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细胞共培养技术在医药研究中的应用
细胞共培养由于能更好地模拟体内环境,便于更好的观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能的作用靶点,填补了单层细胞培养与整体动物实验研究的鸿沟,近年来倍受医药领域的关注,成为药物研发、生物制药领域的研究热点.细胞共培养方法包括直接共培养和间接共培养,主要用于疾病病理基础、新型治疗手段以及药物活性筛选的研究.现有的细胞共培养技术主要用于单一药物的药效学研究,用于联合药物相互作用的研究甚少.中药复方之间协同配伍,减毒增效.细胞共培养技术符合中药多成分、多靶点的作用特点,这对于未来探讨中药联合用药对机体的作用及机制的研究具有一定参考价值,为中药及复方研究提供了一种新的手段.该文就细胞共培养技术的方法与运用进行了概述,并对该技术运用于中药及复方的研究进行了展望.
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体外不同比例再生肝细胞与结肠癌细胞的共培养
目的 观察体外与不同比例再生肝细胞共培养对结肠癌细胞增殖潜能及肝再生相关因子的影响.方法 70%肝切除大鼠模型术后24 h采用原位胶原酶灌流法分离获得有活性的再生肝细胞,分别以10:1(A组)、1:1(B组)与人结肠癌细胞株SW480共培养,对照组为单独培养的结肠癌细胞(C组).培养后第24和72 h,通过3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺人法比较各组培养后的增殖能力,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及肝细胞生长因子(HGF)的浓度.结果 培养后24 h 3组间3H-TdR掺人率和EGF、IGF-1、HGF的浓度差异无统计学意义(P>0.05),72 h A、B两组的3H-TdR掺入率(15.9±1.4,13.2±1.5)和EGF[(722.9±55.4)ng/L,(498.2±41.5)ng/L]、IGF-1[(755.2±35.7)ng/L,(538.1±37.5)ng/L]明显高于C组(P<0.05),且A组高于B组(P<0.05).HGF的浓度在培养后第24、72小时差异均无统计学意义(P>0.05).结论 与再生肝细胞共培养的结肠癌细胞增殖能力增强,其机制可能与来自于肝细胞内的生长信号增加结肠癌细胞EGF和IGF-1的表达有关.
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体外与肝细胞共培养对结肠癌细胞移行和增殖的影响
目的 探讨肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖能力的影响.方法 在体外建立结肠癌细胞与肝细胞三维共培养模型,将结肠癌细胞系Colon-26细胞培养在共培养系统上层,肝细胞培养在下层.实验分为3组:(1)Colon-26细胞与小鼠的肝细胞共培养(肝细胞组).(2)与成纤维细胞共培养(纤维细胞组).(3)Colon-26细胞单独培养(对照组).观察肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖的影响,以及共培养液内表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化.结果 肝细胞组的Colon-26细胞移行能力分别比纤维细胞组和对照组增强(t1=6.296,P=0.000;t2=5.322,P=0.000),Colon-26细胞增殖能力在肝细胞组亦分别比另两组增强(t1=3.905,P=0.005;t2=3.719,P=0.006).肝细胞组的共培养液中EGF浓度明显升高(z=3.077,P=0.002).结论 在体外能建立结肠癌细胞与肝细胞的三维共培养模型.体外肝细胞能通过分泌生长因子促进结肠癌细胞的移行和增殖.
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大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立
[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型.[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型.[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶--γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞问电阻.[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态.
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滑膜间充质干细胞与软骨细胞移植修复膝关节软骨缺损
背景:膝关节软骨损伤后修复较困难.有研究发现将关节软骨细胞和滑膜间充质干细胞混合培养接种于壳聚糖支架材料中,均可以形成软骨基质.目的:观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料对膝关节软骨缺损的修复情况.方法:将大鼠膝关节滑膜间充质干细胞及软骨细胞按1:2比例共培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中,将此复合材料移植于膝关节软骨缺损模型大鼠膝关节缺损处进行修复.结果与结论:①组织学变化:苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及番红O染色显示,植入后4,8,12周,大鼠膝关节软骨细胞逐渐增多;②软骨样组织标记物Ⅱ型胶原表达:免疫组织化学染色显示,移植后4,8,12周,大鼠膝关节软骨组织细胞及细胞基质可见Ⅱ型胶原阳性表达.③结果证实,滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中,在体内环境下能够形成软骨样组织,有利于损伤膝关节软骨缺损的修复.
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三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化
背景：体外环境下软骨细胞与滑膜间充质干细胞共培养能够使滑膜间充质干细胞向软骨分化，关于体内环境下细胞共培养诱导干细胞分化的研究很少。
目的：拟将滑膜间充质干细胞/软骨细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料植入大鼠背部皮下，了解细胞复合支架在体内向软骨分化的情况。
方法：取SD大鼠膝关节滑膜组织及软骨组织，用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。实验设单纯软骨细胞组，单纯滑膜间充质干细胞组，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞为1︰2组，无细胞材料组，取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中移植于SD大鼠皮下，4，8周时取材进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学检测。
结果与结论：植入4，8周后，细胞支架材料保持圆盘状，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞为1︰2组可见细胞及细胞基质Ⅱ型胶原阳性表达，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞为1︰2组蛋白聚糖阳性表达，结果表明两种细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中，在体内环境下能够形成软骨样组织。 -
共培养诱导人脐带间充质干细胞向纤维环样细胞分化
目的 通过体外共培养技术诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells, HUCMSCs)向纤维环(annulus fibrosus, AF)细胞分化,并探讨共培养后HUCMSCs形态学和组织学的变化.方法 取正常足月新生儿脐带及新西兰白兔,分别分离培养HUCMSCs和AF细胞.取第2代HUCMSCs和AF细胞,按1 ∶ 1比例利用Transwell 6孔培养板共培养.共培养2周后,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;实时荧光定量PCR法检测共培养组HUCMSCsⅠ型胶原、蛋白聚糖及SOX-9基因的表达;免疫细胞化学染色和甲苯胺蓝染色法检测Ⅰ型胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞基质的合成情况.结果 对照组HUCMSCs形态多呈长梭形,共培养后HUCMSCs形态逐渐变为短梭形或多角形,并开始出现细胞突触,出现类AF的形态特征;实时荧光定量结果显示,共培养HUCMSCs中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖及SOX-9基因相对表达量显著上调( P＜0. 05);共培养HUCMSCs免疫细胞化学染色显示Ⅰ型胶原蛋白胞质阳性,甲苯胺蓝染色显示蛋白聚糖阳性,对照组均为阴性.结论 体外共培养技术可诱导HUCMSCs向类AF分化,有望为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供一种新的种子细胞.
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人脐带间充质干细胞向纤维环样细胞分化的佳诱导比例分析
目的 采用体外共培养技术诱导人脐带间充质干细胞(以下简称脐带干细胞)向纤维环细胞分化,探讨达到佳诱导效果时二者的比例关系.方法 分离培养脐带干细胞和兔纤维环细胞,分别制备单细胞悬液.将脐带干细胞随机分为0:1组、1:2组、1:1组、2:1组.各组均取1 mL脐带干细胞单细胞悬液(2×104/mL)接种于Tr-answell 6孔板下层;1:2组、1:1组、2:1组分别取1 mL细胞密度分别为1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL的兔纤维环单细胞悬液接种于Transwell 6孔板上层,使纤维环细胞与脐带干细胞的比例分别为1:2、1:1、2:1;各组均共培养14天.取共培养后的各组脐带干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,实时荧光定量PCR法检测纤维环细胞相关基因Ⅰ型胶原、蛋白聚糖mRNA表达,ELISA法检测纤维环细胞相关基质Ⅰ型胶原、蛋白聚糖表达,免疫细胞化学染色法检测Ⅰ型胶原蛋白表达.结果 0:1组脐带干细胞多呈长梭形;1:2组、1:1组、2:1组脐带干细胞形态逐渐变为短梭形或多角形,细胞出现多个突起,局部区域相邻细胞突起连成网状;随着纤维环与脐带干细胞比例升高,脐带干细胞上述变化越明显,越接近纤维环细胞的形态学特征,以2:1组诱导效果明显.0:1组、1:2组、1:1组、2:1组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖mRNA相对表达量及Ⅰ型胶原、蛋白聚糖表达均依次升高,两组间比较P<0.05或<0.01.0:1组、1:2组、1:1组、2:1组脐带干细胞Ⅰ型胶原蛋白表达分别呈阴性、弱阳性、阳性及强阳性.结论 纤维环细胞与脐带干细胞共培养能诱导脐带干细胞向纤维环细胞分化,二者共培养的佳诱导比例为2:1.
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神经干细胞与RPE细胞的线粒体交换及其对RPE细胞增生和能量代谢的影响
背景 研究表明,干细胞可通过与损害靶细胞进行线粒体交换的方式修复受损细胞.视网膜色素变性疾病是以视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡为病理基础的眼病,干细胞是否能够通过上述机制进行治疗尚不清楚. 目的 研究神经干细胞(NSCs)能否通过线粒体交换机制改善RPE细胞的增生和能量代谢功能.方法 分离Long-Evans大鼠的视网膜进行RPE细胞的培养和传代,取第3代细胞用于实验,采用荧光显微镜检测RPE细胞中RPE65和Bestrophin蛋白的表达.小鼠NSCs C17.2细胞系和带绿色荧光蛋白(GFP)的C17.2细胞(GFP-C17.2细胞)进行培养和传代.分别采用线粒体特异性染色剂Mitotracker-green和Mitotracker-red标记RPE细胞和NSCs线粒体.将RPE细胞与小鼠NSCs进行共培养,用麦胚凝集素(WGA)标记隧道纳米管(TNT),于激光扫描共焦显微镜下观察共培养的RPE细胞与小鼠NSCs间TNT中线粒体交换方式;采用流式细胞术检测RPE细胞与NSCs共培养前后的细胞周期改变;采用高效液相色谱(HPLC)技术检测共培养前后RPE细胞中ATP、ADP和AMP的质量分数. 结果 培养的第3代RPE细胞生长良好,RPE65和Bestrophin表达阳性细胞均＞85％.NSCs和RPE细胞中线粒体对Mitotracker-red标记的阳性率均＞95％.2种细胞共培养后24 h可见RPE细胞与NSCs间形成的膜性TNT结构,WGA染色呈蓝色荧光.随着时间的推移,NSCs中呈红色荧光的线粒体通过TNT进入呈绿色荧光的RPE细胞中.接受TNT线粒体后,处于G1期的RPE细胞比例较未进行线粒体交换的RPE细胞明显下降,差异有统计学意义(P=0.016),S期细胞和G2/M期细胞比例分别增加了5％和2％,差异均无统计学意义(P=0.114、0.189).HPLC检测结果显示,与NSCs共培养后,RPE细胞中ATP、ADP和AMP质量分数分别为(8.77 ±3.68)、(2.76±0.92)和(1.07±0.65) μg/mg,较共培养前的(11.29±2.29)、(3.12±0.95)和(1.59±1.22) μg/mg均有所下降,但差异均无统计学意义(P=0.370、0.668、0.553).结论 NSCs通过建立的TNT能将线粒体单向传递给共培养的RPE细胞,线粒体交换可能是NSCs改善RPE细胞增生和代谢能力的机制之一.
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缺氧条件下共培养血管内皮细胞对C6胶质瘤细胞促进生长和抑制凋亡的作用
目的 研究缺氧条件下共培养血管内皮细胞对C6胶质瘤细胞生长及凋亡的影响.方法 采用24孔板Transwell装置共培养C6胶质瘤细胞与人脐静脉内皮细胞,氯化钴模拟细胞缺氧条件.实验分为缺氧细胞共培养组、常氧细胞共培养组、缺氧细胞单独培养组、常氧细胞单独培养组.培养24 h后Annexin V-FITC/PI荧光双染法检测各组C6细胞凋亡情况,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,连续计数6d各组C6细胞数目并绘制细胞生长曲线. 结果 共培养24 h后,缺氧细胞共培养组C6细胞凋亡率明显低于其他3组,常氧细胞共培养组C6细胞凋亡率低于常氧细胞单独培养组,差异有统计学意义(P＜0.05)；与其他3组比较,缺氧细胞共培养组G0/G1期细胞比例明显减少,而S期细胞比例明显增多,与常氧细胞单独培养组比较,常氧细胞共培养组C6细胞G0/G1期比例较少,S期细胞比例较多,差异均有统计学意义(P＜0.05)；连续培养6d,各组C6细胞在前2d均进入细胞指数生长期,在2～4 d达到高峰后,形成细胞生长平台期,随后细胞计数下降,进入退化衰亡期.其中缺氧细胞共培养组C6细胞在指数生长期内生长速率快,生长平台期内细胞峰值数目多,并较晚进入退化衰亡期. 结论 缺氧和血管内皮细胞可协同作用于C6胶质瘤细胞,减少胶质瘤细胞的凋亡,并加速其生长.
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体外共培养体系中胆管癌细胞对内皮细胞的作用
目的 在体外共培养体系中研究胆管癌细胞对内皮细胞的作用.方法 建立胆管癌QBC939细胞与内皮细胞的体外共培养体系设为共培养组,同期单独培养的内皮细胞设为内皮细胞组,同样数量的内皮细胞和胆管癌细胞分别单独培养的上清液混合液设为混合组.对内皮细胞进行光镜及扫描电镜观察,并用免疫荧光法检测内皮细胞蛋白水解酶pp125焦点激酶(pp125FAK)、基质金属蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)、人尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活物(uPA)表达的变化,明胶酶谱法测定内皮细胞MMP-2及MMP-9的活性.采用配对t检验分析其结果.结果 与内皮细胞组比较,共培养组内皮细胞之间的间隙增大.内皮细胞组ppl25FAK、MMP-2、MMP-9、uPA的平均荧光强度分别为394±51、455±82、377±48、422±55,而共培养组表达增强,分别为1096 ±128、931 ±72、815 ±76、801 ±56,两组比较差异有统计学意义(t=6.53,4.32,3.61,3.45,P<0.05).混合组MMP-2、MMP-9灰度扫描值分别为240.2±15.2和2.4±0.8.共培养组的MMP-2、MMP-9分别为687.4±43.6和150.9±13.2,两组比较差异有统计学意义(t=4.89,5.43,P<0.05).结论 共培养后的内皮细胞之间缝隙增大,蛋白水解酶表达增强,它可能参与降解内皮细胞外基质,促进了胆管癌的转移.
