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实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化
目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.
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利用标准曲线斜率与截距对HBV DNA荧光定量PCR实施质量监控
目前普遍采用TaqMan外标技术对HBV DNA进行荧光定量,其结果受模板浓度及扩增反应体系的批间差异影响.本文应用HBV DNA荧光定量PCR试剂标准曲线的斜率与截距对其实施质量监控,取得了满意的结果.
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miR-17在结肠癌中的表达及其临床意义
目的:探讨 miR-17在结肠癌中的表达与临床病理特征间的关系。方法选取2012年1月至2013年6月经手术切除的50例原发性结肠癌及癌旁组织标本,采用实时荧光定量 PCR 分析 miR-17的表达情况。结果相对于癌旁组织,50例结肠癌组织中 miR-17表达下调(P ﹤0.05),其表达与TNM 分期以及浸润深度有关(均 P ﹤0.05)。结论 miR-17参与了结肠癌的发生发展。
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过敏性紫癜患者外周血CD146的表达及意义
目的 检测CD146在过敏性紫癜(HSP)患者血清及外周血单一核细胞(PBMC)中的表达,探讨其在HSP发病机制中的意义.方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HSP患者急性期、恢复期及正常人对照组血清中可溶性CD146(sCD146)水平;采用实时荧光定量RT-PCR法检测PBMC中CD146 mRNA的相对表达水平,并分析CD146与疾病活动的相关性.结果 HSP患者急性期、恢复期及正常人对照组sCD146水平分别为(0.84±0.49)、(0.52±0.15)和(0.23±0.08) ng/L,急性期高于恢复期(t=3.44,P< 0.05),恢复期高于正常人对照组(t=8.90,P< 0.05).HSP患者急性期、恢复期及正常人对照组PBMC中CD146 mRNA的相对表达水平分别为26.34±2.55、14.18±2.49和10.08±2.08,急性期明显高于恢复期(t=18.69,P< 0.05),恢复期高于正常人对照组(t=6.92,P<0.05).结论 CD146可能在HSP的发病中起一定作用.
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他克莫司对HaCaT细胞干细胞因子mRNA及小鼠B16黑素瘤细胞c-kit mRNA表达的影响
目的 探讨他克莫司对角质形成细胞干细胞因子(SCF)mRNA及黑素细胞c-kit mRNA表达水平的影响.方法 分别培养人永生化角质形成细胞(HaCaT)和小鼠B16黑素瘤细胞,经他克莫司作用48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测SCF mRNA及c-kit mRNA的表达.结果 他克莫司作用后,HaCaT细胞SCF mRNA、B16黑素瘤细胞c-kit mRNA的相对表达量均升高,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05).结论 他克莫司可以上调HaCaT细胞SCF mRNA及B16黑素瘤细胞c-kit mRNA的表达量.
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白癜风患者外周血白介素17和孤独核受体的表达
目的 探讨Thl7细胞在白癜风免疫发病机制中的作用.方法 采用双抗体夹心ELISA法检测白癜风患者进展期、稳定期和正常人外周血血清中白介素17(IL-17)水平;采用实时荧光定量RT-PCR方法检测外周血单一核细胞中孤独核受体(RORγt)mRNA表达水平,并分析其与疾病活动的相关性.结果 进展期与稳定期白癜风外周血中IL-17、RORγt表达水平与正常人对照组相比显著升高(P<0.01).结论 Th17细胞可能与白癜风的发病机制密切相关.
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玫瑰糠疹患者单一核细胞转录因子T-bet mRNA及GATA-3mRNA的表达
目的 探讨T-bet、GATA-3在玫瑰糠疹发病机制中的意义.方法 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测17例玫瑰糠疹患者和20例正常人外周血单一核细胞中T-bet mRNA和GATA-3mRNA的表达.结果 玫瑰糠疹患者外周血中T-bet mRNA与GATA-3 mRNA Avg△Ct值分别为3.33±0.94与5.22±0.69,对照组分别为4.31±1.11与4.36±1.02.患者的T-bet mRNA表达高于对照组(P<0.05),GATA-3表达低于对照组(P<0.05).结论 玫瑰糠疹患者外周血中T-bet/GATA-3升高,Th1优势表达,细胞免疫异常在玫瑰糠疹发病过程中可能具有重要作用.
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实时荧光定量PCR快速鉴定五种常见念珠菌
近年来,深部真菌感染的发病率和死亡率呈上升趋势,其中由念珠菌属引起的感染占有较高比例,耐药程度亦较高~([1-2]).临床上深部念珠菌感染的实验室检测和鉴定均存在一定不足.本研究旨在建立实时荧光定量PCR快速鉴定五种常见念珠菌的方法.
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肌浆网/内质网钙ATP酶在大鼠肝再生过程中的表达和活性分析
肌浆网/内质网钙ATP酶(SERCA)主要位于内质网和肌浆网膜上,是生物体内重要的钙离子转运酶.为进一步探讨肝再生过程中SERCA的表达变化,该研究构建了大鼠2/3肝脏切除模型,用实时荧光定量RT-PCR和测定酶活性的方法研究该酶的两种亚型(SERCA2b和SERCA3)在肝切除后O,1,12,24,48,72,120,168,216 h共9个时间点的表达变化,结果发现肝再生早期两种亚型表达量均下调,但在一定时间内显著应激性上升,分别在12h和48h达到峰值,之后表达量下调至原始水平.同时,酶活性测定结果与基因表达变化相类似,在12~48 h酶活性达到峰值,以上结果表明SERCA参与了肝脏再生过程,可能的途径是调控内质网钙离子,进而影响细胞质的钙震荡和细胞周期.
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实时荧光定量聚合酶链反应突触后密度蛋白93基因TaqMan探针的制备
目的:制备实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)突触后密度蛋白93(PSD93)基因TaqMan探针以进一步研究PSD93表达情况.方法:采用RT-PCR法,从生后1天的SD大鼠大脑组织mRNA中扩增PSD93基因部分CDS区片段,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定,采用TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线.结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度113bp相符,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列(RNU50717)比较,所克隆的PSD93基因片段与其中的113bp完全相同,与PSD93基因100%同源.以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率为0.95,各点变异系数小于20%.结论:采用RT-PCR和T载体技术成功获得FQ-PCR PSD93基因TaqMan探针.
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人乳腺癌组织中增殖诱导配体及受体mRNA水平定量测定
目的:分析乳腺癌组织中增殖诱导配体(APRIL)及其受体mRNA的表达水平.方法:采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)技术检测临床样本中靶基因mRNA准确含量,并以靶基因和内参β2M mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标.结果:RFQ-PCR检测靶基因mRNA含量的线性范围为109~101pg/ml,批内和批间重复性测定的变异系数v分别为3.87%~10.12%和6.86%~12.29%.乳腺癌25例组织样本的检测结果显示乳腺癌及癌旁组织中APRIL的水平均显著高于远端正常组织(P<0.05),而β细胞成熟抗原和穿膜蛋白活化物的表达水平在3组间差异无统计学意义(P>0.05).结论:成功建立RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;发现APRIL在乳腺癌组织中高表达,提示APRIL在乳腺癌发生、发展过程中可能起了重要作用.
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鸟苷酰环化酶C质粒标准品的构建
目的:制备人鸟苷酰环化酶C(GC-C)质粒标准品,为实时荧光定量PCR检测GC-C含量,探讨大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平及临床意义奠定基础.方法:在鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因高保守区设计特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并连接于pGEM-T载体,以得到GC-C质粒标准品.结果:经过蓝白斑筛选,PCR或EcoR I酶切初步鉴定,阳性克隆测序分析确定GC-C质粒标准品正确性.结论:正确构建GC-C质粒标准品为RFQ-PCR标准曲线的绘制及GC-C的定量检测奠定了基础.
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E-cadherin在胃癌组织的表达及意义
研究认为胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程[1].阐明其发生发展机制,对其检测及治疗有着重要作用.E-cadherin是一类介导上皮细胞间黏附维持组织结构完整性和极性的钙依赖性跨膜糖蛋白,与肿瘤侵袭转移关系密切,细胞间黏附的紊乱是肿瘤侵袭和转移的首要条件[2].本研究采用实时荧光定量PCR技术,通过在胃癌组织中检测E-cadherin的表达,探讨E-cadherin在胃癌发生发展过程中的作用.
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实时荧光定量聚合酶联反应在石蜡切片可疑结核病诊断中的应用
目的 探讨实时荧光定量聚合酶联反应(FQ-PCR)法检测结核分枝杆菌DNA在可疑结核病诊断中的应用价值.方法 应用FQ-PCR法,对50例可疑结核病的石蜡切片进行结核分枝杆菌DNA检测.结果 检出35例结核分枝杆菌DNA阳性,阳性率70.0%;结合临床、影像和检验等资料综合分析后,29例明确诊断为结核病,确诊率为58.0%.结论 FQ-PCR能检出石蜡切片部分可疑结核病的结核杆菌DNA,从而确定感染病原体,有助于临床有效诊断.
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实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较
沙门菌是一种常见的重要人兽共患病原菌,在自然界中分布广泛,它极易污染水源、食品及畜产品,引起人食物中毒、急性胃肠炎和动物腹泻等疾病.目前国内外对该菌的快速检测主要集中在免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法上[1~2].
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实时荧光定量PCR在肺炎支原体DNA检测中的应用
支原体(Mycoplasma)是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但不具胞壁的原核微生物。支原体种类繁多,对人致病的有肺炎支原体、人型支原体、解脲脲原体等。肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)引起的主要疾病有原发性非典型肺炎、咽炎和气管支气管炎。MP是儿科患者呼吸道感染的常见病原体之一[1,2]。近年来,MP感染越来越受到重视,为了解本院儿科患者的MP感染情况,以制定有效的防治措施。作者对2012年儿科患者MP DNA检测结果进行分析,报道如下。
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实时荧光定量RT-PCR技术在肿瘤研究中的应用
实时荧光定量RT-PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,广泛应用于医学等领域.全文就其原理、优越性及其在肿瘤研究中的应用及发展前景作一简要叙述.
关键词: 实时荧光定量 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 肿瘤 -
实时荧光定量分析SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期
目的:探讨和分析SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期.方法:建立包含β-actin基因片断的pMD-T载体的梯度稀释曲线,应用VIC标记的Taqman-MGB探针进行检测,用Opticon2.02软件分析结果.以不同浓度和不同时间的放线菌素D阻断SK-N-SH细胞转录,提取总RNA并予荧光定量RT-PCR检测β-actin mRNA.结果:SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期为4 h.与未处理组相比,4 h组β-actin的拷贝数差异有显著性(P<0.05),12 h和24 h组β-actin拷贝数差异有极显著性(P<0.01).不同浓度之间放线菌素D对β-actin拷贝数的影响差异不大(P>0.05).结论:应用实时荧光定量RT-PCR,通过比较mRNA与总RNA的拷贝数,建立了一种准确方便地检测mRNA衰减的方法.同时β-actin不适合做放线菌素D处理实验中的内参照.
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P53结合蛋白1在宫颈鳞癌中的表达及其临床意义
目的:探讨P53结合蛋白1(53BP1)在宫颈鳞癌组织中的表达情况及其与临床分期、分化程度、淋巴结转移以及病灶大小的关系.方法:选取2010年5月至2011年8月期间在温州医科大学附属第一医院妇科收治的临床资料完整的52例宫颈鳞癌、30例宫颈上皮内瘤变(CIN)和20例正常宫颈组织,采用实时荧光定量PCR技术检测53BP1 mRNA的表达水平,并对其表达水平与临床病理特征的关系进行统计学分析.结果:宫颈鳞癌组织中53BP1 mRNA相对表达水平明显低于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05).宫颈鳞癌中高分化组中53BP1 mRNA相对表达水平明显高于宫颈鳞癌低分化组,差异具有统计学意义(P< 0.05).宫颈鳞癌无淋巴结转移组中53BP1 mRNA相对表达水平明显高于宫颈鳞癌淋巴结转移组,差异具有统计学意义(P< 0.05).宫颈鳞癌FIGO Ⅰ期组和FIGOⅡ期组以及宫颈鳞癌大病灶组和小病灶组间53BP1 mRNA相对表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论:53BP1在宫颈鳞癌组织中表达减低,与分化程度、淋巴结转移有关,与病灶大小、临床分期无明显相关.
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自动核酸提取实时荧光定量PCR检测全血及血浆中EBV DNA载量的性能评价
目的 探讨自动核酸提取实时荧光定量PCR方法检测全血及血浆中EBV DNA载量的方法学性能.方法 评价自动核酸提取实时荧光定量PCR方法的线性范围、灵敏度、精密度及抗干扰等方法学性能,比较自动核酸提取法和煮沸提取法的相关性.用该方法检测152例EB病毒感染儿童的全血及血浆中的EBV DNA载量,比较分析全血与血浆中的EBV DNA载量关系.结果 本法的线性范围为5× 102~5× 108 Copies/ml,检测灵敏度为500 Copies/ml.批内CV为3.78%~4.57%,批间CV为6.35%~7.56%,总CV为7.24%~8.62%.肝素、胆红素、溶血对本检测方法均无干扰.EBV DNA载量在5×103~5×108Copies/ml范围内,本法(Y)与煮沸提取法(X)的相关性良好(Y=0.924+0.873X,R2=0.900,P<0.01),结果相差在1.0 logCopies/ml以内.80例EB病毒活动性感染组儿童,全血EBV DNA阳性率60%,血浆EBV DNA阳性率25%,全血EBV DNA阳性率高于血浆(P=0.016); 72例EBV非活动性感染组全血EBVDNA阳性阳性率5.6%,血浆EBV DNA阳性率0.活动性感染组全血EBV DNA阳性率高于非活动性感染组(P<0.01).结论 自动核酸提取实时荧光定量PCR方法检测全血及血浆中的EBV DNA载量,具有灵敏高、抗干扰能力强、定量准确、操作简便的优点,适合临床实验室常规开展.