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大鼠肝硬化与肝再生的基因表达谱比较分析
目的 了解肝硬化(LC)与肝再生(LR)的相关性.方法 取成年SD雄性大鼠24只,每组6只,用CCl4诱导方法 建立大鼠LC模型;将114只SD雄性大鼠随机分为19组,包括9个部分肝切除组,9个假手术组和1个正常对照组,用2/3肝切除手术建立LR模型.用大鼠全基因组表达谱芯片Genome 230 2.0检测大鼠LC发生与大鼠LR中肝组织的基因表达谱,用生物信息学和系统生物学等方法 分析基因表达谱预示的生理活动的异同,并用定量PCR证明芯片检测结果 的可靠性.结果 LC发生中304个基因和LR中948个基因发生了有意义表达变化,其中121个基因为两者共有,183个基因为LC特有,827个基因为LR特有.H-clustering分析表明,LC和LR的生理活动未显示时间上的相关性.K-means聚类分析显示,LC和LR的C1～C5组基因表达趋势相似,C6组相反,但LR的变化更为丰富.应用基因本体论(GO)分类和功能聚类分析发现,在LC和LR中,免疫反应、炎症反应、细胞迁移、细胞黏附等生理活动增强,各种物质代谢活动减弱.其中,LC的刺激反应在C2强于肝再生,在C6弱于肝再生,而DNA修复、细胞增殖、脂类代谢、内环境稳态和氧化应激等均弱于肝再生.结论 LC与LR的基因表达变化和生理活动有共同方面,也有差异之处.
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调控肝再生的基因和生长因子的研究进展
肝脏是哺乳动物具有很强再生能力的器官.随着分子生物学理论和实验技术的不断发展,尤其是1931年Higgins和Anderson建立了大鼠2/3肝切除模型后,人们可以在实验肝脏学基础上研究肝再生的分子机理,极大地促进了有关研究的发展[1].现在知道,肝再生涉及到细胞的激活、去分化、增殖、再分化、组织结构和功能重建等不同阶段,且每个阶段的进程都受到严格调控.与之有关的基因、生长因子和蛋白质等也在不断地被发现和鉴定,我们在本文中就与肝再生有关的基因和生长因子作一简要介绍.
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胰岛再生源蛋白与肝脏疾病和肝再生
胰岛再生源蛋白(Reg)是相对分子质量为16kD的分泌型蛋白,属于C类凝集素超家族成员.Reg蛋白是1个多功能分子,主要参与调控胰腺、胃、肠和肝脏中细胞的生长和增殖,在消化性疾病及癌症的发展和预后中发挥重要作用.我们主要综述了Reg对肝脏疾病和肝再生调控的研究进展,包含其在消化性疾病中介导的信号通路,为开展Reg在相关疾病诊疗及促进肝再生中的应用研究提供重要理论基础.
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microRNAs在肝再生中的作用研究进展
目的 microRNAs是一类非编码蛋白的小RNA分子,通过与靶基因mRNA 3'端的非编码区(3'UTRS)结合而在转录后水平调控基因表达,调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡、器官发育等生物学过程.肝脏有很强的再生能力,是研究再生的重要材料.因此,我们在文中总结了microRNAs对肝再生调节作用的研究进展.
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生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45α在肝再生及肝病中的研究进展
生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45α(GADD45α)是一种应激诱导蛋白,它可诱导Gadd45α基因的表达.GADD45α在再生肝及肝硬化、肝癌、肝衰竭等肝病中表达显著上调,与多种肝病发生发展及预后密切相关.GADD45α蛋白通过与其他蛋白相互作用,在调控细胞周期、维持基因组稳定、诱导细胞凋亡等方面发挥重要作用.以下我们综述了GADD45α与肝再生关系的研究进展,为进一步了解肝再生与肝脏疾病的发生机制以及治疗和预防肝病奠定基础.
关键词： 肝再生 生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45α DNA损伤修复 细胞增殖 -
趋化因子2促进肝再生中脂肪的形成
目的 探讨趋化因子2(CCL2)对肝再生的影响以及作用机制.方法 大鼠随机分为3组,每组10只.液压转基因技术将质粒转入大鼠体内,6h后荧光显微镜下观察转染效率.称量再生肝重量,计算肝再生率和肝脏指数以观察肝脏再生情况.测量血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)与总胆红素(TBIL)的含量以评估肝脏功能情况.苏丹Ⅳ染色观测脂肪聚积情况.Real-time PCR检测脂肪代谢相关基因的表达.Western blotting检测磷酸化丝裂原细胞外激酶1/2(p-MEK1/2)和磷酸化细胞外信号调节激酶l/2(p-ERKl/2)的表达情况.结果 转质粒后6h各组绿色荧光蛋白表达量均大于30％.pEGFP-N1-CCL2转染组肝再生率、肝脏指数、ALT、AST和TBIL含量均高于pEGFP-N1组.随转基因时间延长,脂肪代谢相关基因表达量增加,有较多猩红色脂肪滴出现,p-MEK1/2和p-ERKl/2表达量增多.结论 趋化因子2可能通过MEK/ERK通路增加脂肪合成,促进肝脏再生.
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GZMA、GZMB、TSP-1、TLR和IL-15条细胞凋亡通路基因在肝再生中的表达变化
目的 探讨颗粒酶A(GZMA)、颗粒酶B(GZMB)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、Toll样受体(TLR)和白细胞介素-1(IL-1)5条细胞凋亡通路基因在肝再生(LR)过程中的表达变化.方法 大鼠随机分为33组,每组6只,用Rat Genome 230 2.0芯片检测大鼠部分肝切除(PH)后不同恢复时间点5条细胞凋亡通路基因的表达情况,采用Real-time PCR和Western blotting技术对芯片结果进行验证,并用生物信息学方法对凋亡通路基因在肝再生中的表达变化进行分析.结果Real-time PCR和Western blotting均与Rat Genome 230 2.0芯片的检测结果趋势一致;GZMA、GZMB、TSP-1、TLR和IL-15条细胞凋亡通路中9、8、24、31和34个基因与肝再生相关.它们主要在肝再生启动阶段起始表达,在细胞增殖阶段表达的基因数多.表达的相似性分为均上调、上调占优势、均下调、下调占优势、上调和下调相近等5类,大多数基因表达加强,少数基因表达降低.它们表达的时间相关性分为13组.基因协同作用模型(E,)分析表明,GZMA介导的细胞凋亡通路在肝再生后期促进细胞凋亡;TLR介导的细胞凋亡通路几乎均在整个肝再生中促进细胞凋亡;GZMB、TSP-1和IL-1介导的细胞凋亡通路可能在肝再生中不发挥细胞凋亡作用.结论GZMA和TLR两条通路调控肝再生中的细胞凋亡.
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大鼠肝再生中8种肝脏细胞的凝血反应相关基因转录谱预示的生理活动
目的 了解大鼠肝再生中8种肝脏细胞的凝血反应相关基因转录谱及其预示的生理活动.方法 大鼠再生肝8种细胞的分离,基因表达变化检测,预示的生理活动分析用Cluster等软件及生物信息学和系统生物等方法 进行,用Microsoft Excel等软件分析基因的表达模式. 结果 40个参与凝血反应的基因与肝再生相关,肝细胞、胆管上皮细胞、卵圆细胞、星形细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、陷窝细胞、树突状细胞的相应基因数为13、31、12、33、32、9、34、33.serpine1、a2m在上述8种细胞,vwf、klkb1在除库普弗细胞之外的7种细胞,其他基因在两种或两种以上细胞中发生有意义表达变化.上述基因转录谱预示,肝再生启动和进展阶段激肽释放酶和凝血酶原合成,凝血酶形成等活动增强.终止阶段纤维蛋白单体形成纤维蛋白聚合体等活动增强. 结论 大鼠肝再生与凝血反应密切相关.
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肝卵圆细胞的研究进展
肝卵圆细胞(OCs)是肝脏的干细胞,能够分化为肝细胞、胆管上皮细胞及其他细胞,亦与肝再生和肝脏疾病密切相关.本文简要地总结了近几年有关肝卵圆细胞的来源、定位、增殖、分化、凋亡、移植及在肝再生和肝脏疾病中作用等研究进展.
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肝星形细胞的研究进展
肝星形细胞(HSCs)是肝脏中具有储存脂质特别是维生素A、合成细胞外基质、调节肝窦微循环等功能的非肝实质细胞,它们与多种肝脏疾病,特别是肝纤维化密切相关.我们简要总结了近几年有关肝星形细胞的分离、鉴定、增殖及增殖调控、在肝再生、肝病等中作用的研究进展.
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JNK信号通路在大鼠肝再生及肝硬化的细胞增殖和凋亡中作用的比较
目的 从基因转录水平了解JNK信号通路在大鼠肝再生(LR)和肝硬化(LC)中的作用异同. 方法 采用2/3部分肝切除手术制备大鼠肝再生模型,以腹腔注射CCl4中性菜籽油溶液法建立大鼠肝硬化模型,采用大鼠Genome 230 2.0芯片检测不同时间点再生肝和肝硬化组织中JNK信号通路的基因表达谱,用生物信息学和系统生物学等方法分析基因表达谱预示的增殖和凋亡活动. 结果 JNK信号通路涉及302个基因和42条途径,大鼠Genome 230 2.0芯片含上述基因中的240个基因,其中,79个基因发生有意义表达变化,涉及LR的52个基因,LC的5个基因,有22个基因与两者相关.在大鼠LR启动阶段,途径1和16促进细胞增殖及途径22 ～ 33促进细胞凋亡作用强于对照；在进展阶段,途径1～17、34和35促进细胞增殖及途径22 ～33促进细胞凋亡作用强于对照,途径37～41抑制细胞凋亡作用弱于对照；在终止阶段,途径37、39、41和42诱导细胞凋亡作用弱于对照,同时,尚未发现途径18 ～ 21和36参与大鼠LR.而在LC发生中,JNK信号通路中的这些途径与对照相比均无显著差异.结论 JNK信号通路的37条途径调控大鼠肝再生的细胞增殖和凋亡,对大鼠肝硬化的调控作用则不显著.
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窖蛋白-1在细胞增殖和肝再生中的作用
窖蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是组成胞膜窖(caveolae)的主要功能蛋白.作为质膜上的独立结构,胞膜窖参与多种细胞活动,如胆固醇运输、信号转导以及细胞膜的组装等.通常,窖蛋白-1可以通过其N端的窖蛋白脚手架区(caveolin scaffolding domain,CSD)寡聚细胞外信号激酶(Erk1/2)的上游蛋白,抑制Erk1/2的活化,从而抑制细胞增殖和肿瘤转移.新近研究表明,窖蛋白-1通过促进甘油三酯的储存和利用而对肝再生起重要的调控作用.因此,窖蛋白-1可能是调控肝实质细胞增殖的关键蛋白.
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肝再生增强因子研究进展
肝再生增强因子是新近克隆的蛋白质因子，能特异地刺激肝源细胞的 增殖，并对CCl4所引起的急性肝衰竭有救治作用。本文综述了肝再生增强因子的发现、基 因克隆及组织分布等。目前已开始了该因子的基因工程产品研制，它有望成为一种治疗肝病 的 新药。
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体外不同比例再生肝细胞与结肠癌细胞的共培养
目的 观察体外与不同比例再生肝细胞共培养对结肠癌细胞增殖潜能及肝再生相关因子的影响.方法 70%肝切除大鼠模型术后24 h采用原位胶原酶灌流法分离获得有活性的再生肝细胞,分别以10:1(A组)、1:1(B组)与人结肠癌细胞株SW480共培养,对照组为单独培养的结肠癌细胞(C组).培养后第24和72 h,通过3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺人法比较各组培养后的增殖能力,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及肝细胞生长因子(HGF)的浓度.结果 培养后24 h 3组间3H-TdR掺人率和EGF、IGF-1、HGF的浓度差异无统计学意义(P>0.05),72 h A、B两组的3H-TdR掺入率(15.9±1.4,13.2±1.5)和EGF[(722.9±55.4)ng/L,(498.2±41.5)ng/L]、IGF-1[(755.2±35.7)ng/L,(538.1±37.5)ng/L]明显高于C组(P<0.05),且A组高于B组(P<0.05).HGF的浓度在培养后第24、72小时差异均无统计学意义(P>0.05).结论 与再生肝细胞共培养的结肠癌细胞增殖能力增强,其机制可能与来自于肝细胞内的生长信号增加结肠癌细胞EGF和IGF-1的表达有关.
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实验性肝坏死后再生肝窦内皮细胞的形态学观察及机制探讨
目的 探讨肝坏死后再生过程中肝窦内皮细胞的形态学变化及其再生机制.方法 Wistar雄性大白鼠60只,其中实验组为50只,非处理组及生理盐水组各5只作为对照组.实验组分10个小组,在一次性注射二甲基亚硝胺(DMN)50mg/kg后,分别于第12、24、36小时和第2、3、5、7、8、10及14天乙醚麻醉下处死,迅速取肝组织、骨髓及外周血.采用HE、免疫组织化学、双重免疫荧光标记方法通过光镜、电镜予以观察.结果 注射DMN后12 h肝组织内开始出现小灶状坏死,第24小时逐渐明显.第36小时坏死明显,并且坏死灶内浸润大量的ED-1(大白鼠单核细胞/吞噬细胞标记物)阳性细胞.注射后第2天和第3天,坏死组织碎片和红细胞被ED-1阳性的吞噬细胞吞噬消除.第5天,在肝组织坏死灶内一些单核细胞其形态由圆形转变成梭形.第7天,细胞与残存的网织纤维接触,并表达SE-1(大白鼠肝窦内皮细胞标记物)及Tie-1(内皮细胞特异性受体),此时常见ED-1/SE-1及ED-1/Tie-1双重阳性的梭形细胞.第8天,除了病变范围变小外,其肝组织形态相似于第7天.到第10天,增生的肝组织数量增加,充填坏死区.第14天坏死组织几乎完全被再生的肝及纤维组织所取代.注射DMN后12 h骨髓中ED-1阳性的单核细胞开始增生,其中部分细胞表达5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)/ED-1,并在36 h其数量达高峰.而这些细胞形态相似于骨髓中圆形单核细胞,其在第24小时至第10天出现于外周血中,高峰时间与骨髓相同.外周血中这些细胞的形状与肝组织坏死区内的ED-1阳性细胞相似.结论 注射DMN后圆形ED-1阳性单核细胞首先在骨髓内增殖,通过血液循环到达肝坏死区域,再分化为肝窦内皮细胞,即DMN介导的坏死区域的肝窦重建可能部分通过血管新生来完成.
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超声导引肝内乙醇注射术后动态观察及再生研究
目的 研究在超声导引下经皮乙醇注射(PEI)术后,肝功能恢复及周围肝脏组织是否存在再生及特点.方法 取SD大鼠40只,在超声引导下肝内注射无水乙醇0.1 ml,分别在第1、3、5、7 d取血,检测肝功能,并测定肝组织的有丝分裂指数(MI),增殖细胞核抗原(PCNA),细胞核DNA含量,通过流式细胞仪(FCM)分析S期细胞比率(S-phase cell ratio,SPR)变化.结果 PEI术后第1、3 d大鼠肝脏MI,SPR及PCNA和细胞核DNA含量均比术前明显增高(P＜0.05),并且在第3 d达到峰值,第5 d再生明显减弱.肝功能在术后第1 d升高明显,随后开始下降,第7 d恢复至术前水平.结论 PEI术后乙醇局限性扩散所致的肝细胞坏死,可促使其周围肝组织一定程度再生.
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肝再生研究中胆汁淤积性实验动物模型进展
肝脏具备强大的再生能力,它能在各种损伤因素致伤后部分或完全恢复肝脏结构并实现功能重建.这种肝再生理念构成了现代肝外科和肝病治疗的基础.在移植医学中,缩小体积的肝移植物、劈裂肝移植、还有活体肝移植就是基于术后受体的肝再生使肝体积增大并完成功能重建的[1-3].还有"肝桥概念(liver bridging)"已用于治疗急性肝衰,其意义就是进行暂时性的肝功能替代,如运用辅助性肝移植、肝细胞移植或人工肝辅助系统等手段,维持患者生命直到其自体肝完成再牛[4].
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围手术期肠内免疫营养对肝硬化大鼠肝切除术后机能的影响
目的探讨肝硬化大鼠行大部分肝切除术时围手术期合理充分的营养支持方案.方法将48只肝硬化大鼠随机分为标准肠内营养组(A组,n=24)和肠内免疫营养组(B组,n=24),根据标本采集时间的不同,各组再分为术前,术后1、4和8天4个亚组,每组6只.两组大鼠分别用等热量的标准肠内营养剂和肠内免疫营养剂喂养8天后行68%肝切除术,术后再喂养至取标本.分别于术前、术后第1、4和8天取相应亚组大鼠血和肝组织标本,检测T淋巴细胞亚群、血清IgG、血清IL-6和增殖细胞核抗原阳性肝细胞计数.结果B组术后第1天CD3、CD4、CD4/CD8和IgG的值,术后第4天CD4、CD/CD8和IgG的值,术后第8天CD4/CD8和IgG的值均显著高于A组(P＜0.05);B组术后第1、4天IL-6值显著低于A组(P＜0.05).两组大鼠术后残肝有一定再生能力,B组增殖细胞核抗原阳性肝细胞计数在术后第4和8天显著高于A组(P＜0.05).结论围手术期肠内免疫营养支持能减轻肝硬化大鼠肝切除术后免疫抑制,增强术后免疫功能,下调术后过度的急性炎症反应,还能增强残肝再生能力,使肝再生在术后较长时间内保持高水平.
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转化生长因子β在肝再生及肝纤维化中的作用
近年来，由于分子生物学和细胞生物学技术的飞速发展，对于肝纤维化的研究有了许多突破。这一病理过程中，细胞-细胞因子-基质之间相互作用，使肝脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)代谢紊乱，在狄氏间隙过度沉积，继之肝窦毛细血管化是形成肝纤维化的分子病理学基础［1］。在这一病理过程中起关键作用的物质是转化生长因子β(TFG-β)，它在肝纤维化形成过程中的作用日益受到重视。1 TGF β的生物学特征 TGF β是一组具有多种功能的蛋白多肽，它几乎参与了哺乳动物所有细胞的病理生理过程，依据靶细胞的不同而表现出促进或抑制细胞增殖分化作用，如它能刺激许多间质细胞增殖而抑制正常及恶性上皮细胞增殖，参与细胞分化的调节等从而对胚胎发生的调节具有重要的意义［2］。它还能调节免疫系统许多细胞的生成、分化及其功能，能抑制T、B淋巴细胞的增生和活性，抑制巨噬细胞的吞噬能力。在肝纤维化时它能刺激细胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、XVⅢ型等大多数胶原基因mRNA水平的提高或蛋白产物的增加，并能调节肝再生的能力。目前已经鉴定出5种不同分子类型的TGF β，即TGFβ1～5，在哺乳动物中存在3种形式的TGF β即TGF β1、2、3，它们位于不同的染色体上，其中TGF β1在体细胞中所占比例高，活性强，成为研究的热点。TGF β4、5则在非哺乳动物中出现。TGF β在合成初期是一个分子量较大的无活性的前体分子(latent TGF β)，后者受到病毒感染、炎症以及酸碱、蛋白酶等刺激后释放出112个氨基酸组成的成熟多肽，从而转化为有活性的TGF β。
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联合应用骨髓间充质干细胞与促肝细胞生长素治疗大鼠急性肝衰竭
目的 评价骨髓间充质干细胞(MSCs)和促肝细胞生长素(pHGF)联合治疗大鼠急性肝衰竭(ALF)的可行性.方法 将ALF造模成功的37只SD大鼠分为4组:CC14组(A组,9只),CCl4/MSCs(B组,9只),CC14/pHGF组(C组,9只)和CC14/pHGF+ MSCs组(D组,10只).用携带hrGFP基因的慢病毒感染MSCs(hrGFP-MSCs),并以hrGFP示踪.对C、D组大鼠给予CCl4,同时腹腔注射pHGF;B组和D组造模12h后肝内注射hrGFP-MSCs悬液.对各组大鼠分别在造模后24 h、72 h、7天检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平,造模后72 h检测血清IL-6、IL-10、TNF-α炎症因子水平,造模后24 h取肝组织行HE染色,造模72 h行PCNA免疫组化染色检测肝细胞增殖情况.造模后72 h后取注射部位肝组织行冰冻切片观察移植hrGFP-MSCs肝内分布情况,对非注射部位肝组织进行实时荧光定量RT-PCR检测hrGFP基因含量.结果 联合治疗后,ALF大鼠外周血ALT水平降低,IL 6、IL-10、TNF-α炎症因子水平下调,肝脏病理组织学损害减轻,肝细胞增殖率增高.造模后72 h,B组与D组注射部位肝组织内可见移植的hrGFP-MSCs,非注射部位肝组织未见hrGFP荧光阳性细胞,但用实时荧光定量RT-PCR技术可在非注射部位肝组织内检测到hrGFP基因,且D组含量高于B组.结论 pHGF与MSCs联合治疗大鼠ALF的疗效优于MSCs或pHGF单独治疗,可能与pHGF促使其肝内定植MSCs增多有关.
