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两种核酸提取方法在寨卡病毒实时荧光RT-PCR检测中的比较
目的 比较硅胶膜法和磁珠法在寨卡病毒核酸检测中的使用效果,以选择适合的核酸提取方法用于临床样本的寨卡病毒检测.方法 对北京首例输入性寨卡病毒感染病例的尿液和唾液样本同时用硅胶膜法和磁珠法提取总RNA,用一步法和两步法实时荧光RT-PCR进行寨卡病毒核酸检测,比较检测效果的差异.结果 在一步法中,用硅胶膜法从尿液中提取RNA,寨卡病毒检测阳性;用磁珠法从尿液和唾液中提取的RNA,检测均为阴性.在二步法中,用硅胶膜法从尿液和唾液中提取的RNA,检测均为阳性,而磁珠法提取的样本均未检出.结论 硅胶膜法提取核酸比磁珠法更适合于寨卡病毒荧光RT-PCR检测.
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基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分
目的 建立肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分检测分析.方法 针对猪、鸭和羊线粒体Cytb基因分别设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,优化LAMP反应条件,对猪、鸭和羊源性成分进行特异性和灵敏度试验,对羊肉制品进行上述动物源性成分监测.结果 在0.2 μmol/L外引物(F3和B3)、1.6 μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L dNTP等参数的优化条件下,LAMP法对内制品中猪、鸭和羊源性成分的检测灵敏度达0.5％.SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green Ⅰ染料肉眼观察结果一致.调查发现,该批市售羊肉及制品中存在掺假现象,掺假率为34.5％.结论 LAMP法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测结果准确的特点,能有效地对内制品中的猪、鸭和羊源性成分进行检测,可作为羊肉制品掺假的一种快速检测方法.
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两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒检验结果的影响
目的:研究固相吸附法、经典酚氯仿提取法两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒(HCV)的检验结果.方法:对献血者的血液采用相应的内向,分别用两种方法进行血液检测.结果:固相吸附法检测耗时约1h,且错误率较低;经典酚氯仿提取法耗时约4.5h,耗时长.结论:采用固相吸附法检测HCV与经典酚氯仿提取法相比,耗时短且出错率低,保证HCV检测结果的准确性,值得在临床上推广、运用.
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汇聚真情的平凡故事
我来自北京市海淀区疾控中心,今天我想讲讲我的老师石伟先这个疾控人的故事.和病魔赛跑特别清楚地记得,我刚到疾控中心实习时,一天晚上我在单位值班,接到电话报告一例疑似H7N9禽流感病例,急需实验室检测.我跑到实验室,就看到石老师已经在调试仪器了.样本处理、核酸提取、扩增检测,石老师手拿试管与加样枪,屏气凝神的样子,就像训练有素的战士.就这样,不知不觉天都亮了,而检测结果确定为H7N9病毒阳性.
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汇聚真情的平凡故事
我来自北京市海淀区疾控中心，今天我想讲讲我的老师石伟先这个疾控人的故事。
和病魔赛跑
特别清楚地记得，我刚到疾控中心实习时，一天晚上我在单位值班，接到电话报告一例疑似H7N9禽流感病例，急需实验室检测。我跑到实验室，就看到石老师已经在调试仪器了。样本处理、核酸提取、扩增检测，石老师手拿试管与加样枪，屏气凝神的样子，就像训练有素的战士。就这样，不知不觉天都亮了，而检测结果确定为H7N9病毒阳性。石老师说：“咱这工作就是在和病魔赛跑，提前1分钟确诊，患者就多1分生的希望。” -
蓝谱Loopamp?军团菌检测试剂盒
本试剂盒可快速、简单、高灵敏度、高特异性的检测出环境水样中的军团菌属，针对军团菌属保守的16SsRNA基因设计特异性LAPM?反应引物。该试剂盒包含前处理试剂，经过简单的核酸提取即可用于LAMP?反应，能在1小时内完成检测，反应结果无需电泳，加入荧光染料即可通过肉眼直接观察反应结果。
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蓝谱Loopamp?沙门氏菌检测试剂盒
针对沙门氏菌属的保守基因invA进行定性检测，特异性检测食品中的存在的沙门氏菌。该试剂盒包含前处理试剂，增菌后进行简单的核酸提取即可用于LAMP?反应，可在1小时内完成检测，反应结果无需电泳，加入荧光染料即可通过肉眼观察反应结果。具备简单、快速、高灵敏度和高特异性等优点。
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实时荧光定量PCR模板DNA快速制备的方法建立与应用
实时荧光定量PCR技术于1996年美国AppiedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现PCR从定性到定的飞跃,而且与常规PCR相比,具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快速、可以有效解决常规PCR污染问题等优点[1-2],已广泛应用于突发公共卫生事件应急处置中病原体的检测.提高实时荧光定量PCR的检测速度,服务于突发公共卫生事件应急检测是当前备受关注的技术问题.实时荧光定量PCR由模板制备和PCR两部分组成,缩短模板制备时间就可提高实时荧光定量PCR的检测速度.我们研制了一种模板制备方法,使制备时间从原来的30 min以上缩短至5 min以内,制备效果与经典的煮沸裂解法和先进的柱式核酸提取试剂盒相同,用于实时荧光定量PCR可在15～30 min内完成病原体DNA检测.
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无创性免核酸提取的多重SNP基因分型技术
目的 介绍一种无创性免核酸提取的样品前处理方法 ,结合高通量基因分型技术,为大规模流行病学监测及遗传学分析提供新的技术手段.方法无需核酸提取,直接裂解唾液或口腔拭子样品,加入带有通用尾部序列的多个寡核苷酸特异探针,通过夹心杂交将样品中的靶DNA捕获到96孔板中,利用基于延伸连接的多重探针扩增(MELPA)技术及核酸飞行质谱(MassARRAY)实现多重单碱基突变(SNP)检测.以具有抗疟药物(伯氨喹)诱导溶血风险的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的23个SNP突变检测作为应用对象,测试唾液样品的反应条件.通过与商业化SNP测定的基于核酸飞行质谱的多重SNP分型技术(iPLEX)进行比较,评估该方法的准确性,重复性和可靠性.结果 本方法可成功的对G6PD的23个SNP进行分型,40μL唾液或1个口腔拭子样本足够进行2个检测.36 h内(手工操作时间约2 h)可完成384个样品检测分析.其检测结果与测序结果一致,重复性较好,可靠性高,准确度优于传统的以血液为样品的iPLEX方法.结论 建立了适用于高通量的无创性免核酸提取的多重SNP基因分型技术,为大规模基因分型筛查提供了一个高效、准确的方法.
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3种核酸提取方法及3种实时荧光定量PCR仪检测结果的比较
目的 探讨不同核酸提取方法以及不同实时荧光定量PCR仪检测结果之间的差异.方法 随机挑选呼吸道、肠道病毒阳性标本各25份,采用3种方法(方法A、B、C)进行核酸提取,比较不同核酸提取方法之间的差异;随机挑选呼吸道、肠道病毒阳性核酸各25份,在3种实时荧光定量PCR仪(仪器A、B、C)上进行实时荧光定量PCR,比较不同实时荧光定量PCR仪之间的差异.检测结果采用定量资料的随机区组方法分析.结果 3种核酸提取方法检测结果存在差异(x2=42.9162,P<0.001),其中方法A、B,方法B、C之间的差异具有统计学意义(Z=7.025,P<0.001;Z=7.9,P<0.001),方法A、C之间的差异无统计学意义(Z=0.837,P=0.3816>0.05).3种实时荧光定量PCR仪的检测结果也存在差异(x2=23.773,P<0.001),其中仪器A、B,仪器A、C之间的差异有统计学意义(Z=5.70,P<0.001;Z=6.45,P<0.001),仪器B、C之间的差异无统计学意义(Z=0.75,P=0.4533>0.05).结论 在相同条件下,用不同的核酸提取方法,以及用不同的实时荧光定量PCR仪检测的结果均有差异,在实际工作中要综合考虑评价检测结果.
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应用双重聚合酶链反应检测乙型、丙型肝炎病毒
常规聚合酶链反应(PCR)方法对患者HBV和HCV需要分别检测，因而操作繁琐，费时费力，且增加了污染的机会，为此，我们建立了双重PCR技术，实现一步法同时进行HBV和HCV的检测。 选取肝病患者血清标本115例，20例正常对照标本采自HBsAg阴性、肝功能正常的献血员。核酸提取采用蛋白酶K消化，酚／氯仿抽提，乙醇沉淀，将提取的DNA和RNA复悬于焦碳二乙酯处理过的蒸馏水中，并加入2U RNA酶抑制剂Rnasin。PCR反应在核酸提取管中进行，总体积50μl，反应条件为10 mmol／L Tris·Cl(pH8.3)，50mmol／LKCl，2mmol／LMgCl2，0.5μmol／L HBV和HCV引物，0.2 mmol／LdNITP,AMVRT逆转录酶2U，Tag DNA聚合酶2U，RNA酶抑制剂Rnasin 10 U，混匀。
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荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价
荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术灵敏度高,速度快[1,2],已被临床广泛应用.然而,尽管该方法采用尿嘧啶糖基酶(UNG)等防交叉污染措施,但由于进行核酸提取时,用的是非封闭式人工操作,很难实现真正意义上的零污染(避免假阳性).
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两种病毒核酸提取方法在流行感冒诊断中的比较
目的 探讨离心柱法与Trizol法在流感病毒核酸提取中的差异,以找到提高阳性检出率的方法.方法 对592例临床流行感冒(流感)疑似患者采集咽拭子标本,采用离心柱法与Trizol法分别提取病毒核酸,采用巢式PCR进行扩增,扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳,以2000 bp Marker为标准,在564 bp区域出现阳性条带者为流感阳性.结果 592例临床流感疑似患者咽拭子标本中,应用离心柱法提取核酸222例(37.5%)阳性,甲型流感患者212例,乙型流感患者10例.Trizol法提取核酸显示66例(11.1%)患者呈阳性,其中甲型和乙型流感患者分别为63例和3例.自2014年12月至2015年4月,北京地区流感病毒流行以甲型流感病毒为主,乙型流感病例较少.流感的发病与季节相关,集中暴发时期在12月份左右,高发感染人群的年龄段为21~40岁,与性别无关.在病毒提取效率上,离心柱法阳性率显著高于Trizol法,差异具有统计学意义(χ2=111.66,P<0.01).结论 北京地区流感病毒的流行以甲型流感为主.离心柱法提取核酸效率要高于Trizol法,有利于早期进行病原学诊断.
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探讨HBV-DNA定量检测核酸提取过程中的影响因素分析
目的 探讨HBV-DNA(乙肝病毒的脱氧核糖核酸)定量检测核酸提取过程中的影响因素.方法 方便选取2018年1—4月内蒙古赤峰市中心血站经ELISA检测两次的75份合格血液样本为研究对象,分别统计不同浓缩液剂量、不同沉淀摇匀方式和不同裂解煮沸时间的Ig HBV-DNA测定结果,并对各项结果进行统计学分析.结果 不同浓缩液组别的测定结果与标准方式相比,差异无统计学意义(t=0.140、0.036、0.069、1.088,P>0.05);B1(4.123±0.187)和B4(4.235±0.160)与标准方式(4.178±0.175)相比,差异有统计学意义(t=2.437、2.082,P<0.05),B2(4.136±0.189)、B3(4.201±0.162)与标准方式相比,差异无统计学意义(t=1.412、0.835,P>0.05);C1(4.134±0.160)与标准方式(4.203±0.155)对比,明显偏低,差异有统计学意义(t=2.682,P<0.05),C2(4.195±0.138)、C3(4.232±0.167)和C4(4.221±0.169)与标准方式对比,差异无统计学意义(t=0.334、1.102、0.679,P>0.05).结论 一定范围内适当改变浓缩剂量、沉淀摇匀方式和裂解煮沸时间并不会对检测结果造成较大影响,但经过预热处理后,振荡摇匀会促使核酸释放和沉淀混匀,临床上要注意相关因素的影响,以提高检测结果的准确性.
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三种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较
目的：比较及评价3种不同核酸提取方法检测HCV-RNA结果的差异。方法依照美国临床实验室标准化协会( CLSI) EP9-A2文件规定，收集40个新鲜血清标本，分别使用磁珠法、柱提法、手工法丙肝试剂以及Roche试剂进行平行检测，记录测定结果，计算线性方程及相关系数，并对其进行偏倚评估。结果磁珠法和柱提法试剂与Roche试剂方法间的相关性良好(r>0.975)，而手工法与Roche试剂方法检测结果间差异超出预设允许误差范围。结论各方法学的试剂与Roche试剂检测结果大致相关性尚可，其中磁珠法结果较好。
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Xpert Meb/RIF检测方法的探讨
随着分子生物学诊断技术的不断发展， GeneXpert在多个国家和地区进行了验证评估， Xpert Meb/RIF检测技术作为一种利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术，逐渐受到临床的广泛关注。该方法通过核酸提取、扩增和检测，将前处理后的待检标本放入密闭的反应盒中，通过上述三位一体操作程序自动给出实验结果，整个过程只需2h就可得出痰标本是否菌阳、带菌量多少、是否利福平耐药的结果[1]，而传统的方法得出利福平耐药结果需要3个月的时间，增加了检测的快速性。我院接受了全球基金项目为我院配备的一台GeneXpert检测仪，目前已检测30例痰标本，现将30例痰标本涂片镜检，固体培养和 GeneXpert 检测分枝杆菌3种方法将以对比总结。
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3种血浆微小RNA提取方法的评价
目的 对3种血浆微小RNA(miRNA)提取方法进行评价.方法 运用国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法分别提取20名志愿者血浆中的miRNA;利用TaqMan聚合酶链反应(PCR)检测提取物中的β-globin基因含量,观察提取物中RNA的纯度;利用反转录茎环引物及TaqMan-MGB探针qPCR检测提取物中miRNA-21含量,观察miRNA提取的效率.结果 国产、进口硅胶吸附柱法及TRIzol法提取液中β-globin基因的Ct值分别为35.487±0.356、35.591±0.332和33.529±0.499,3种方法的Ct值差异有统计学意义(P<0.001);国产和进口硅胶吸附柱方法的β-globin基因Ct值均明显高于TRIzol法(P<0.0001);而国产与进口硅胶吸附柱法β-globin基因Ct值差异无统计学意义(P=0.3454).国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的Ct值分别为26.527±0.158、26.653±0.201和28.169±0.385,3种方法的Ct值差异有统计学意义(P=0.0003);国产和进口硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值均明显低于TRIzol法(P<0.0001);国产硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值低于进口硅胶吸附柱法(P=0.0337).结论 硅胶吸附柱法可有效提高miRNA的提取效率和纯度.国产硅胶吸附柱法完全可以取代进口硅胶吸附柱法.
关键词： 微小RNA 核酸提取 硅胶吸附柱 Trizol法 Taqman聚合酶链反应 -
一种快速简便的SARS冠状病毒RNA提取方法
目的建立快速简便的SARS冠状病毒RNA提取方法.方法采用异硫氰酸胍-玻璃粉法提取病毒RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS冠状病毒RNA.结果24例SARS患者的粪便和痰液标本同时采用异硫氰酸胍-玻璃粉法和QIAGEN公司的试剂盒提取SARS冠状病毒RNA,其粪便标本RT-PCR的阳性率分别为83.3%(20/24)和100-0%(24/24);痰液标本RT-PCR的阳性率分别为16.7%(4/24)和20.8%(5/24).异硫氰酸胍-玻璃粉法RT-PCR的阳性率与洗脱温度有关.结论异硫氰酸胍-玻璃粉法提取SARS冠状病毒RNA简便、快速、经济,可用于临床.
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磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2的制备及在全血DNA提取中的应用
目的 自制Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒并评价在全血样本中DNA提取效果,进一步研究开发磁珠法检测HBV DNA的技术.方法 采用溶剂热法自制Fe3O4磁性纳米颗粒,并用表面化学修饰法制备Fe3O4@SiO2磁性复合颗粒;利用该颗粒经吸附、洗涤、洗脱等步骤提取全血样本中DNA,并通过电泳、PCR扩增等传统技术检测DNA提取效果,与煮沸法提取血清DNA样本的效果进行对比.结果 成功制备出直径约550 nm的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒,该颗粒分散均匀;自制的磁性纳米颗粒可用于全血DNA提取与纯化,实验操作简便.自制磁性纳米颗粒提取全血DNA浓度为150.56 ng/μL,纯度为1.53;该提取方法与传统煮沸裂解法对96份样本进行对照研究,证实其灵敏度有较大提高.结论 利用自制的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒和合适的缓冲液体系,可成功地提取纯度较高的DNA,通过PCR扩增及对比实验表明,该磁性纳米颗粒及其提取工艺经优化后,可用于传染病的体外分子诊断研究.
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一种新型快速定量检测HBV DNA试剂的评价
目的 对一种新型快速定量检测HBV DNA试剂进行性能评价.方法 以达安公司HBV DNA定量检测试剂(浓缩碱裂解法)为参比试剂,湖南圣湘公司HBV DNA定量检测试剂(一步法)为实验试剂,比较两法对117例临床标本和2012年江苏省室间质评样本检测结果的相关性和准确性.评价一步法PCR试剂的敏感性、特异性、线性关系和重复性.结果 两种试剂检测25例HBV DNA阴性标本,结果均为阴性,92例HBV DNA阳性样本中87例两法均为阳性.经以10为底数的对数转换后,一步法检测结果为4.82±1.80,浓缩碱裂解法为4.78±1.89,结果无统计学差异(t=-0.74,P＞0.05),且两法相关性良好(r =0.971,P＜0.05).两法特异性均为100％ (25/25)；一步法敏感性为98.9％ (91/92),浓缩碱裂解法为95.7％ (88/92)；两法检测室间质评样本均在合格范围内.一步法检测试剂的r为0.999；两份HBV DNA阳性样本重复检测10次的变异系数(CV)分别为0.89％和0.15％.结论 一步法试剂的检测结果准确可靠,与浓缩碱裂解法试剂相比,操作简便快速.
