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国产血浆游离DNA提取试剂盒的性能评价
目的:对国产血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)提取试剂盒进行评价.方法:用志愿者血浆构成血浆池A,再分别加入固定量片段长度为102、268、402 bp和所有片段混合物的DNA,形成血浆池B1-B4.用Qiagen和国产柱式法cfDNA提取试剂盒分别提取血浆池A和血浆池B1-B4中的cfDNA.用TaqMan qPCR分析两种试剂盒提取血浆池A中cfDNA的提取效率,同时分析cfDNA浓度与血浆用量之间的关系,用琼脂糖凝胶电泳分析提取的cfDNA的片段完整性.核酸测定仪分析两种试剂盒对血浆池B1-B4中不同DNA片段的回收率.结果:Qiagen和国产试剂盒提取的血浆池A中cfDNA的Ct值分别为27.94±0.423和27.41±0.356,国产试剂盒提取效率明显高于Qiagen试剂盒(t=4.29,P＜0.01);琼脂糖凝胶电泳结果表明,两种方法提取的血浆池A中cfDNA在102、268和402 bp处均出现明显条带,而1 204 bp片段未出现.Qiagen和国产试剂盒提取的cfDNA浓度与血浆池A的血浆用量之间均存在明显的线性相关,r2分别为0.979(P ＜0.01)和0.963(P ＜0.01).Qiagen和国产试剂盒提取的血浆池B1-B4血浆中102、268、402 bp及其昆合物的回收率分别为64.81％ ±4.27％,80.40％±4.31％,88.40％±6.11％,83.50％ ±5.21％和73.50％±5.33％,85.20％±4.49％,89.30％ ±5.91％,85.64％±4.48％,两者在102和268 bp片段的回收率上差异显著(t=5.69,P＜0.01;t =3.44,P＜0.01),而在402 bp及混合物的回收率上无明显差异(t =0.47,P＞0.05;t 1.39,P＞0.05).结论:国产cfDNA提取试剂盒在各项评价性能上均可与Qiagen产品媲美.
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煮沸裂解法与磁珠法在 HBV DNA 荧光定量检测中的核酸提取效果
目的：比较煮沸裂解法和磁珠法在 HBV DNA 荧光定量 PCR 检测中的核酸提取效果。方法应用煮沸裂解法与磁珠法对不同拷贝数（＜103、103、104、105、106和107拷贝/ mL）HBV DNA 样本进行核酸提取，并采用荧光定量 PCR 检测结果进行评价。结果磁珠法的核酸提取效果优于煮沸裂解法，尤其在低拷贝样本中，明显优于煮沸裂解法约10倍（P ＜0.05）；磁珠法的重复性高于煮沸裂解法；磁珠法提取核酸时，样本只要1～32个，提取时间不随样本量变化。结论磁珠法的核酸提取效果好于煮沸裂解法，尤其在低拷贝数样本中；且重复性较高。
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自动核酸提取实时荧光定量PCR检测全血及血浆中EBV DNA载量的性能评价
目的 探讨自动核酸提取实时荧光定量PCR方法检测全血及血浆中EBV DNA载量的方法学性能.方法 评价自动核酸提取实时荧光定量PCR方法的线性范围、灵敏度、精密度及抗干扰等方法学性能,比较自动核酸提取法和煮沸提取法的相关性.用该方法检测152例EB病毒感染儿童的全血及血浆中的EBV DNA载量,比较分析全血与血浆中的EBV DNA载量关系.结果 本法的线性范围为5× 102～5× 108 Copies/ml,检测灵敏度为500 Copies/ml.批内CV为3.78％～4.57％,批间CV为6.35％～7.56％,总CV为7.24％～8.62％.肝素、胆红素、溶血对本检测方法均无干扰.EBV DNA载量在5×103～5×108Copies/ml范围内,本法(Y)与煮沸提取法(X)的相关性良好(Y=0.924+0.873X,R2=0.900,P＜0.01),结果相差在1.0 logCopies/ml以内.80例EB病毒活动性感染组儿童,全血EBV DNA阳性率60％,血浆EBV DNA阳性率25％,全血EBV DNA阳性率高于血浆(P=0.016); 72例EBV非活动性感染组全血EBVDNA阳性阳性率5.6％,血浆EBV DNA阳性率0.活动性感染组全血EBV DNA阳性率高于非活动性感染组(P＜0.01).结论 自动核酸提取实时荧光定量PCR方法检测全血及血浆中的EBV DNA载量,具有灵敏高、抗干扰能力强、定量准确、操作简便的优点,适合临床实验室常规开展.
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两种丙型肝炎病毒核酸提取方法比较及评价
目的：评价两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒（HCV）RNA 提取效率的差异。方法对266例抗HCV 阳性血液标本分别使用磁珠法、煮沸裂解法进行 RNA 提取，用实时荧光定量 PCR 对其提取效率进行评价。结果磁珠法提取核酸阳性率为56.77%（151/266），其中病毒拷贝数1.0×103~1.0×105者63例，占41.72%（63/151），病毒拷贝数大于1.0×105者88例，占58.28%（88/151）；煮沸裂解法的阳性率为51.88%（138/266），其中病毒载量1.0×103~1.0×105者50例，占36.23%（50/138），病毒载量大于1.0×105者88例，占63.77%（88/138）。结论磁珠法较煮沸裂解法提取丙肝病毒 RNA 的效率高，特别是 RNA 病毒低复制（<1.0×105）时，磁珠法明显高于煮沸裂解法，差异有统计学意义（P <0.05）；但 RNA 病毒高复制（>1.0×105）时差异未见统计学意义（P >0.05）。
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不同的核酸提取和扩增方案检测诺如病毒的方法与结果分析
世界卫生组织估计全世界每年腹泻病例高达30～50亿例次,是人类健康和公共卫生面临的重大问题.诺如病毒(Norovirus)是非细菌性急性病毒性胃肠炎暴发的主要病原[1],常在医院、学校、餐馆、家庭及其它人群中引起暴发;也是引起儿童和成人散发性急性胃肠炎的主要因素.诺如病毒属于杯状病毒科,诺如病毒属,其基因组为单股正链RNA.诺如病毒可分为5个基因组,其中GII型是引起人类感染的主要病原.
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两种 HBV -DNA 核酸提取法对荧光定量 PCR 结果的影响
目的：比较免核酸提取法与煮沸裂解法对HBV-DNA提取后荧光定量PCR检测结果的影响。方法用两种前处理方法不同的试剂盒检测7．0×102～7．0×107 IU/ml的HBV-DNA阳性标准品和84例临床小三阳患者血清，对结果进行重复性、相关性分析。并计算两种方法对低浓度HBV-DNA值的阳性检出率。结果阳性标准品HBV-DNA浓度大于103 IU/ml样本的均值两种方法比较，相关性良好（线性相关，r＝0．993），CV比较发现，免核酸提取比煮沸裂解的CV要小。临床小三阳患者84例HBV-DNA浓度在102～103 IU/ml的标本，免核酸提取法阳性检出率为25％高于煮沸裂解法的11．9％（ P ＝0．015）。结论免核酸提取法操作简单，结果稳定可靠，线性范围宽，有益于乙肝病毒感染窗口期的早期诊断。
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溶血和黄疸标本对不同核酸提取方法影响的比较
目的 比较溶血和黄疸标本对磁珠法、一步法和沉淀煮沸法三种不同核酸提取方法HBV DNA检测结果的影响.方法 制备含有不同浓度梯度血红蛋白或总胆红素的血清,使其HBV DNA浓度相同；检测过程中除核酸提取方法不同外,其余操作完全相同,进行实时荧光定量PCR检测,比较三种核酸提取方法对不同程度的溶血和黄疸标本的抗干扰能力.结果 当Hb≤0.5 g/L时,3种方法均不受影响,Hb=5.0 g/L时,一步法与沉淀煮法呈假性升高,磁珠法受影响不明显；Hb＝50.0 g/L时,3种方法均受影响明显,一步法与沉淀煮沸法可被抑制呈阴性.不同浓度的总胆红素对磁珠法与沉淀煮沸法无明显影响,对一步法产生的影响显著,其检测结果可通过调整结果判断部分参数得到修正.结论 在相同检测条件下,磁珠法对溶血和黄疸的抗干扰能力好,沉淀煮沸法次之.
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两种核酸提取方法在HCV RNA荧光定量检测中的比较
目的 比较氯仿-异丙醇法和核酸提取柱法在丙型肝炎病毒(HCV)RNA荧光定量检测中的灵敏度、重复性和抗干扰性.方法 分别用两种方法提取核酸后,采用荧光定量PCR技术检测HCV RNA含量,比较两种方法对检测灵敏度、重复性和抗干扰性的影响.结果 两种核酸提取方法的灵敏度相近,但核酸提取柱法的重复性和抗干扰能力明显优于氯仿-异丙醇法.结论 两种核酸提取方法的灵敏度差别不大,基本都能满足临床需要,核酸提取柱法更具优势.
关键词： 肝炎病毒 丙型 核酸提取 荧光定量聚合酶链反应 -
血液和尿液中巨细胞病毒DNA的检测研究
目的 探讨血液和尿液不同类型标本中巨细胞病毒(CMV)-DNA的检测研究.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对52例患者4种不同类型的血液标本和85例患者3种不同类型的尿液标本的CMV-DNA载量进行检测,比较血液和尿液不同类型标本的CMV-DNA检出率和病毒载量的差异.结果 52例患者血清、全血、血浆和外周血单个核细胞(PB M C)的C M V-D N A检出率分别为48.08％ 、71.15％ 、57.69％ 和69.23％;全血和PBMC的CMV-DNA检出率较高,差异有统计学意义(P<0.05).PBMC的定量结果较高.85例患者混合尿、尿上清和尿沉渣的C M V-D N A检出率分别为72.94％ 、62.35％ 和84.71％,尿沉渣的CMV-DNA检出率较高,混合尿的定量结果较高.结论 血液和尿液标本CMV-DNA的检测结果差异较大,在CM V感染的临床诊疗和监测中使用同一标本类型检测具有重要的临床意义.
关键词： 巨细胞病毒 实时荧光定量聚合酶链反应 核酸提取 离心柱法 -
核酸分离与纯化的原理及其方法学进展
核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术.随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域,核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展.各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现,极大地推动了分子生物学的发展.现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述.
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纳米磁珠提取法在手足口病病原RNA提取中的应用
目的 介绍纳米磁珠提取手足口病病原RNA的方法.方法 手足口病患儿临床肛拭标本240份,分别以纳米磁珠提取法和经典的Trizol提取法提取RNA,以实时荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)特异核酸片段.结果 纳米磁珠法检测EV71阳性率27.5％,CA16阳性率23.3％；Trizol法EV71阳性率26.6％,CA16阳性率22.1％,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 纳米磁珠提取法操作简单,快速高效,适合临床实验室应用于手足口病快速诊断.
关键词： 纳米磁珠提取 手足口病 核酸提取 实时荧光反转录-聚合酶链反应 -
两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒RNA检测效果的比较及应用评价
目的：比较两种核酸提取方法对实时荧光定量聚合酶链反应（FQ‐PCR）检测丙型肝炎病毒（HCV ） RNA病毒载量的影响。方法选择89例2012年10月至2013年6月在肝病中心住院的慢性丙型肝炎抗‐HCV阳性患者，分别用磁珠法和TRIZOL法提取血清标本中HCV RNA ，用FQ‐PCR技术检测 HCV RNA ，并对结果进行对比分析，统计学处理采用χ2检验和 t检验。结果89例抗 HCV阳性标本中以磁珠法提取核酸进行 HCV RNA定量检测的阳性率为73．0％（65／89），以 TRIZOL 法提取核酸进行 HCV RNA定量检测的阳性率为65．1％（58／89），两法提取方法检测阳性率比较有统计学意义（χ2＝3．76，P＜0．05）。两法所测浓度结果换算成对数值，经 t检验两者差异无统计学意义（t＝0．32，P＞0．05）。结论两种方法均可获得较高的回收率、有较高的敏感度和特异度，磁珠法提取 HCV RNA可用于HCV感染者的临床诊断和疗效观察。
关键词： 丙型肝炎 核酸提取 荧光定量聚合酶链反应 灵敏度 -
免核酸提取快速检测技术在流感病毒细胞株鉴定中的应用
目的 探索免核酸提取进行Real-time PCR在流感病毒细胞株中的应用.方法 选取甲型H1N1、H3N2、B-Yamagata、B-Victorial 4种亚型流感病毒细胞株各10株,先进行血凝实验(Hemagglutination test,HA),再进行核酸提取与病毒液用Real-time PCR分别进行甲、乙、4种亚型核酸检测,比较其CT值差异.结果 流感病毒HA几何平均滴度(GMT)和CT值的几何平均值无线性关系.甲、乙型核酸提取和不提取的CT值范围分别为10.5 ～ 14.7和10.5 ～ 18.2,甲型H1N1、H3N2、B-Yamagata、B-Victorial 4种亚型核酸提取和免提取的CT值范围分别为11.4～16.3和12.0 ～ 16.7;11.2～17.2和10.7～19.7;12.5～16.7和10.3 ～16.7;11.8 ～17.1和12.6 ～ 17.2,各型别间CT值几何平均值无差异.结论 免核酸提取在流感病毒分离时能快速检测病毒液CT值,缩短实验中间步骤.
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996例结核患者对利福平与异烟肼的耐药情况分析
耐多药结核病（MDR-TB）是造成全球结核病疫情回升的重要因素之一，也是结核病防治的难题，治疗难度大。为探讨门诊及住院MDR-TB患者的耐多药情况，指导临床选择有效的药物治疗。本文对996例结核患者结核分枝杆菌核酸检测阳性标本进行结核分枝杆菌耐药基因检测，初步观察其主要抗痨一线药利福平（RFP ）与异烟肼（IN H ）的耐药情况。现将我院2012年4月至2013年4月门诊及住院结核患者996例分枝杆菌核酸提取阳性标本进行RFP与IN H 耐药基因检测分析，以便探讨基因芯片法对 MDR-TB 快速诊断的临床意义。现报告如下。
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PEG沉淀结合碱裂解法提取DNA可消除肝素对PCR检测结果的影响
乙型肝炎病毒(HBV)感染的判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBV DNA定量的检测.其中外周血中HBV DNA定量是病毒复制直接和可靠的标志,对乙肝治疗效果的评价和预后也有重要的参考价值.临床上常采取全血或血浆作为检测标本,由于抗凝血液标本中可能存在着抑制PCR的因子,因此在进行PCR前需纯化血液标本中的核酸.通常认为用于PCR的全血标本通常首选乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝,不能使用肝素抗凝[1],认为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除[2],一些试剂厂家也明确规定"不可用肝素抗凝"[3];而我们在现实工作中经常会遇到一些血样"因误"采用了肝素抗凝容器,致使标本被退回重新采样,给实验室人员及患者带来了不便.本研究通过上述两种抗凝方法处理全血标本,采用浓缩裂解法提取DNA,观察常用肝素浓度抗凝血对实时荧光定量PCR技术检测HBV DNA的结果是否有影响.
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固相吸附核酸提取法及其在丙型肝炎病毒RNA提取中的应用
丙型肝炎病毒(HCV)是引起肝硬化、肝癌等肝脏疾病的重要病原微生物.目前检测临床标本的HCV RNA含量是判断HCV感染的"金标准".但在RNA提取过程中,广泛存在的RNA酶对HCV RNA的有效提取影响较大.固相吸附法提取临床标本中的核酸成分操作简便,核酸产量高、质量好,采用对人体无毒害作用的材料,目前该方法已在临床HCV RNA检测中广泛应用.本文将对固相吸附核酸提取法的原理及其在HCV RNA提取中的研究进展进行综述.
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探讨两种核酸提取方法对HCV－RNA检验结果的影响
目的：探讨氯仿－异丙醇法和固相吸附法两种核酸提取方法对HCV－RNA检验结果的影响。方法按照随机原则将100例丙型肝炎患者分成对照组和实验组各50例，对照组患者利用氯仿－异丙醇法来对血清核酸进行提取，实验组患者则通过固相吸附法来对血清核酸进行提取。结果对照组所提取的核酸在经过1倡104倍稀释后，能进行荧光定量PCR 检测，进一步稀释则不能检测。实验组所提取的核酸在经过1倡105倍稀释后，能进行荧光定量PCR 检测，进一步稀释则会小于检测限。实验组检测阳性率84．0％（41／50）显著高于对照组检测阳性率68．0％（34／50），两者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。两种核酸提取方法在血红蛋白浓度为5g／L 时，抗干扰能力比较差异无统计学意义（＞0．05）；两种核酸提取方法在血红蛋白浓度为50g／L时，抗干扰能力比较差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论在进行核酸提取时，固相吸附法所提取的 HCV －RNA阳性率和灵敏度更高，抗干扰能力能更加理想。
