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内吗啡肽的构效关系研究
疼痛药物的研发一直是全球性的热点和难点.阿片类药物在其中占有重要的地位,然而它们在起到镇痛作用的同时往往伴随很多副作用.20世纪70年代起,多个阿片受体亚型被相继克隆出来,并且相应的内源性配体不断发现,但是μ阿片受体的内源性配体--内吗啡肽(endomorphins) 的发现却经历了较长一段时间,直到1997年,Zadina 等[1]于牛脑中发现了2个四肽,分别命名为endomorphin-1 (EM-1)和endomorphin-2(EM-2).之后韩济生等[2]建议它们的中文译名为内吗啡肽-1和内吗啡肽-2.
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猪苓菌核自噬相关基因 ATG8的克隆及表达分析
目的：克隆分离猪苓自噬相关基因 ATG8，并探讨其在猪苓防御蜜环菌入侵过程中的作用。方法以猪苓菌核为材料，采用 RT-PCR 方法得到自噬相关基因的开放读码框全长，并利用荧光定量 PCR 检测该基因在不同猪苓菌核部位的表达量。结果该基因开放读码框为387 bp，编码128个氨基酸；该蛋白分子量为14.838 kD，理论等电点为5.85。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示 PuATG8与蚁巢伞属（termitomyces sp.）亲缘关系近，与皱革菌（Punctularia strigosozonata）、密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）有较高的同源性。PuATG8为ATG 家族同源基因。荧光定量 PCR 结果表明，PuATG8在未被蜜环菌侵染的猪苓菌核及被蜜环菌侵染的菌核中都有表达，其中被侵染部分的表达量显著上调。结论 PuATG8可能参与了猪苓菌核的防御反应。
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我国"治疗性克隆"研究面临的机遇和挑战
近年来,国际上有关"克隆"研究技术进展迅速,其中"治疗性克隆"研究在医药卫生界展现出令人鼓舞的前景.尽管在某些问题上一直存在争议,但在全球范围内研究热情依然高涨.在这种形势面前,抓住机遇,赶超世界领先水平,推动生命科学发展,促进人类文明进步,是我国生命科学界神圣的使命,也是义不容辞的责任和义务.本文就目前"治疗性克隆"研究概况等问题作一评述,并对我国应采取的对策提出初浅的建议.
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黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤及其转化细胞的克隆性
目的 分析黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)中转化与未转化肿瘤细胞间的克隆联系.方法 选具有大细胞转化的、可用于激光显微切割的MALT淋巴瘤6例为研究对象,采用EliVisionTM方法检测bcl-10等蛋白表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测API2-MALT1融合基因,激光显微切割进行目的细胞群分离,PCR检测免疫球蛋白重链(IgH)基因重排并对产物进行测序分析.结果 伴有转化的6例中1例胞质和胞核同时表达bcl-10蛋白,2例检测出API2-MALT1融合基因.同一例不同肿瘤细胞群分别显示同样的基因重排序列.例2和例5在N区和D区有两个核苷酸位点的碱基不同.结论 伴有转化的6例MALT淋巴瘤转化和未转化肿瘤细胞群均分别来自同一个肿瘤克隆.
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多发性子宫平滑肌瘤的克隆性
目的探讨磷酸甘油酸激酶(PGK)位点克隆性分析技术对于确定局灶性或结节性病变的克隆组成的意义,以及子宫平滑肌瘤的克隆性及多发性肌瘤不同瘤结节之间的关系.方法提取103例子宫平滑肌肿瘤新鲜组织DNA,Hpa Ⅱ消化,巢式聚合酶链反应扩增PGK基因,产物经Bst Ⅺ消化后,琼脂糖凝胶电泳显示结果.结果 103例组织标本中,32例(31%)具有Bst Ⅺ酶切位点的多态性.对其中29例共89个瘤结节进行了检测,显示所有瘤结节均为单克隆性;1 例多结节的平滑肌肉瘤中,检查过的7个瘤结节均为同一PGK等位基因被灭活;而多发性子宫平滑肌瘤不同瘤结节之间的关系较复杂,其酶切带型可以完全相同(8/15)或大部分相同( 2/15),也可以完全不同(5/15).这种差别与瘤组织核分裂象指数无关.结论 P GK克隆性分析技术可用于确定局灶性或结节性病变的克隆组成;子宫平滑肌瘤是单克隆起源;多结节的子宫平滑肌瘤可能有各自独立型、局部侵袭型以及二者的混合型三种.
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趋化因子CXCL12在肿瘤微环境中的作用
趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1,SDF-1),由Tashiro等[1]首先从骨髓间质细胞中克隆出来,随后被确定为前B细胞刺激因子(pre-B cell stimulatory factor,PBSF)、T细胞和单核细胞趋化因子,在B淋巴细胞和骨髓细胞生成中发挥重要作用.
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单细胞测序研究淋巴细胞免疫球蛋白基因重排
淋巴结生发中心的研究有其特殊性，即细胞组成相当复杂，采用常规的全组织研究往往不能针对所需要的细胞。1993年Hansmann等［1］建立了一种从组织切片上提取单个淋巴细胞并进行聚合酶链反应(PCR)的研究方法。该方法的大优点在于能够针对所需细胞进行相应的分子生物学研究，主要被应用于霍奇金病中R-S细胞的起源研究［2］。近，该技术又有了进一步的发展，即出现了单个细胞的DNA测序技术。应用该技术能够获得有关体细胞超突变、克隆相关性，克隆内差异（interclonal diversity）和延续性突变（ongoing mutation）的信息。我们对1例滤泡反应性增生性淋巴结进行了单个细胞PCR和单细胞测序研究，以探讨这些技术在淋巴结研究中的价值。
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乳腺癌中雌激素α受体36与HER2表达的相关性
雌激素α受体（ ERα）36是相对分子质量为36000的ERα剪接变异体，由Wang等［1］在2005年首次确定并克隆。ERα36的表达失调与包括乳腺癌在内的大多数疾病有密切关系。我们利用乳腺癌细胞系MCF-7，通过高表达ERα36蛋白后检测细胞内相关蛋白表达量的变化，分析ERα36与HER2及维甲酸受体（ RAR）之间可能的调节机制。
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慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤可转化为指状树突细胞肉瘤
指状树突细胞位于淋巴结副皮质区,是一种抗原递呈辅助细胞,可以与T细胞相互作用,并且在淋巴结反应性病变中呈增生表现.指状树突细胞肉瘤(IDCS)是起源于指状树突细胞的一种罕见肿瘤,曾有报道慢性淋巴细胞白血病//小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)患者可伴随发生IDCS,但是尚未证实这两类肿瘤之间存在克隆关系.近,Fraser等分析了1例伴随发生IDCS的CLL/SLL病例,并且证实两者之间存在一定的克隆关系.
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两例食管癌肉瘤克隆来源的分子生物学分析
一、材料、方法和结果1.临床病理情况:例1男,56岁.肉眼可见食管中段外生性10.0 cm×4.5 cm肿块,灶性褐色浅表溃疡.切面灰白.组织学见分化差非角化鳞状细胞巢及纤维肉瘤成分混合存在.两种瘤细胞成分均有丰富的核分裂象.分期pT2NOM0,分级Ⅲ.患者术后5个月死于复发.例2男,59岁.食管中1/3段6.6 cm×3.5 cm×2.6 cm息肉状肿块,表面灶性溃疡.切面灰白色,灶性红色.组织学见不同分化程度的鳞状细胞癌.另见网格状分布的基底细胞样癌成分.以上两种成分之间,纤维肉瘤细胞散在分布.分期pT3NOM0,分级Ⅰ～Ⅳ.术后10个月死于肿瘤复发.
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河南省分离的HIV-1 B-Thai亚型流行株全基因组克隆及序列分析
目的克隆、鉴定自河南省分离的HIV-1 B-Thai亚型流行株并进行系统发育分析.方法收集河南省1份HIV-1感染者全血后分离的淋巴细胞,在植物血凝素存在下与健康献血员淋巴细胞共培养,从培养的淋巴细胞中提取前病毒DNA.在HIV-1基因的长末端重复序列的保守区设计引物,利用LA Tag长链扩增系统扩增HIV-1全长基因,纯化的PCR产物与pWSK29-T载体连接,成功克隆CNHN 24株.对鉴定的3个克隆进行全长测序,利用局部同源法计算同源率,同时采用Phylip软件绘制HIV-1 Env、Gag和Pol基因的进化树.结果V3V4环序列分析表明:本次克隆的CNHN 24株病毒为HIV-1 B-Thai亚型,V3环区氨基酸序列比对发现在9个位点发生氨基酸替换.在含有9 010 bp,全长HIV-1基因的CNHN 24株克隆中未发现明显的缺失、插入和重排现象,Gag、Pol、Vpr和Vif基因与RL42株的同源率达到95.42％～97.08％,进化分析显示,CNHN 24株与RL 42株的遗传距离近.结论HIV-1 CNHN24株为国内实验室完成的HIV-1全长基因克隆,为进一步研究HIV-1流行特征提供了基础.
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程序死亡蛋白1基因的克隆及原核表达
目的 克隆人程序死亡蛋白(PD-1)基因并构建PD-1蛋白的原核表达质粒,在大肠埃希菌中进行表达.方法 用RT-PCR的方法从慢性乙肝患者外周血淋巴细胞总RNA中逆转录得到PD-1基因的cDNA,构建PD-1基因的原核表达质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化.用SDS-PAGE、DNA测序、氨基酸测序等方法对表达蛋白进行鉴定.结果 克隆到PD-1基因编码区全长序列cDNA,经DNA测序与已报道的序列同源性达99.8%.构建得到PD-1的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化获得纯度较高的PD-1蛋白.氨基酸测序证明表达蛋白的正确性.结论 成功克隆人PD-1基因,在大肠埃希菌中获得表达,得到纯化的PD-1蛋白,为进一步研究PD-1蛋白的功能及应用打下基础.
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新成人腹泻轮状病毒J19株NSP1、NSP2和NSP3基因序列分析
目的 克隆新成人腹泻轮状病毒J19株三个非结构蛋白NSP1、NSP2和NSP3基因,并分析其基因序列.方法 利用一种改进的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增J19株三个基因,克隆到pMD18-T载体中并进行测序.在此基础上,将J19株的NSP1、NSP2和NSP3的蛋白序列与其他轮状病毒蛋白序列进行比较分析和种系进化分析.结果 J19株的NSP1、NSP2和NSP3基因为基因5、7和8,它们的全长1307个、1004个和932个核苷酸,编码395个、297个和262个氨基酸.与J19株的NSP1、NSP2和NSP3蛋白序列一致性较高的分别是B组轮状病毒KB63株(26.3%)、WH1株(46.6%)和IDIR株(29.6%).对J19株的NSP1、NSP2和NSP3的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置都靠近A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向于B组轮状病毒的分支.结论 J19株的NSP1、NSP2和NSP3与其他轮状病毒的相应蛋白序列存在显著差异.J19株NSP1、NSP2、NSP3的蛋白序列比较和遗传进化分析表明新成人腹泻轮状病毒与成人腹泻轮状病毒可能有共同起源;但是新成人腹泻轮状病毒与成人腹泻轮状病毒存在显著差异.
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应用In-Fusion技术构建HBV基因组全长重组质粒及序列分析
目的 研究In-Fusion技术在HBV全进组克隆中的应用,并分析所获得的的序列信息.方法 在浙江杭州地区收集23份慢性乙型肝炎患者血清,提取病毒核酸,分别设计PCR引物扩增病毒基因组和pMD18T载体,采用In-Fusion方法构建基因组测序质粒,并对序列进行分析.结果 成功扩增出了23条HBV基因组序列,向NCBI提交的24株HBV全长序列,测序结果分析显示,B基因型11例,C基因型12例,没有B+C型,发现YMDD耐药株1例.结论 In-Fusion技术构建重组质粒是一种高效的连接方法,提高了连接率与成功率,可以大大简化目的片段与载体的连接,有效避免了在连接过程中常见的载体自连现象,探索了该技术在HBV序列研究中的初步应用.本研究丰富了我国的HBV全长基因组数据库,为HBV基因组特点、变异、药物、疫苗研究以及乙型肝炎的个体化治疗提供了参考依据.
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海南岛两株甲病毒基因组3＇末端核苷酸序列的克隆与分析
目的 从分子水平鉴定海南省分离的两株甲病毒(HBb17和M1病毒)。方法 采用RT-PCR方法 ，分别扩增两株病毒基因组的3＇末端核苷酸序列，扩增产物经亚克隆，筛选重组子并测定核苷酸序列对序列进行分析。结果 HBb17和M1病毒分别扩增出约1.6kb和1.3kb的特异片段。序列分析表明，在3＇末端非翻译区HBb17病毒与罗斯河病毒(国际标准株T48病毒)核苷酸同源性为99％，M1病毒与鹭山病毒(SAG)同源性为98％；两病毒结构基因的E1区序列，HBb17病毒与罗斯河病毒核苷酸(氨基酸)同源性为99％(99％)，M1病毒与鹭山病毒核苷酸(氨基酸)同源性为97％(99％)，M1病毒与盖塔病毒同源性为94％(98％)。结论 序列分析表明，海南岛分离的HBb17病毒属于罗斯河病毒，M1病毒可能是鹭山病毒或盖塔病毒的变异株。
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含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的辛德毕斯病毒的制备与鉴定
目的 制备含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的辛德毕斯病毒,并对其进行鉴定.方法 采用融合PCR技术将报告基因EGFP融合到辛德毕斯病毒XJ-160感染性克隆pBR-XJ160的结构基因编码框后,并在报告基因前面添加亚基因启动子SP6,通过反向遗传学技术拯救得到EGFP标记的辛德毕斯病毒.结果 成功拯救并获得了EGFP标记的XJ-160病毒,该重组病毒具有良好的荧光表达特性和遗传稳定性.结论 EGFP标记的辛德毕斯病毒可用于观测病毒的侵染轨迹,为进一步研究辛德毕斯病毒嗜性、生物学功能,以及感染机制奠定了基础.
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肠道病毒71型(EV71)AH3株感染性克隆的构建与鉴定
目的 构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71) AH3株的全基因序列感染性克隆.方法 通过分段扩增和酶切连接将EV71全基因组cDNA片段逐步克隆入PWSK29载体,构建含全病毒基因组序列的重组质粒.转染Vero细胞后,获得拯救病毒.经RT-PCR、酶切、测序、间接免疫荧光(IFA)等方法进行鉴定.结果 酶切鉴定结果与预期一致,序列分析显示为EV71基因；其转染Vero细胞后,可观察到典型的细胞病变；所获得的拯救子代病毒滴度(TCID50)为107.5；IFA检测可见感染细胞出现绿色荧光.结论 成功构建EV71全基因序列感染性克隆,为病毒致病机理及减毒疫苗的研究奠定基础.
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脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ全基因序列克隆的构建及鉴定
目的 构建脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ的全基因序列克隆.方法 利用分子生物学技术,通过分段扩增和酶切连接逐步构建插入脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ全基因序列的质粒,采用单引物二次PCR法引入点突变,并通过酶切、测序等方法进行鉴定.结果 在pWSK29载体中成功插入脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ全基因序列,酶切鉴定正确,序列测定显示有9个核苷酸变异.结论 成功构建脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ的全基因序列克隆,为进一步改造并研究其功能特别是3D聚合酶的功能打下了基础.
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高尔基体蛋白73原核表达系统的构建及单克隆抗体的制备
目的 克隆、表达高尔基体蛋白73(GP73),并制备单克隆抗体.方法 用逆转录聚合酶链反应法从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增GP73编码序列,将产物与pQE31载体连接,转化人大肠埃希菌BL21,诱导表达后通过His标签进行纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,采用常规的细胞融合技术制备单克隆抗体,并对其进行鉴定.结果 重组载体经序列分析与报道序列同源性100％,并获得了重组蛋白.筛选出5株能稳定分泌抗GP73的单克隆抗体杂交瘤细胞株,免疫球蛋白类型有2株为IgG1类.Western Blot印迹显示这些单抗能特异结合GP73蛋白.结论 成功构建了人高尔基体蛋白73原核表达体系,并获得了单克隆抗体.
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人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备高灵敏度和高特异性的人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白抗体并对其效价进行初步评估.方法 构建含有H5N1亚型禽流感病毒NS1序列的pET-28a(+)重组载体的大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达NS1蛋白,并经Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得NS1重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定.以纯化的蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗NS1血清,亲和纯化获得多克隆抗体.应用ELISA和Western Blot检测纯化抗体的效价和特异性.结果 NS1融合蛋白得到高表达,且纯度＞90％,用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后得到的抗NS1多克隆抗体,效价达1∶80 000,并特异性识别H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白.结论 获得了NS1多克隆抗体,具有较好的效价和特异性.
