突细胞中通过主要组织相容性I类和II类抗原呈递途径的提呈状况。在体外试验针对 CpG的应答中,乙肝病毒外膜蛋白VLP s降低了浆细胞样树突细胞的α-干扰素的产生,但是在体内给予CpG情况下,不会损坏普通树突细胞或浆细胞样树突细胞的表型。为了评估细胞免疫应答,制造了含有卵白蛋白( OVA )模式表位的乙肝病毒外膜VLPs,OVA 抗原表位(257~264)和 OVA (323~339)分别是通过MHC I类和II类抗原呈递途径提呈的。乙肝病毒外膜蛋白VLP-OVA (157~264)在体内能被CD8+树突细胞交叉提呈,但不会被CD8-树突细胞提呈。因此,乙肝病毒外膜蛋白VLP s可在原发树突细胞和启动的细胞毒细胞以及协助性T细胞中通过MHC I和MHC II类抗原呈递途径进行提呈。
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利用工程树突细胞定向的纳米颗粒增强免疫应答的简单策略
在这项研究中，作者证实了一种简单的能够增强免疫应答的策略，这种策略是使用两组分树突细胞定向抗原投递系统。一种组分是由用于树突细胞导向的双功能性融合蛋白所构成，另一组分是由生物素化的PLGA纳米颗粒（ NPs）制备而成，用来包裹抗原。由截短的与抗-DEC-205单链抗体（ scFv ）相融合的核心链霉抗生物素蛋白构成的融合蛋白与荷载卵白蛋白的生物素化的NP s相混合（这种生物素化的NPs是使用生物素-PEG （2000）-PLGA配制而成）。融合蛋白功能化NP s被用于树突细胞定向性抗原投递。在体外树突细胞摄取研究中结果表明，当与非定向的NP s进行比较时，显示出高2倍的受体介导性融合蛋白功能化 NPs 的摄取结果。用融合蛋白功能化NPs 免疫并受树突细胞成熟刺激（抗CD40单抗）的小鼠增强了卵白蛋白特异性IgG和IgG亚类应答。这些小鼠的脾细胞当在体内用卵白蛋白再行刺激时则产生了更高水平的Th1型（γ干扰素和IL-2）细胞因子应答。融合蛋白功能化树突细胞定向系统的这种令人振奋的结果支持了可以将其作为一种通用的疫苗投递系统加以应用，以期用来设计单价或多价疫苗。
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MUTZ-3树突细胞对B型流感嗜血杆菌结合疫苗组分的应答
对于疫苗注册和批签发而言,疫苗效力测定应该是指令性进行的,由于体内效力测定受到各种各样因素的限制,因此有必要采用相关的体外替代效力测定.这些替代试验应当好包括来源于目标(人类)种系的细胞,针对人体体内发生的因免疫接种导致的一系列免疫应答是不可能通过使用单一细胞类型就可测定出来的,即使树突细胞能成为一种重要的候选细胞类型(由于它们在诱导和调节免疫应答方面起关键性作用).
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树突细胞和Toll样受体的发现与疫苗的研制
2011年,由于在免疫学研究领域的开创性的研究,Ralph Steinman,Jules Hoffmann和Bruce Beutler获得了诺贝尔生理学医学奖.Ralph Steinman发现了树突细胞及其主要功能；Jules Hoffmann和Bruce Beutler发现Toll样受体在固有免疫应答中的作用.他们的工作改变和丰富了人们对固有免疫应答和获得性免疫应答的认识,也对新型疫苗及佐剂的研究产生了巨大的推动作用.
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CpG 加入脂质体疫苗配方的效果
已经证明，脂质体疫苗配方中含有靶向天然免疫受体的刺激物会明显增加疫苗的免疫力。疫苗接种后，天然细胞群对免疫刺激物发生反应、吞噬和加工抗原，通过淋巴输入管道从注射点进入局部淋巴结。在这样的终端接受到的信号推动并塑造适应性免疫应答。然后效应淋巴细胞通过淋巴输出管离开淋巴结以执行其系统功能。作者直接将导管插入绵羊的淋巴管以详细研究疫苗用加入了 CpG 的基于脂质体投递系统接种后，在局部淋巴引流网络中发生的天然与适应性免疫应答，作者证明，CpG 诱导快速的中性粒细胞募集，提高树突细胞相关性抗原的输送，并影响加入输入淋巴的天然细胞的成熟作用，这转化成淋巴结封闭亦即 IFN－γ阳性 T 细胞诱导时间的延长和提高了 Ag 特异性 Abs 的生产。总结起来，此研究的结果可量化大动物模型中，在接种与人相似剂量的疫苗后免疫应答的体内实时动力学，此研究详细说明了许多免疫机理的强化，这些免疫机理是解释 CpG 当其用作为疫苗内佐剂时的免疫原性功能的理由。
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高迁移率族蛋白B1对大鼠脾脏树突状细胞表面共刺激分子表达的影响
目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子表达的影响,并对其机制进行初步探讨. 方法 分离正常Wistar大鼠脾脏DC后置于96孔培养板(1×105/孔),采用HMGB1刺激,观察HMGB1刺激与DC表面共刺激分子CD80、CD86和主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ表达的时间-效应关系及剂量-效应关系. 结果 HMGB1刺激后,DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达分别于24～72 h明显上调(P＜0.05,0.01),其中以作用48 h后DC表面共刺激分子表达上调尤为显著(P＜0.01);0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的HMGB1刺激均可诱导DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达增强(P＜0.05,0.01),其中HMGB1的浓度在1μg/ml时,大鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达增强明显(P＜0.01). 结论 HMGB1能诱导DC表面共刺激分子表达增强,HMGB1可能是诱导DC成熟的免疫刺激信号.
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小鼠趋化因子受体7重组慢病毒感染对DC2.4细胞免疫原性和迁移功能的影响
目的 观察含有趋化因子受体7(CCR7)基因的重组慢病毒感染树突细胞(DC)株DC2.4细胞,对其免疫和迁移功能的影响. 方法 常规培养DC 2.4细胞,构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的空载慢病毒和带有上调CCR7基因的慢病毒.按照随机数字表法将细胞分为3组:DC 2.4组(DC2.4细胞未经任何处理)、GFP-DC 2.4组(用GFP空载慢病毒感染DC 2.4细胞)和CCR7-DC2.4组(用GFP标记CCR7上升基因的慢病毒感染DC 2.4细胞).流式细胞术、蛋白质印迹法、激光扫描共聚焦显微镜分别观测各组细胞表面分子组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)、CD80、CD86、CCR7的表达,体外趋化实验检测细胞迁移功能的变化；混合淋巴细胞反应检测各组细胞免疫功能的差别,另设LPS-DC 2.4组作为阳性对照.对数据进行单因素方差分析和t检验. 结果 成功构建表达稳定的慢病毒,感染DC 2.4细胞的效率为87.4％.流式细胞检测结果显示,3组之间MHCⅡ、CD80及CD86的表达差异无统计学意义(F值为0.17～1.19,P值均大于0.05).CCR7-DC 2.4组CCR7蛋白表达量为45.1 ±2.1,明显高于DC 2.4组的25.3±1.4和GFP-DC 2.4组的28.6±0.9(F=162.90,P ＜0.01)；后2组之间比较,差异无统计学意义(t=2.20,P＞0.05).激光扫描共聚焦显微镜显示,CCR7-DC 2.4组较DC 2.4组CCR7荧光强度明显升高.CCR7-DC 2.4组细胞体外趋化迁移率为(41.0±2.0)％,明显高于DC 2.4组的(6.0±0.5)％和GFP-DC 2.4组的(6.8±0.3)％(F=84.21,P ＜0.01)；后2组之间比较,差异无统计学意义(t=0.45,P＞0.05).混合淋巴细胞反应显示,DC2.4、GFP-DC 2.4、CCR7-DC 2.4及LPS-DC 2.4组吸光度值分别为1.6±0.4、1.9±0.4、1.7±0.4、3.8±0.4,前3组之间差无统计学意义(F =1.56,P＞0.05),LPS-DC 2.4组对T淋巴细胞刺激能力明显高于其他3组(t值为1.53～1.82,P值均小于0.01). 结论 成功构建能高效表达CCR7的DC 2.4细胞对CCL19有较高的趋化性且对免疫功能无明显影响.
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脐血来源未成熟树突状细胞低温冻存的实验研究
目的 观察脐血来源的未成熟树突状细胞(imDC)低温冻存前后的生物学特性,探讨imDC的保存方法.方法 取新鲜脐血分离单个核细胞(MNC),在体外经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素(rhIL)4诱导产生imDC后,加入二甲亚砜(DMSO)作为保护剂,-80℃降温,-196℃保存,40℃水浴复温,获得冻存imDC.光学显微镜下观察冻存的imDC与新鲜imDC形态,计算其锥虫蓝拒染回收率(TBR);流式细胞仪检测细胞表面成熟标志;混合淋巴细胞反应(MLR)检测细胞刺激未致敏T淋巴细胞的增殖能力.结果 脐血MNC在rhGM-CSF和rhIL-4诱导下可向树突状细胞(DC)分化,相差显微镜显示细胞形态不规则,细胞表面呈树枝样突起;扫描电镜显示,细胞表面不规则,有树枝样突起和不规则皱褶.冻存imDC复苏后TBR为(86.8±1.3)%,冻存imDC在形态上与新鲜imDC无明显差异.MNC体外经rhGM-CSF和rhIL-4诱导生成的imDC表面CD1a阳性率为(62±8)%、CD14为(18±7)%、人类白细胞DR抗原(HLA-DR)为(67±5)%、CD80为(13±7)%、CD86为(12±5)%;反映DC成熟的表面标志物CD83为(4.6±2.0)%,符合imDC的表型特征.冻存imDC的CD80、CD86、CD83分别为(15±5)%、(17±5)%、(7.4±3.3)%,较新鲜imDC有所增高(P＜0.05),但仍符合imDC的表型特征.对照组MLR的每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值为(488±197)min-1;新鲜imDC组为(463±104)min-1,与冻存imDC组的cpm值(512±78)min-1比较,差异无统计学意义(P＞0.05).各组细胞刺激指数(SI)均＜2.新鲜imDC和冻存imDC均不能有效刺激同种未致敏T淋巴细胞增殖.结论 本实验中获得的冻存imDC具有足够的细胞活力,其细胞免疫表型和细胞功能具有不成熟特征,说明利用DMSO低温保存imDC的方法可行.
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腺病毒载体转染人未成熟树突状细胞对其成熟特性的影响
目的 观察重组腺病毒载体AdEASY-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人未成熟树突状细胞(imDC)后,其表型特征及免疫学功能的变化,并探讨白细胞介素(IL)10对腺病毒转染诱导imDC成熟的抑制作用.方法 贴壁法分离人脐带血来源的单核细胞,利用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导分化imDC.对照组为常规培养的imDC,转染组用AdEASY-EGFP转染imDC,IL-10组用IL-10处理转染后细胞.流式细胞仪检测细胞表面成熟标志[CD86、CD83和人类白细胞DR抗原(HLA-DR)],混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种异体未致敏T淋巴细胞的增殖能力.结果 腺病毒转染imDC后,转染组细胞成熟表型表达率分别为CD86:46±10、CD83:38±7、HLA-DR:82±10,均较对照组(10±7、8±3、68±8)显著上调,且刺激T淋巴细胞增殖的能力显著加强(SI＞2.0).IL-10组处理的imDC上述表型表达率分别为CD86:8±5、CD83:9±3、HLA-DR:63±12,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),其刺激T淋巴细胞增殖的能力也明显下降.结论 腺病毒能有效转染imDC,但在转染后有促进其成熟的趋势;用IL-10能有效抑制该成熟状态.
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负载异体抗原对低剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子诱导的树突状细胞免疫学性状的影响
目的观察低剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱生的未成熟树突状细胞(GMlowDC)对异体抗原的摄取能力,以及负载异体抗原后细胞表型和功能的改变.方法对处于增殖期的C57BL/6小鼠单个核细胞(MNC)作氚标记亮氨酸(3H-Leu)掺入处理,制备3H-Leu标记的抗原上清液.将此抗原上清液分别与昆明小鼠GM lowDC和成熟树突状细胞(DC)孵育30、60、90 min,检测细胞每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值;用流式细胞仪检测负载异体抗原前后GMlowDC表面IA/IE、CD80分子的表达情况.分离C57BL/6小鼠的T淋巴细胞,根据加入的刺激因素分组并进行同种混合淋巴细胞反应(MLR):对照组(不加刺激因素)、GMlowDC组、GMlowDC+异体抗原组、GMlowDC+异体抗原+细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Ig(CTLA-4Ig)组.检测各组细胞cpm值,计算刺激指数(SI).结果加入异体抗原上清液后30、60、90 min,GMlowDC的cpm值均明显高于同时相点的成熟DC(P＜0.05或0.01).负载异体抗原前,GMlowDC细胞表面IA/IE的表达率为(32±8)%,CD80的表达率为(25±10)%;负载后两者分别为(54±10)%、(71±18)%,均明显升高(P＜0.05或0.01).MLR:GMlowDC+异体抗原组细胞cpm值明显高于对照组(P＜0.05),SI＞2.0;GMlowDC组以及GMlowDC+异体抗原+CTLA4Ig组细胞cpm值与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),SI均＜2.0.结论GMlowDC具有较强的抗原摄取能力,负载抗原后,细胞在表型及功能上渐趋成熟.应用CTLA-4Ig可阻断其免疫应答效应,建立免疫耐受.
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脂质体介导的基因转染对人未成熟树突状细胞成熟特性的影响
目的探讨脂质体介导的基因转染对人未成熟树突状细胞(imDC)表型特征及免疫学功能的影响.方法贴壁法分离人脐血来源的单核细胞,用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4将其诱导分化为imDC后,进行形态学观察和免疫表型鉴定,并将其分为转染组和对照组.转染组将pEGFP-N1质粒通过脂质体转染imDC;对照组不作特殊处理.流式细胞仪检测此法的转染率和两组细胞表面分子[CD86、CD83、人类白细胞DR抗原(HLA-DR)等]的表达率;混合淋巴细胞反应(MLR)检测imDC在转染前后刺激未致敏T淋巴细胞增殖的能力.结果人脐血来源的imDC形态结构和表面标志符合文献报道的典型特征.脂质体介导的基因转染法转染率约在10%左右.转染组CD86、CD83和HLA-DR的表达率分别为(12±6)%、(8.6±2.3)%和(71±7)%;对照组分别为(13±6)%、(9.1±3.8)%和(72±8)%,两组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).MLR提示imDC转染后其免疫刺激功能较转染前无明显变化(P＞0.05),刺激指数＜2.结论脂质体介导转染imDC后不影响其成熟特性,但转染率不高.
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第三方未成熟树突状细胞负载异体抗原诱导免疫耐受的实验研究
目的观察第三方未成熟树突状细胞(imDC)负载同种异体抗原后对其免疫特性的影响.方法从健康足月新生儿脐血中分离单核细胞,采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-SCF)和重组人白细胞介素(rhIL)4联合培养7 d,诱导其分化成imDC,并通过光学显微镜和扫描电镜观察细胞形态、检测细胞表型及混合淋巴细胞反应(MLR);将培养的细胞与异体淋巴细胞抗原共同孵育,并给予共刺激分子阻断剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)处理,检测抗原负载前后的细胞表型变化,通过MLR比较致敏前后T淋巴细胞增殖的能力.结果(1)培养后细胞具有典型的imDC特征,CD1α、CD83、CD80、CD86等成熟标志呈低表达,分别为21.42%、0.59%、5.39%、3.85%;人类白细胞DR抗原(HLA-DR)的表达率为60.66%,MLR结果提示其不能刺激同种异体T淋巴细胞增殖.(2)负载抗原后的DC表现出成熟特性,CD1a、CD83、CD80、CD86及HLA-DR表达明显增高,分别为65.51%、42.20%、56.45%、38.52%、76.44%(P＜0.05);能够刺激T淋巴细胞增殖[刺激指数(SI)＞2.00].(3)给予共刺激阻断剂CTLA-4Ig致耐处理后,SI由2.51下降到0.39,可明显抑制T淋巴细胞增殖.结论第三方imDC负载抗原后能表现出成熟特性;经CTLA-4Ig致耐处理,不能刺激未致敏T淋巴细胞增殖.有望诱导受体针对供者抗原的特异性免疫耐受.
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黄芪多糖对分泌白细胞介素12树突细胞亚群的免疫调控效应与机制
目的 观察黄芪多糖(APS)对分泌IL-12树突细胞(DC)亚群CD11chighCD45RBlowDC功能的影响.方法磁珠分选技术获得BALB/c小鼠脾脏CD11chighCD45RBlowDC和CD4+T淋巴细胞.在CD11 chighCD45RBlowDC中加入不同浓度APS(50、100、200μg/mL)处理,以不加APS的细胞作为对照,应用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12水平,流式细胞仪检测细胞表面分子CD40、CD80、CD86、I-A/E及Toll样受体4(TLR4)的表达.将CD4+T淋巴细胞分为正常对照组(未行任何处理)、未刺激组(加入未经APS处理的CD11chighCD45RBlowDC与CD4+T淋巴细胞混合培养)、高浓度APS刺激组(加入经200μg/mL APS处理后的CD11chighCD45RBlowDC与CD4+T淋巴细胞混合培养)、高浓度APS刺激+抗体1组(加入经200μg/mL APS处理后的CD11chighCD45RBlowDC、IL-12抗体与CD4+T淋巴细胞混合培养)和高浓度APS刺激+抗体2组(加入经200 μg/mL APS处理后的CD11chighCD45RBlowDC、IL-12同型对照抗体与CD4+T淋巴细胞混合培养).采用噻唑蓝法测定CD4+T淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞培养液中IL-4和γ干扰素水平.对数据行多组间单因素方差分析.结果与未加APS刺激相比,3种浓度APS均显著增强CD11chighCD45RBlowDC表面分子CD40、CD80、I-A/E及TLR4表达及IL-12分泌,其中IL-12分泌呈APS浓度依赖性;CD86表达无明显变化.高浓度APS刺激组CD4+T淋巴细胞增殖能力高于未刺激组(F=13.438,P＜0.05);高浓度APS刺激组细胞γ干扰素水平为(2784±137)pg/mL,高于未刺激组[(1952±101)pg/mL,F=12.177,P＜0.05];高浓度APS刺激组细胞IL-4水平为(172±20)pg/mL,明显低于未刺激组[(193±19)pg/mL,F=11.963,P＜0.05].高浓度APS刺激+抗体1组前述3项指标表达水平较未刺激组明显改善,高浓度APS刺激+抗体2组前述3项指标表达水平与高浓度APS刺激组接近.结论 APS能够通过促进CD11chighCD45RBlowDC中IL-12的表达,诱导CD4+T淋巴细胞向Th1型反应分化,通过激活CD11chighCD45RBlowDC增强免疫活性.
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西罗莫司对创伤小鼠脾脏树突状细胞诱导T淋巴细胞应答能力的影响
目的 了解西罗莫司对创伤小鼠脾脏树突状细胞(DC)诱导异源性T淋巴细胞应答能力的体外调节作用.方法 将24只BALB/c小鼠按随机数字表法分为对照组与创伤组,每组12只.将创伤组麻醉后造成失血合并闭合性骨折,对照组仅麻醉不致伤,24 h后分离2组小鼠脾脏DC.将2组DC分为西罗莫司阴性对照组和创伤组(不用西罗莫司处理),以及西罗莫司阳性对照组和创伤组(用10μg/L西罗莫司处理6 h).检测各组DC自噬活性(用荧光强度值表示)及DC介导的混合淋巴细胞反应(MLR)变化(用吸光度值表示).流式细胞仪检测细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ与共刺激分子CD40、CD80、CD86表达.用ELISA法检测LPS刺激后DC中IL-12p40、IL-12p70和IL-10的水平.对数据进行单因素方差分析.结果 (1)西罗莫司阴性创伤组小鼠脾脏DC自噬活性(荧光强度值为13±2)及其介导的MLR强度均较西罗莫司阴性对照组(荧光强度值为22±6)明显减弱(F=212.836,P<0.05).与西罗莫司阴性对照组和创伤组比较,西罗莫司阳性对照组和创伤组自噬活性(45±8、44±8)均明显增强(F=212.836,P<0.05或P<0.01).西罗莫司阳性创伤组MLR强度较西罗莫司阴性创伤组明显增强(F值分别为101.426、86.533,P值均小于0.05).(2)西罗莫司阴性创伤组小鼠脾脏DC表面的MHCⅡ[(60±9)%]及CD40[(4±1)%]表达较西罗莫司阴性对照组[(85±6)%、(8±1)%]明显降低(F值分别为37.918、40.426,P值均小于0.05),西罗莫司阳性创伤组MHCⅡ表达[(78±7)%]较西罗莫司阴性创伤组明显提高(F=37.918,P<0.05).(3)两罗莫司阴性创伤组小鼠脾脏DC的IL-12p40、IL-12p70表达水平[(120±13)、(10±3)pg/mL]较西罗莫司阴性对照组[(200±25)、(20±6)pg/mL]明显降低(F值分别为218.646、310.253,P值均小于0.05);与西罗莫司阴性对照组和创伤组比较,西罗莫司阳性对照组和创伤组IL-12p40[(560±34)、(540±29)pg/mL]、IL-12p70[(55±8)、(60±11)pg/mL]表达水平均明显提高(F值分别为218.646、310.253,P值均小于0.01),IL-10表达水平降低(F=246.108,P<0.01).结论 西罗莫司在体外可部分改善创伤小鼠DC功能,并提高其诱导T淋巴细胞的应答能力.
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携带供者抗原的第三方树突状细胞诱导小鼠皮肤移植耐受的研究
目的 了解携带供者抗原的第三方树突状细胞(DC)是否具有与供者源未成熟DC相似的免疫功能.方法 雌性C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠和昆明小鼠分别为皮肤移植的供者、受者和第三方.将40只BALB/c小鼠分为对照组、环磷酰胺组、供者源未成熟DC组、第三方未成熟DC组、携带供者抗原第三方DC组,每组8只.后4组大鼠皮肤移植术前4 d用环磷酰胺(200 mg/kg)预处理,对照组同法给予等量等渗盐水.后3组术前2 d用1 ml相应DC悬液(1×107个/ml)预处理,并在术后12 d重复给予1 ml DC悬液(1×107个/ml)1次;前2组于上述2个时相点同法给予等量等渗盐水.记录各组皮片平均成活时间(MST)并于术后5 d对皮片进行组织学观察.结果 与对照组(16.1±3.5)d比较,供者源未成熟DC组和携带供者抗原第三方DC组小鼠移植皮片的MST明显延长,分别为(38.3±7.7)、(34.9±7.7)d(P＜0.01);携带供者抗原第三方DC组与供者源未成熟DC组皮片的MST相近(P＞0.05),但与第三方未成熟DC组(23.7±2.7)d比较,差异有统计学意义(P＜0.05).镜下见携带供者抗原第三方DC组移植皮片结构较清楚、排列有序,与供者源未成熟DC组情况相近.结论 携带供者抗原的第三方DC与供者源未成熟DC,均可在一定程度上建立抗原特异性免疫耐受.
关键词： 树突细胞 皮肤移植 免疫耐受 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 -
低剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子诱导的小鼠骨髓未成熟树突状细胞抗成熟特性的研究
目的观察内毒素/脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)等促成熟物质对低剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)诱导的小鼠骨髓未成熟树突状细胞(DC)成熟特性的影响.方法制备小鼠骨髓细胞,分别用不同剂量rmGM-CSF培养,6 d后收集悬浮细胞进行检测.用LPS、TNF-α、IFN-γ与小剂量rmGM-CSF培养获得的DC(GMlowDC)共同孵育3 d后,行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏脾淋巴细胞增殖的情况,并与大剂量rmGM-CSF培养获得的DC(GMhighDC)进行比较. 结果GMlowDC不能激活未致敏脾淋巴细胞,且在与LPS、TNF-α和IFN-γ共同培养3 d后,仍不能有效诱导未致敏脾淋巴细胞增殖,刺激指数(SI)均《2.00;而GMhighDC刺激未致敏脾淋巴细胞增殖的能力较强,SI为4.71. 结论GMlowDC具有对LPS、TNF-α和IFN-γ刺激不敏感的抗成熟特性.
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小鼠骨髓未成熟树突状细胞体外扩增及鉴定
目的建立体外大量扩增小鼠未成熟树突状细胞(DC)的方法,从形态学、免疫表型和细胞功能试验等方面予以鉴定. 方法制备小鼠骨髓细胞,分别用不同剂量重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)培养,7 d后收集悬浮细胞进行扫描电镜观察和免疫表型鉴定,并行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T淋巴细胞增殖的情况. 结果小剂量rmGM-CSF培养获得的DC(GMlowDC)具有DC的典型特征,细胞表面高表达CD11c,低表达CD40、I-A/I-E, 不表达B7-1,与大剂量rmGM-CSF培养获得的DC(GMhighDC)相比,其体外刺激未致敏T淋巴细胞增殖的能力较弱. 结论本实验中获得的GMlowDC形态上具有DC的典型特征,在细胞表型、细胞功能试验上具有未成熟的特性,说明所建立的培养未成熟DC的方法是可行的;rmGM-CSF的剂量与细胞的成熟程度相关,一般说来,较大剂量的rmGM-CSF诱导生成的细胞以成熟DC为主,小剂量rmGM-CSF诱导生成的细胞以未成熟DC为主.
关键词： 树突细胞 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 细胞 培养的 免疫耐受 -
雷公藤多甙与白介素-10对人外周血树突细胞的影响
目的：体外研究雷公藤多甙与白介素-10(IL-10)对人外周血树突细胞表面HLA-DR、CD80抗原表达及IL-12 p40蛋白表达和mRNA转录的影响.方法：采用GM-CSF、IL4和TNFα体外培养体系获得人外周血树突细胞(DC)，HLA-DR和CD80抗原的表达经免疫荧光染色后采用流式细胞仪进行分析，用酶联免疫吸附测定和逆转录聚合酶链反应分别检测IL-12p40蛋白水平和mRNA的转录.结果：雷公藤多甙5-20 mg/L显著下调HLA-DR和CD80抗原的表达，IL-10 50-200 μg/L能抑制HLA-DR和CD80抗原的表达，并都具有剂量依赖关系；雷公藤多甙5-20mg/L和IL-10 50-200μg/L均能抑制DC分泌IL-12p40蛋白，同时经雷公藤多甙20 mg/L和IL-10 200μg/L处理的DC中IL-12 p40 mRNA的表达受到显著抑制.结论：雷公藤多甙和IL-10能通过抑制DC表面分子的表达和IL-12的合成而发挥免疫抑制作用.
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稳定表达人GM-CSF和IL-4EA.hy926细胞株建立及对DC诱导作用
目的 获得分别能稳定表达人白细胞介素4(IL-4)和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的内皮细胞株,并用于树突状细胞(DC)的体外诱导培养.方法 构建重组的慢病毒表达载体,在293T细胞中进行慢病毒的包装,用获得的高滴度的慢病毒感染内皮细胞EA.hy926细胞株,建立能够高效、稳定表达IL-4和GMCSF的EA.hy926细胞株.结果 EA.hy926细胞株感染效率达90％以上,长期传代仍能保持较高阳性率.RTPCR在mRNA水平上检测目的基因有表达；ELISA和Western方法证实感染后细胞IL-4、GM-CSF在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的80倍和143倍.感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验.结论 构建的细胞系可以稳定表达细胞因子IL-4和GM-CSF.
关键词： 树突细胞 转染 白细胞介素4 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 -
抑制MCF-7乳癌细胞VEGF表达对树突细胞免疫功能影响
目的 探讨抑制MCF-7乳癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达对树突细胞(DC)免疫功能的影响.方法 针对VEGF基因设计小干扰RNA(siRNA),以脂质体转染法将 siRNA导入乳癌细胞MCF-7,RT-PCR 检测干扰VEGF基因后mRNA的表达,Western blotting法检测VEGF蛋白的表达,观察VEGF基因沉默效果.以MCF-7 乳癌细胞的培养上清和干扰VEGF基因后MCF-7 乳癌细胞培养上清液同时添加粒-单细胞集落刺激因子、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子α培养正常异基因DC,利用MTT法和Hoechst33258检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;ELISA法检测DC培养上清液中白细胞介素12(IL-12)及DC与外周血单个核细胞(PBMC)共同培养液中干扰素γ(IFN-γ)的含量.结果 VEGF基因经siRNA处理24 h后,MCF-7 乳癌细胞VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低,其诱生的DC与MCF-7 乳癌细胞培养上清液诱生的DC相比, siRNA处理DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血PBMC分泌INF-γ的能力明显增强.结论 siRNA可靶向抑制乳癌MCF-7 细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清液对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低.
