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成纤维细胞与细胞外基质在皮肤创伤修复中的相互作用及其调控
皮肤创伤修复依赖于细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的相互作用.成纤维细胞(fibroblast,Fb)是主要修复细胞,在某些趋化因子的作用下,由创周向创面移位,并分泌大量的ECM如胶原蛋白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层连蛋白(liminin,LN)[1,2]、体外黏连蛋白(vitronecftn,VN)、蛋白多糖(proteoglylans,PG) 等.Fb-ECM相互作用时,一方面Fb 增殖,合成分泌ECM填充缺损;另一方面,ECM起着支架和连接作用,并调节Fb的发育、移位和增殖.在某些细胞因子作用下,Fb过度增殖,致ECM异常沉积,则可形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩. 笔者综述了皮肤创伤修复过程中Fb-ECM的相互作用及其调控的研究进展.
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细胞凋亡的调控与增生性瘢痕的防治
瘢痕形成是高等哺乳动物创伤愈合的自然结局，但瘢痕异常增生则产生病理性瘢痕，通常包括增生性瘢痕（hypertrophic scar）和瘢痕疙瘩(keloid)。增生性瘢痕是因愈合瘢痕高出创面数毫米至数十毫米而得名（区别于正常愈合瘢痕），但一般不超过创缘（区别于瘢痕疙瘩）。增生性瘢痕的形成机制尚不清楚，一般认为，它是由于各种原因引起成纤维细胞异常增殖，胶原大量合成，导致细胞外基质中胶原过度沉积所致，故临床上多采用抑制细胞增殖和(或)调控胶原代谢的策略来进行防治。但是，大量临床实践表明，采用如此策略来防治增生性瘢痕不能取得满意疗效。近年来，在创伤愈合中的细胞凋亡现象备受关注，细胞凋亡不仅参与正常创伤愈合的组织重建，而且与增生性瘢痕的形成、消退密切相关，调控细胞凋亡可能是增生性瘢痕防治的一条新途径。
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富血小板血浆与创伤愈合
创伤愈合是一复杂的生物学过程,多年来对急、慢性创面的治疗一直困扰着临床医生.一方面因为各种因素(如糖尿病、相关组织疾病、血管化不良等系统性原因,以及感染、蛋白水解酶活性增高的局部性原因)致使创面难以愈合,甚至发展成为恶性;另一方面,即使伤口愈合,在上皮化的过程中,却产生了瘢痕性挛缩、增生性的瘢痕或瘢痕疙瘩等病理性的愈合方式.
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人瘢痕疙瘩成纤维细胞相关基因表达及青蒿琥酯的作用
目的 验证瘢痕疙瘩Fb中是否存在钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)和分化抑制因子1(ID1)的异常表达,观察青蒿琥酯对二者的影响. 方法 收集笔者单位患者手术后废弃的瘢痕疙瘩样本15个和正常皮肤组织样本12个,采用组织微粒贴壁法行Fb原代培养,取第3～8代细胞用于实验.免疫荧光染色观察2种Fb中CASK和ID1的表达,瘢痕疙瘩Fb用不同浓度青蒿琥酯作用不同时间,通过噻唑蓝比色法确定药物的半数抑制浓度(IC50)并作为后续实验药物干预浓度.选取正常皮肤Fb设为正常对照组(添加培养液处理),收集瘢痕疙瘩Fb分为瘢痕对照组(添加培养液处理)及瘢痕给药组(添加含IC50青蒿琥酯的培养液处理),流式细胞术检测各组Fb细胞周期和凋亡的变化,RT-PCR、蛋白质印迹法检测各组Fb中CASK和ID1的基因与蛋白表达情况.对数据行单因素方差分析及LSD-t检验. 结果 瘢痕疙瘩和正常皮肤Fb中均存在CASK和ID1表达,选择75 mg/L青蒿琥酯为后续实验干预浓度.(1)G0/G1期和G2/M期的细胞百分比3组之间比较,差异有统计学意义(F值分别为118.064、163.840,P值均小于0.01).其中瘢痕给药组G0/G1期为(91.4±1.4)％,明显高于瘢痕对照组的(80.7±0.3)％和正常对照组的(82.4±0.6)％(t值分别为12.740、9.872,P值均小于0.05)；G2/M期为(6.9±0.3)％,明显低于瘢痕对照组的(13.7±0.3)％和正常对照组的(12.7±0.8)％(t值分别为43.702、12.276,P值均小于0.05).(2)早晚期细胞凋亡率3组之间比较,差异均有统计学意义(F值分别为61.879、4710.862,P值均小于0.01).其中瘢痕给药组早期凋亡率为(7.1±1.0)％,明显高于瘢痕对照组的(2.6±0.4)％和正常对照组的(2.7±0.3)％(t值分别为7.974、7.767,P值均小于0.05)；晚期凋亡率为(14.9±0.3)％,明显高于瘢痕对照组的(2.3±0.3)％和正常对照组的(2.5±0.4)％(t值分别为72.882、69.792,P值均小于0.05).(3)瘢痕对照组CASK基因表达量为0.658±0.024,低于正常对照组的1.076±0.008(t =28.997,P＜0.01)；瘢痕给药组的基因表达量为0.855±0.008,较瘢痕对照组上升(t=13.549,P＜0.01).瘢痕对照组CASK蛋白表达量为0.067±0.007,低于正常对照组的0.179±0.015(t=12.042,P＜0.01)；瘢痕给药组为0.132±0.010,较瘢痕对照组上升(t=9.498,P＜0.01).(4)瘢痕对照组ID1基因表达量为0.416±0.006,高于正常对照组的0.317±0.020(t=8.299,P＜0.01)；瘢痕给药组为0.217±0.009,较瘢痕对照组下降(t=32.417,P＜0.01).瘢痕对照组ID1蛋白的表达量为0.789±0.034,高于正常对照组的0.366±0.029(t=16.341,P＜0.01)；瘢痕给药组为0.114±0.006,较瘢痕对照组下降(t=33.978,P＜0.01). 结论 推测CASK和ID1参与了瘢痕疙瘩Fb的增殖过程,青蒿琥酯抑制瘢痕疙瘩Fb增殖的机制可能与上调CASK和下调ID1表达有关.
关键词： 瘢痕疙瘩 成纤维细胞 青蒿素类 钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶 分化抑制因子1 -
人瘢痕疙瘩来源干细胞的生物学特性鉴定
目的 分析人瘢痕疙瘩来源干细胞的生物学特性,为进一步研究该细胞在瘢痕疙瘩形成中的作用提供参考.方法 以人瘢痕疙瘩为研究对象,采用酶消化法及传代培养法分离筛选瘢痕疙瘩干细胞.选取原代和(或)第3代贴壁细胞进行生物学特性鉴定:加入CD29-藻红蛋白(PE)、CD34-PE、CD44-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD90-FITC、CD45-多甲藻黄素叶绿素蛋白抗体,流式细胞仪检测细胞表面分子标记物CD29、CD34、CD44、CD45及CD90的表达及细胞周期;加入小鼠抗人细胞角蛋白19(CK19)即用型单克隆抗体、鼠抗波形蛋白即用型单克隆抗体,免疫细胞化学法检测CK19、波形蛋白的表达;RT-PCR检测细胞Oct4的表达.取第1代细胞,应用成骨细胞、成脂肪细胞、软骨细胞诱导分化培养液进行诱导分化实验,观察细胞的多向分化能力.结果 传代培养后,细胞形态较为均一,以梭形为主,排列不规则.流式细胞仪检测表明,该细胞高表达CD29、CD44、CD90等间充质干细胞表面标记物,低表达CD34、CD45等造血干细胞表面标记物.细胞周期分析显示67.66%的细胞处于G0/G1期,26.24%的细胞处于G2/M期,6.11%的细胞处于S期.免疫细胞化学法检测显示细胞波形蛋白表达呈阳性、CK19表达呈阴性.RT-PCR法检测显示细胞Oct4表达呈阳性.诱导分化实验表明,细胞可向成骨细胞、软骨细胞和成脂肪细胞分化,具有多向分化潜能.结论 人瘢痕疙瘩内存在间充质样干细胞,这种干细胞可能在瘢痕疙瘩形成中发挥重要作用.
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γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用
目的 了解γ干扰素(IFN-γ)对瘢痕疙瘩Fh(KFb)中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN一γ治疗病理性搬痕的可能机制. 方法 切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞.(1)将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β_1组,用10 ng/mL的TGF-β_1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β_1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β_1与100 nS/mL的IFN-γ联合作用.采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达与阳性细胞表达情况.(2)另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达.(3)另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ns/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组.同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达. 结果 (1)IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组(0.024±0.013与1.229±0.011)显著减少(P<0.05);TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β_1组(1.331±0.298与1.727±0.004)显著减少(P<0.01).IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度(0.922±0.059)和α-SMA蛋白表达量(0.3051±0.0031)较对照组(1.055±0.005与0.4513±0.0094)显著减少(P<0.01);TGF-β1+IFN-γ组SMA阳性KFb荧光强度(1.129±0.004)和SMA蛋白表达量(0.6734±0.0098)较TGF-β_1组(1.270±0.005与1.38420.0024)显著减少(P<0.01).(2)10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前(P<0.01);其蛋白表达量于作用后2~8 h显著低于作用前(P<0.01).而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前(P<0.05).(3)与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05或P<0.01),Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01),且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著. 结论 IFN-γ呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β_1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad 信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.
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瘢痕疙瘩分泌性卷曲相关蛋白2与骨母细胞特异性因子2的相互作用
目的 验证分泌性卷曲相关蛋白2(SFRP2)与骨母细胞特异性因子2(OSF-2)的相互作用.方法 构建能在哺乳动物细胞中表达带人膜联蛋白(HA)标签的OSF-2融合蛋白重组载体pCMV-HA-OSF-2,经酶切鉴定确认后,与Myc-SFRP2重组真核表达载体pCMV-HA-SFRP2单独或共转染人HK293细胞,利用免疫共沉淀技术及蛋白质印迹法验证OSF-2与SFRP2的相互作用.结果 重组载体经酶切电泳后,显示近800 bp处的条带为酶切后的目的 片段SFRP2编码基因,近2500 bp处的条带为酶切后目的 基因OSF-2.表明pCMV-Myc-SFRP2和pCMV-HA-OSF-2均构建成功.HK293细胞单独转染pCMV-Myc-SFRP2或pCMV-HA-OSF-2后,未检测到HA-OSF-2的表达;当pCMV-Myc-SFRP2和pCMV-HA-OSF-2共转染后,经Myc抗体进行免疫沉淀可见HA-OSF-2表达.结论 HA-OSF-2的重组载体能在哺乳动物细胞中表达,HA-OSF-2与SFRP2间存在相互作用.
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野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及代谢影响的实验研究
目的探讨野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts, KFb)生长增殖及DNA合成代谢的影响. 方法构建含p16cDNA片段的真核表达载体pcDNA3-p16,采用脂质体介导的基因转染法,将其导入体外培养的KFb中,并用G418筛选阳性克隆.随后对已转染及未转染的KFb进行免疫细胞化学染色,观察p16蛋白的表达,并通过绘制细胞生长曲线及采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法,比较转染前后细胞在生长增殖及DNA合成代谢方面的变化.结果经酶切鉴定证实,pcDNA3-p16构建成功.已转染的KFb经G418筛选,出现阳性克隆,并有p16蛋白表达;与正常KFb比较,其生长增殖速度明显减缓,DNA合成代谢能力明显减弱(P<0.05). 结论 p16基因对KFb的生长增殖及DNA合成代谢有明显的抑制作用.
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切除高于皮面部分瘢痕移植中厚皮治疗胸部瘢痕疙瘩13例
胸部特别是胸骨柄与两乳头连线形成的三角形区域,通常被称为“手术禁区”,是人体易形成瘢痕的部位之一.目前治疗瘢痕有效的方法仍是手术切除,但术后复发率极高,国外报道达80％[1],国内报道为45％～100％[2].而且瘢痕复发后成倍增生,治疗难度加大[3].瘢痕是创伤修复的必然产物[4],难以完全切除,只要不影响机体正常功能及美观,治疗时不必过深切除.2008-2010年,我们采用仅切除高于皮面部分瘢痕并用中厚皮片移植覆盖创面的方法,治疗13例胸部瘢痕疙瘩患者,疗效较好.
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核心摘除术加局部注射曲安奈德治疗瘢痕疙瘩36例
2003年1月-2006年12月,我科对36例瘢痕疙瘩患者采用核心摘除术加局部注射曲安奈德治疗,取得预期疗效,现报告如下.
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复合移植术后局部注射激素治疗瘢痕疙瘩12例
瘢痕疙瘩由于手术切除后容易复发,其治疗一直是整形外科的一个难题.2003-2006年,笔者应用脱细胞异体真皮加自体表皮复合移植治疗瘢痕疙瘩患者12例,术后注射皮质类固醇激素辅助治疗,效果满意.
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介绍一种自制瘢痕注射器
瘢痕内含有大量胶原纤维,组织致密,为解决用普通注射器向瘢痕内注射类固醇等药物的难题,笔者设计了瘢痕注射器,对面部及功能部位烧伤后出现增生性瘢痕(面积﹤5 cm2)及少量瘢痕疙瘩的36例患者进行治疗,效果良好.现介绍如下.
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用于瘢痕注射的注射器助力件
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织致密、坚硬,注射时需要用很大的力.应用玻璃注射器及一次性塑料注射器进行瘢痕注射时,因没有着力点,操作十分困难.据此,笔者设计了一个简单的附加于一次性塑料注射器的助力件,称注射器助力件,临床应用效果良好.
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透明细胞小汗腺癌一例
患者女,34岁,因枕部头皮肿块3个多月入我院.病史:患者2年前因头皮疣状痣在外院行冷冻治疗,其后头皮出现肿块并局部凸起,诊断为瘢痕疙瘩并行抗瘢痕处理,效果不佳,随后肿块逐渐扩大.转入我院时见枕部头皮有1个2 cm ×2 cm ×2 cm大小的肿块,高于皮面,质硬,色暗红,与周围组织分界不清,无破溃及移动,轻度压痛(图1a).予以手术切除,术中切开肿块部位皮肤、皮下组织,切取部分肿块组织送快速冰冻切片检查,提示为透明细胞小汗腺癌.随即扩大切口,自病灶外2 cm范围内予以切除达枕肌浅层,清理周围瘢痕组织,创面移植全厚皮.肉眼观察切除物,见切面中心部位色泽明显加深,质地坚韧致密(图1b).
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丹参总酮对体外模拟人增生性瘢痕的作用
增生性瘢痕是创伤及深度烧伤后常见的病理性愈合现象.寻求有效防治增生性瘢痕的方法是创伤修复领域的重要课题.中药治疗增生性瘢痕历史悠久[1],其毒性作用及不良反应轻微,但机制不明.丹参广泛用于心血管疾病、皮肤病及胶原代谢疾病等领域,也常用于治疗或预防增生性瘢痕及瘢痕疙瘩,有文献报道其疗效显著[2].本研究中,笔者选择丹参总酮为研究用药,将其用于体外人增生性瘢痕三维模型,观察其抑制瘢痕增生的效果,以期为临床上防治增生性瘢痕提供实验依据.
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转化生长因子β1Ⅱ型受体CA重复序列基因在人正常皮肤和瘢痕疙瘩中的表达
瘢痕疙瘩的生物学特性类似于肿瘤.近研究表明,转化生长因子β1Ⅱ型受体(transforming growth factor-β1 receptorⅡ,TβRⅡ)是一种新的抑癌基因,而肿瘤细胞中常见的是该基因表达异常[1].本研究主要是通过改变TβRⅡ基因突变的热点CA重复序列,以检测瘢痕疙瘩成纤维细胞是否存在与肿瘤细胞同样的基因突变.
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补体末端复合物在瘢痕疙瘩中的表达
近20年来的研究表明,免疫学相关因素在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的发病中具有重要作用[1-3].瘢痕疙瘩患者血清中免疫球蛋白、补体及其活化产物--可溶性补体末端复合物(SC5b-9)较对照组明显增高,由此表明,患者免疫系统状态发生改变[4].在此基础上,笔者对补体末端复合物(C5b-9)及C3、IgG、IgA、IgM在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达进行观察,为研究瘢痕疙瘩组织局部的免疫状态提供依据.
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瘢痕疙瘩病灶内药物注射治疗的研究进展
Keloid is characterized by tumor-like invasive growth,high incidence,and low remission rate.The pathogenesis of keloid is still unknown.Keloids can not only affect appearance,but also cause severe itching and pain,which may affect physical and mental health of patients.Previous treatments for keloids include surgery,drugs,lasers and so on.Due to the high recurrence rate of surgical treatment accompanied by keloid enlargement,drug therapy has gradually become a hot topic.Among various methods of administration,intralesional injection is widely accepted as it can promote drug absorption to achieve better results.The progress of several drugs used in intralesional injection therapy for keloid is reviewed in this paper.
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CD26与增生性瘢痕及瘢痕疙瘩关系的研究进展
In recent years,researchers have found that CD26 (dipeptidyl peptidase 4) is closely related to the formation and development of many fibrotic diseases.Hypertrophic scar,keloid,and other skin fibrosis diseases are major problems nowadays,which may affect the patient's appearance and cause joints deformity and dysfunction due to scar contracture.This article briefly reviews the relationship between CD26 and hypertrophic scar and keloid to provide new insights into the treatment of skin fibrotic diseases.
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血管生成抑制剂治疗病理性瘢痕的研究进展
Angiogenesis inhibitors are a class of agents that prevent the angiogenesis by inhibiting the activation,migration,and proliferation of endothelial cells.In recent years,studies have found that there was a close relationship between the occurrence of pathological scars and angiogenesis.The vascular density in pathological scars is significantly higher than that in normal skin and scars.Neovascularization supports the fibroblasts growth and collagen production,which contribute to the development of pathological scars.Therefore,the angiogenesis inhibitor may become a possible agent for prevention and treatment of pathological scars.This review explores the relationship between pathological scars and angiogenesis inhibitor.
