肝细胞生成素的研究

急性肝衰竭的病死率极高,其预后主要取决于病损肝细胞的坏死程度和再生能力,因此,预防肝坏死与促进肝再生是目前各种治疗手段的出发点.以往临床上的治疗措施如支持疗法、活跃微循环、全血及血浆交换、体外吸附剂灌注及人工肝等技术,其目的均是以稳定内环境、延长患者生命、为残存肝细胞再生创造条件为主.这些措施虽有助于清除体内有毒物质,但无助于刺激病损肝脏的再生.因此,探索并找到既能阻止肝细胞坏死、又能促进肝脏再生的物质或药物一直是肝脏病学面临的重大课题[1].

糖基转移酶Colgalt2基因敲除对肝细胞再生过程中增殖和凋亡的作用研究

目的：初步探讨Colgalt2基因敲除对小鼠肝细胞再生过程中细胞增殖和凋亡的作用。方法根据Higgins和Anderson于1931年提出的肝大部分切除模型，实施Colgalt2＋/＋野生型对照组小鼠和Colgalt2－/－小鼠（均为C57BL/6J品系）70%肝大部分切除术（PH），分别取正常小鼠和PH后1、3、7天的小鼠再生肝脏的右外叶，于10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片。采用免疫组织化学方法比较细胞增殖核抗原（PCNA）在小鼠肝部分切除术后各时间点组间的表达阳性率差异；胶原酶两步灌注法分别分离正常和PH后1、3、5天的Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠的肝细胞。流式细胞仪检测各组肝细胞凋亡率。结果 PH后1、3、7天，Colgalt2－/－小鼠肝细胞PCNA阳性表达率显著高于Colgalt2＋/＋小鼠肝细胞PCNA阳性表达率，且差异有显著统计学意义（P＜0.01）。分离的肝细胞活细胞比率达94%，正常Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠分离的肝细胞凋亡率分别为（23.36±0.83）%、（21.04±1.16）%；PH后1天， Colgalt2＋/＋对照组小鼠肝细胞凋亡率和Colgalt2－/－小鼠肝细胞凋亡率分别为（8.27±0.33）%、（8.44±0.30）%，PH后1天肝细胞凋亡率均降至低，随即肝细胞凋亡率逐渐升高；PH后3天，Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠肝细胞凋亡率分别为（15.92±0.56）%、（12.14±0.37）%，Colgalt2－/－小鼠的肝细胞凋亡率明显低于野生型对照组小鼠的肝细胞凋亡率（P ＜0.01）；PH后5天，Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠肝细胞凋亡率分别为（21.36±0.51）%、（18.92±0.92）%，Colgalt2－/－小鼠的肝细胞凋亡率仍低于野生型对照组小鼠的肝细胞凋亡率（P＜0.05），肝细胞凋亡率均接近于恢复正常水平。结论糖基转移酶Colgalt2基因敲除在肝再生过程中在一定程度上具有促进肝细胞增殖和抗肝细胞凋亡的作用，提示该基因介导的胶原Glcα1，2Galβ1-糖基化修饰对肝再生可能起着重要的调控作用。

肝再生增强因子对肝星状细胞基因表达谱的影响

目的：将pcDNA3.1（-）-ALR（hALR）和pcDNA3.1（-）分别转染人肝星形细胞（HSC），筛选在人肝星形细胞中存在表达差异的基因，进一步研究hALR的生物学功能及机制。方法以脂质体技术将pcDNA3.1（-）-ALR和pcDNA3.1（-）分别转染人肝星形细胞系，提取总mRNA，逆转录为cDNA，应用基因表达谱芯片方法分析差异表达的基因。结果在所筛选的4096个基因中，有2个基因表达水平显著上调，25个基因表达水平显著下调。结论hALR对于人肝星形细胞基因表达谱有显著影响，为进一步研究hALR的生物学功能和作用机制提供了线索。

过表达肝细胞核因子4α脐带间充质干细胞促进小鼠大部肝切后肝再生

目的：探讨人源性脐带间充质干细胞（UC-MSC）以及过表达肝细胞核因子4α（HNF4α）的UC-MSC能否促进小鼠大部肝切后肝再生。方法体外分离、培养、鉴定人UC-MSC，慢病毒转染过表达HNF4α。体外收集细胞培养上清液，将L02与上清液共培养，通过细胞增殖实验试剂盒（CCK8）检测细胞增殖活性。体内实验建立肝大部切除模型（约70%），分别经尾静脉向肝切除小鼠移植0.9%生理盐水（NS）、MSC、MSC-HNF4α。48h后比较3组肝切后肝再生的变化，通过免疫组化来观察肝标本Ki67的表达。结果成功分离鉴定UC-MSC，并且成功建立稳定过表达HNF4α的MSC。体外实验MSC组和MSC-HNF4α组中L02的增殖能力都明显高于NS组（P＜0.01），MSC组高于MSC-HNF4α组（P＜0.05）。同样体内实验相对于NS组，经MSC或MSC-HNF4α细胞处理的肝脏，其Ki67的表达明显高于NS组（ P＜0.01），同样MSC组高于MSC-HNF4α组（P＜0.05）。结论 UC-MSC和过表达HNF4α的MSC都分泌一系列因子促进肝再生。

肝硬化肝癌肝部分切除术后影响肝再生的抗纤维化因子研究

在我国,肝癌是排第三位的癌症死亡原因.肝部分切除术仍是目前治疗肝癌有效的办法.肝脏是具有强大再生能力的器官,其再生机制十分复杂.我国肝癌患者绝大多数伴有肝硬化,而肝硬化是影响术后肝再生的一个重要因素,肝硬化使肝脏的再生功能明显受损.然而,迄今为止,术后抗肝硬化的具体机制尚未完全阐明,在临床上也始终缺乏有效的干预手段,因此,深入研究抗纤维化的相关因子,如角化细胞生长因子、肝细胞生长因子、乳脂肪球表皮细胞生长因子8、胶原绑定血管内皮生长因子、体外扩增的CD34+细胞,对于改善此类患者的预后具有深远意义.本文主要简介与抗纤维化相关的因子,以便为以后使用单一因子或联合使用多种因子抗肝纤维化,为提高伴肝硬化肝癌肝部分切除术后余肝再生能力提供参考.

ALPPS可能是治疗预留肝体积不足的伴门静脉癌栓肝细胞癌的有效方法

目的 提供联合肝脏分隔和门静脉结扎的二步肝切除术(ALPPS)应用于门静脉癌栓病例中的经验,初步探讨其在门静脉癌栓病例治疗中的价值和进一步发展方向.方法 对解放军总医院肝胆外科2015年7月-2016年12月收治的3例应用于门静脉癌栓的ALPPS手术进行回顾性分析,采集患者基本信息、术前门静脉癌栓分型、术前肝功能Child-Pugh分级、ICG试验结果、预留肝体积、预留肝体积增长率、两期手术的手术时间、出血量、术后并发症情况、术后生存情况等关键临床数据,并结合文献进行讨论分析.结果 3例患者均完成ALPPS手术.根据门静脉癌栓的程树群分型,Ⅱ型1例,Ⅲ型2例.一期术前肝功能均为Child-Pugh A级,ICG R15平均为7.3％(4.2％～11.0％),平均预留肝体积387 ml(333 ～484 ml).两期手术平均间隔时间为24.7 d(9～50 d),平均预留肝体积的增长率为50.3％ (24.4％ ～ 82.3％).术后Clavien-DindoⅢ级以上的并发症1例,未出现死亡患者.截至2017年2月,2例患者因肿瘤复发行肝动脉化疗栓塞治疗,效果良好.所有患者均生存情况良好.解剖二期手术标本,均见癌栓坏死.结论 对于门静脉癌栓Ⅱ型和Ⅲ型的低预留肝体积患者,ALPPS是一种能够有效控制癌栓、提高根治性切除率的有价值的手术方式,结合肝动脉化疗栓塞等治疗方式有望进一步提高治疗效果.

与再生肝细胞共培养对结肠癌细胞增生反应的影响

目的 探讨与再生肝细胞共培养时结肠癌细胞增生潜能的改变及其可能机制.方法 人结肠痛细胞株SW480,与70%肝切除大鼠模型术后24 h采用原位胶原酶灌流法分离获得有活性的再生肝细胞以不同比例混合进行体外培养;采用[3H].胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率和Westernblot检测细胞培养24、72、96和120 h的增生反应及表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和肝细胞生长因子受体(c-met)表达变化.结果 1:1和1:10比例共培养组结肠癌细胞增生反应增强,3H-TdR掺人率从培养第72 h开始增加,至第120 h呈持续增加趋势(P<0.05),EGFR和IGF-1R从第24 h开始表达增强,且表达水平呈时间效应关系,c-met表达无明显变化;10:1比例共培养组结肠癌细胞增生情况、3种受体表达水平均无明显变化.结论 与再生肝细胞共培养可增强结肠癌细胞EGFR、IGF-1R的表达,方式可能来自于肝细胞内的生长信号通过旁分泌机制增强结肠癌细胞EGFR和IGF-1R的表达,从而促进结肠癌细胞的增生反应.

小体积肝切除促进肝硬化大鼠模型肝脏再生及肝功能恢复的实验研究

目的 观察小体积肝切除对肝硬化大鼠模型肝脏再生及肝功能恢复的影响.方法 采用CCl4腹腔注射方法制备肝硬化大鼠模型,肝硬化大鼠模型实施20％肝切除(n=30),以肝硬化假手术组(n=30)和正常大鼠20％肝切除组(n=30)作对照.在肝硬化模型制备至20％肝切除术后3个月的过程中,采用苏木精-伊红染色观察肝脏形态结构的变化,定期检测模型肝功能、凝血功能,采用Western blot、Re-al-time PCR检测肝细胞生长因子和转化生长因子-β以及增殖细胞核抗原在肝细胞中的表达情况,并与对照组进行比较.结果 在肝硬化模型制备过程中,苏木精-伊红染色提示大鼠肝脏逐渐呈现肝纤维化、肝硬化样改变;与正常大鼠比较,肝硬化动物模型中转化生长因子-β基因、蛋白表达逐渐增强.在接受20％肝切除术后3个月,肝硬化模型肝功能及凝血功能均较术前有所改善,同时TGF-β表达水平显著低于作为对照的肝硬化假手术组(P＜0.05),而肝细胞生长因子和增殖细胞核抗原基因、蛋白表达水平显著高于作为对照的肝硬化假手术组(P＜0.05).结论 小体积肝切除有助于促进肝硬化大鼠模型肝脏再生及肝功能的恢复,这为进一步深入开展小体积肝切除防治肝硬化进展的相关研究提供了新思路.

间断低氧预适应对大鼠肝切除术后残余肝脏再生的影响

目的 研究间断低氧预适应对大鼠肝切除术后残余肝脏再生的影响.方法 54只SD大鼠用SPSS软件随机分为3组:假手术组(SO组)、肝部分切除组(PH组)和间断低氧预适应组(IHP组).PH组切除大鼠的左叶和中叶肝脏,约占70％.IHP组大鼠每日在低氧环境下暴露1h,连续进行1周后行肝切除术.于术后第1、3、5天每组随机选取6只SD大鼠处死进行检测.称取肝脏重量,计算肝脏再生度和再生指数.取下腔静脉血用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平.采用免疫组化方法检测残余肝组织增生细胞核抗原(PCNA)阳性率.结果 IHP组术后第1天和第3天残余肝脏的再生度和再生指数明显高于PH组(P＜0.05),而术后第5天两组差异无统计学意义.虽然IHP组和PH组大鼠术后血清ALT和AST水平开始下降,但二者均明显高于SO组,且术后第1天IHP组明显低于PH组(P＜0.05).术后各个时间点IHP组残余肝脏的PCNA阳性细胞比例明显高于SO组和PH组(P＜0.05).结论 间断低氧预适应能够在一定程度上防止肝切除术后残余肝组织中肝细胞破坏,并且能促进肝脏的早期再生.但其机制需进一步研究.

126 肝再生是血管生成的伴随现象

在实验性肝部分切除后纤维蛋白溶酶原介导肝再生和血管生成

门静脉栓塞的病理生理及其适应证(编译)

介绍门静脉栓塞在肝切除术中的病理生理、适应证和并发症,包括肝再生的情况.

肝再生微环境与肝细胞移植(文献综述)

肝细胞移植治疗肝脏疾病已有20多年的历史,但移植肝细胞增殖困难一直围绕着该项研究的进展.肝细胞增殖与肝再生微环境关系密切,本文就近年来的有关研究综述如下.

大鼠肝切除术后肝损伤程度与肝再生状态的动态对比研究

目的探讨肝切除术后肝损伤程度与肝再生状态的关系.方法Wistar大鼠随机分为三组:(1)假手术组;(2)正常大鼠肝切除组;(3)肝硬化大鼠肝切除组,建立大鼠肝切除模型,观察围手术期血清和肝组织匀浆液中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平、肝重/体重、肝再生率,以及应用免疫组化方法(SABC法)检测肝组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果与正常大鼠相比,肝切除后肝硬化大鼠血清ALT和AST水平升高显著,持续时间较长(P＜0.05);PC-NA在肝切除后肝组织的表达显著延迟(P＜0.05),血清ALT和AST水平与肝再生率呈显著负相关(P＜0.05).结论肝损伤程度和肝再生状态呈负相关,肝损伤的程度影响肝再生状态,肝切除后检测血清ALT、AST水平的变化可以间接的了解肝再生情况.

活体肝移植不同供肝切取方式对残肝再生的影响

目的 探讨活体肝移植不同方式供肝切取术后供者康复及肝脏再生情况.方法 回顾性分析2006年5月至2011年5月13例活体肝移植供者临床资料.对不同方式供肝切取手术方法、供者术后肝功能指标变化及残肝再生情况进行比较.结果 供者手术分为不包含肝中静脉右半肝切除8例,包含肝中静脉右半肝切除2例,左半肝切除3例.供者肝功能及凝血指标均于术后两周恢复正常,术后未见严重并发症,随访情况良好,无供者死亡.术前CT估算供肝体积与术中实际切取供肝重量呈正相关(r＝0.838,P＜0.01).术后复查CT测残肝体积示:右半肝供者残肝较左半肝供者残肝再生速度快,不带肝中静脉右半肝供者较带肝中静脉右半肝供者残肝再生速度略高,但供者肝脏功能恢复无明显差异.结论 不同术式活体肝移植供者在规范化围手术期处理、精细手术操作后肝功能均能得到较好的康复,而供肝切取术后残肝再生速度则受切取比例、残肝供血情况、细胞因子调控等多因素影响.

术后早期低血小板计数与肝细胞癌患者肝部分切除术后肝功能衰竭的相关性

目的 探讨肝细胞癌患者行肝部分切除术后早期血小板计数与术后肝功能衰竭的相关性.方法 回顾性分析2013年7月至2015年8月于南京鼓楼医院行肝部分切除术的71例病理诊断为肝细胞癌患者的临床资料.根据术后2h内血小板计数(platelet count,PLT),将患者分为低血小板计数(PLT＜ 100×109/L)组(n=24,33.8％)和正常血小板计数(PLT≥100×109/L)组(n=47,66.2％).分析患者术后早期血小板计数与血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)以及术后肝功能衰竭发生率的关系.结果 71例患者中25例(35.2％)患者术后出现Ⅰ～Ⅲ级并发症.其中8例(11.3％)出现A级肝功能衰竭,但无再次手术及死亡病例.两组总体并发症发生率差异无统计学意义.但与正常血小板计数组比较,术后早期低血小板计数组发生A级肝功能衰竭比例(29.2％比2.1％,X2=11.618,P＜0.05)以及ALT、AST、TBil等峰值[(462.5±135.7) U/L比(307.9±192.6)U/L,(440.0±163.3) U/L比(265.8±155.8) U/L,(29.5±9.1)μmol/L比(17.9±8.8) μmol/L,t=3.507、4.385、5.129,P＜0.05]明显增高,且术后肝功能恢复至正常水平所需时间更长.Logistic多因素回归分析显示术后早期低血小板计数是肝细胞癌肝部分切除术后肝功能衰竭的独立危险因素.结论 血小板与肝细胞癌肝部分切除术后肝脏再生有关.术后早期低血小板计数患者出现肝功能衰竭风险增加,肝功能恢复延迟.

内毒素血症对部分肝切除大鼠的肝损伤机制探讨

目的 探讨内毒素(LPS)血症对部分肝切除大鼠的肝损伤作用及其可能机制.方法 54只大鼠随机分为假手术组(S组)、对照组(H组)及模型组(I组),每组各18只大鼠.假手术组仅行开关腹.模型组大鼠行70%肝切除,术后24 h静脉注射LPS(0.5 mg/kg).对照组大鼠70%肝切除后24 h静脉注射等量生理盐水替代LPS.在既定时点,测血清AST与ALT;Western blot法测定肝组织TNF-α表达;ELISA法测定血清TNF-α水平;化学比色法测定肝组织髓过氧化物酶(MPO)水平;同步切取肝组织行HE染色;免疫组化法测定肝组织增殖细胞核抗原(PCNA)指数.结果 模型组大鼠血清AST、ALT在LPS注射后1 h即升高,随时间递增明显,各时点上述指标均显著高于对照组(P＜0.01).模型组肝组织MPO活性随时间增高,各时点均显著高于对照组(P＜0.01).注射LPS后6 h肝组织出现片状坏死区,伴明显炎症细胞浸润.模型组1 h肝组织TNF-α表达及各时点血清TNF-α均较对照组显著升高(P＜0.01).模型组各时点肝PCNA指数均显著低于对照组(P＜0.01).结论 内毒素血症能引起部分肝切除大鼠出现急性肝损伤;肝细胞坏死伴中性粒细胞浸润是这种损伤的重要形态学改变,可能与内毒素诱导肝脏TNF-α产生增加及肝组织MPO活性增高有关;内毒素还损害肝细胞增殖,不利于肝再生.

大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞在2-AAF/PH模型中的增殖及关系研究

目的 研究大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞增殖过程中关系,探讨肝星状细胞(HSCs)对卵圆细胞增殖分化的调控作用.方法 利用2-乙酰氨基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型,对术后不同时间点的肝组织标本进行常规组织学观察,并用卵圆细胞标志物OV-6和HSCs激活标志物desmin进行免疫组化染色和免疫荧光双标,对阳性细胞进行半定量计数并分析两者相关性.结果 PH后第2天,门静脉区域开始出现小管样结构的卵圆细胞和HSCs增殖;PH后第4～6天,HSCs形成网格状伴随卵圆细胞迅速增殖,向肝实质内侵入;PH后第9天,HSCs与卵圆细胞增殖达到顶峰;PH后第12～15天,出现新生小肝细胞结节及小肠样化生,HSCs随卵圆细胞显著减少,位于小肝细胞结节周围,结节内有少量HSCs;PH后第18～21天,HSCs与卵圆细胞进一步减少或消失.直线相关分析表明两者高度相关.结论 HSCs参与了肝卵圆细胞介导的肝再生,可能通过产生多种生长因子以及重塑胞外基质对卵圆细胞的增殖分化具有重要的调控作用.

白细胞介素-22对肝纤维化小鼠肝部分切除术后肝再生的作用

目的 探讨白细胞介素-22(IL-22)对CCl4诱导的肝纤维化小鼠70％肝部分切除术后肝脏再生的促进作用及其机制.方法 144只C57/BL6小鼠,随机分为PHX组(单纯70％肝切除组)、CCl4纤维化组、CCl4+PHX组(CCl4诱导肝纤维化后行70％肝切除组)和CCl4+IL-22+ PHX组(肝纤维化后经IL-22干预后再行70％肝切除组).各组大鼠分别于术后3、6、12、24、48和72小时处死.收集血液标本,检测血清ALT、AST及ALB水平,计算ALT/AST值,观察各组各时间点肝脏损伤情况.收集肝脏组织标本,称肝叶重量计算肝体重比,病理观察各时点肝脏纤维化程度和病理损伤情况,检测不同时点肝脏细胞增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达数量;Western blot检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)水平及细胞周期改变情况.结果 (1)术后24、48、72小时CCl4+IL-22+ PHX组小鼠血清ALT/AST值明显高于CCl4+PHX组;术后48和72小时CCl4+ IL-22+ PHX组小鼠血清ALB水平较CCl4+ PHX组显著升高(P＜0.05).(2) CCl4+ IL-22+PHX组小鼠术后肝再生显著增快,术后24、48和72小时肝体重比(分别为2.34±0.07、3.23 ±0.09、3.55±0.09)明显高于CCl4+PHX组(2.08±0.16、2.77±0.07、2.97±0.14),且肝组织的病理损伤明显减轻(P＜0.05).(3)CCl4+PHX组术后24、48和72小时PCNA阳性表达细胞数、再生肝组织内STAT3蛋白和Cyclin D1蛋白表达量明显低于其余各组,而CCl4+IL-22+ PHX组PCNA阳性表达细胞数及再生肝组织内STAT3蛋白和Cyclin D1蛋白表达量较CCl4+ PHX组明显升高(P＜0.05).结论 在CCl4诱导的肝纤维化小鼠行70％肝部分切除术后,IL-22对肝脏再生起到显著的促进作用,且明显减轻肝组织病理损伤.

大鼠肝、胰十二指肠联合切除残肝肝细胞生长因子表达的研究

目的用实验动物模型同时切除肝脏、胰腺及十二指肠,以探讨肝细胞生长因子(HGF)对残肝再生的影响.方法 60只SD大鼠被随机分为4组:①68%肝切除组;②68%肝叶切除加50%胰腺切除组;③68%肝叶切除加十二指肠切除组;④68%肝叶切除、加50%胰腺切除加近端十二指肠切除组.每组中3只大鼠分别于术后12、24、48、72和168 h处死并采集肝脏样本,计算肝再生率.切除的肝脏组织用RT-PCR技术检测HGF在术后不同时间的表达,并与免疫组化法检测的肝细胞增殖细胞核抗原(PCNA)进行对比研究.结果 68%肝切除组残肝HGF的表达逐渐增强,24 h达到高峰,随后逐渐下降,168 h时达低水平.而肝、胰切除,肝十二指肠切除和肝、胰十二指肠切除可显著减少残肝细胞HGF的表达,并使HGF的表达延迟至术后48 h.结论 HGF可促进肝脏切除术后残肝的再生反应,而起源于胰腺和十二指肠外分泌腺的其他因素亦对HGF的表达起显著的调节作用,从而影响肝细胞的增殖.