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EPEC O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78(Chlr Norr)ompA基因原核表达载体重组构建
目的 构建PThioHisA-ompA重组质粒. 方法 根据GenBank中大肠埃希菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从大肠埃希菌O2、O78及其融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)序列,进行序列测定及分析.重组PMD-18-ompA经双酶切切下ompA片段,电泳回收;原核表达载体PThioHisA质粒双酶切,回收大片段.再将回收的ompA插入回收大片段原核表达载体PThioHisA上. 结果 按预期PThioHisA-ompA重组质粒PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在约1 kb处有一清晰条带,与预期值相符. 结论 成功构建PThioHisA-ompA重组质粒,为致病性大肠埃希菌基因疫苗的抗原筛选和构建奠定了实验基础.
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刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化
[目的]克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化.[方法]用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体；IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白.[结果]从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别.[结论]原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测.
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日本血吸虫蛋白磷酸酶PP2C-1的原核表达及活性分析
目的 构建日本血吸虫PP2C-1蛋白磷酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析. 方法 从日本血吸虫基因组数据库中找到一个可能编码PP2C-1蛋白磷酸酶的基因Sj-PP2C-1,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区与pET28a表达载体连接后转化大肠埃希菌并用IPTG诱导表达,对表达产物的磷酸酶活性进行分析. 结果 成功构建了Sj-PP2C-1蛋白磷酸酶表达载体,其编码区能够在大肠埃希菌中表达分子质量单位为40 ku的目的蛋白;采用V2460系统进行检测,Sj-PP2C-1具有PP2C磷酸酶活性. 结论 Sj-PP2C-1基因原核表达产物具有蛋白磷酸酶活性,为研究PP2C类蛋白磷酸酶的功能打下了基础.
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淡色库蚊β-肌动蛋白基因克隆与序列分析
目的获取淡色库蚊β-肌动蛋白全长基因. 方法采用RACE法筛选淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表达文库,获得β-肌动蛋白基因的5′和3′RACE序列,然后通过T/A克隆插入pGEM-T质粒载体,经过测序、拼接获取全长序列.用BLASTp软件将该基因推导的氨基酸序列与蛋白质公共数据库Swissprot比对、分析. 结果获得淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列,总长度为1 290 bp,开放阅读框为1 132 bp,编码377个氨基酸(GenBank/NCBI AY100005).推导的氨基酸序列与公共数据库比对,发现与冈比亚按蚊和黑腹果蝇的β-肌动蛋白的同源性均为91%.蛋白质的理论分子质量为41.7 ku,等电点(PI)为5.4. 结论获得了淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列,为蚊虫分子生物学的进一步研究奠定了基础.
关键词： 淡色库蚊 β-肌动蛋白 克隆 序列分析 cDNA快速末端扩增 -
编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建
目的构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备. 方法用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组DNA;用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原P30、P22的基因片段,分别重组入pMD18-T载体中.将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入pUC18克隆载体中, pUC18-P30-P22中的P30-P22片段经酶切、纯化后,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定. 结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆pUC18-P30-P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3.1-P30-P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致.结论成功构建弓形虫pUC18-P30-P22重组质粒和pcDNA3.1-P30-P22重组质粒,为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础.
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日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析
目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.
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微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的克隆及表达
目的构建微小隐孢子虫表面抗原CP23基因表达载体并获得重组表达蛋白. 方法用微小隐孢子虫卵囊感染免疫抑制BALB/c小鼠,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊,用酚-氯仿抽提法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下克隆至pET-30a(+)载体,构建pET-30a-23质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定. 结果扩增出约340 bp的微小隐孢子虫CP23基因片段并成功构建pET-30a-23质粒,表达出分子质量单位为27 ku的融合蛋白,Western blot显示该蛋白能被抗微小隐孢子虫血清识别. 结论成功构建pET-30a-23质粒,表达产物具有免疫反应性,为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制打下了基础.
关键词： 微小隐孢子虫 CP23基因 克隆 表达 Western blot -
白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及序列分析
目的从白纹伊蚊基因组DNA中获得乙酰胆碱酯酶(AchE)基因片段及其DNA序列. 方法根据已知的果蝇和斯氏按蚊AchE氨基酸序列保守区域设计一对简并引物,利用简并引物对白纹伊蚊AchE基因片段进行扩增.PCR产物经T/A克隆,α互补筛选法筛选,碱裂解法提取出重组质粒DNA, 并对之进行酶切鉴定和PCR鉴定.对重组质粒的阳性克隆进行DNA测序,利用互联网和PCGENE软件与部分已知物种的AchE氨基酸序列进行同源性分析并构建进化系统树. 结果从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出AchE基因片段,其核酸序列共394 bp,根据内含子特性确定内含子位置后,所得基因的氨基酸序列共107个氨基酸残基,并含有AchE的特征性保守序列FGESAG.同源性分析表明,其与埃及伊蚊相应片段的同源性高(96%),其次为斯氏按蚊(87%),与黑腹果蝇则较低(69%). 结论从白纹伊蚊敏感株中获得了AchE基因片段、DNA序列及其特征.该片段与埃及伊蚊相应片段同源性高.
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恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析
目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.
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人IL-23R胞外区基因的克隆及蛋白表达研究
目的 克隆人IL-23R(hIL-23R)胞外区基因,并对其在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达进行鉴定分析.方法通过PCR获得hIL-23R胞外区基因片段,将其克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(O).重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的 蛋白进行检测分析.结果 获得全长为990 bp的hIL-23R胞外区基因,以构建的重组质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(O)转化E.coli BL21(DE3)后,SDS-PAGE显示表达蛋白分子质量单位约为64 ku,Western blot检测该蛋白能被兔抗GST多克隆抗体识别.结论 成功构建了hIL-23R胞外区基因的原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R(O),并在E.coli中表达出重组蛋白,为进一步研究hIL-23R的功能奠定了实验基础.
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十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因的克隆与表达
目的 克隆十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)基因,并在大肠埃希菌中表达. 方法 用3'RACE及RT-PCR技术扩增获得AdMn-SOD全长cDNA编码序列;设计引物,克隆AdMn-SOD成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化. 结果 成功克隆获得AdMn-SOD全长cDNA序列,推导编码的氨基酸序列具有Mn-SOD的保守结构特征;构建了pET32a/AdMn-SOD原核表达重组质粒,AdMn-SOD在大肠埃希菌中得到高效表达,表达的融合蛋白的分子质量单位约为40 ku. 结论 成功克隆并表达了十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因,为进一步了解十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶的特性与功能奠定了基础.
关键词： 十二指肠钩虫 锰超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)基因 克隆 表达 -
香港海鸥菌HdeA蛋白的原核表达及活性研究
目的 表达香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis)分子伴侣蛋白HdeA并鉴定其保护功能,为解析其抗酸机制奠定基础. 方法 通过与相关蛋白进行同源性比较,在香港海鸥菌中找出编码HdeA的基因.以HdeA基因序列为基础,设计特异性引物,PCR扩增HdeA基因,并将其连接到表达载体pET28a,构建的重组质粒pET28a-HdeA转化大肠埃希菌BL21(DE3),得到重组菌BL/pET28a-HdeA,用IPTG诱导表达目的蛋白并利用镍柱亲和层析纯化HdeA蛋白,采用光散射法分析HdeA蛋白的保护功能. 结果 通过Blast分析,从香港海鸥菌中找到编码HdeA的基因.以合成的特异性引物扩增出约315 bp的HdeA片段,连接到原核表达载体pET28a后转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导成功表达出HdeA蛋白,其分子质量单位为14.1 ku,与理论值相符合.经His tag亲和层析纯化,获得纯度较高的重组HdeA蛋白.光散射法检测分析HdeA蛋白能够减轻酸性条件下ADH蛋白聚集. 结论 纯化的重组HdeA蛋白在体外具有抗酸功能,为研究香港海鸥菌的抗酸机制奠定了基础.
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云南猪株旋毛虫43ku抗原基因的原核表达
目的 构建云南猪株旋毛虫43 ku抗原基因原核表达载体,诱导其表达目的蛋白,为研究其功能奠定基础.方法 收集云南株旋毛虫成虫,提取总RNA,采用RT-PCR获得43 ku抗原基因.将PCR产物插入克隆载体pMD18-T中,重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将目的片段插入原核表达载体pET20b中并转化大肠埃希菌BL21,通过IPTG诱导表达目的蛋白,经镍柱亲和层析纯化后进行SDS-PAGE鉴定. 结果 RT-PCR扩增出云南猪株旋毛虫43ku抗原基因,其基因序列全长1 134 bp,与GenBank中注册的序列同源性高为98.8％.重组表达质粒pET20b-Ts43经双酶切得到1 000 bp和3 700 bp左右两条片段,与预期结果相符.表达产物经SDS-PAGE鉴定,其分子质量单位为43 ku.纯化蛋白经SDS-PAGE分析为单一43 ku蛋白带. 结论 成功构建了云南猪株旋毛虫43 ku抗原基因的原核表达载体,表达并纯化了43 ku蛋白,为其功能研究奠定了基础.
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土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及其序列分析
目的克隆土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶的全长基因.方法根据日本血吸虫和曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶基因的保守区设计引物,利用RT-PcR扩增出土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的大片段,再结合RAcE技术分别得到磷酸丙糖异构酶基因的3′端和5′端,将3部分序列拼接后获得磷酸丙糖异构酶基因全长cDNA序列,并提交GenBank.结果成功克隆了土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因全长cDNA序列并提交GenBank,登录号为DQ092331.结论土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因全长cDNA的克隆为进一步表达及其生物学性能的分析提供了理论基础.
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杜氏利什曼原虫23kDa抗原编码基因克隆的表达
将已建立的杜氏利什曼原虫cDNA文库基因,亚克隆于pUC18质粒载体,诱导表达筛选两个克隆,即P1、P2 , 表达的蛋白分子量皆为23 kDa ,P1克隆表达的23 kDa蛋白分子, 经Western blot分析显示,可被兔抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体抗血清及内脏利什曼病病人血清识别.
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牛乳腺炎金黄葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白基因的克隆及序列分析
目的 克隆牛乳腺炎金黄葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白基因,并进行序列分析. 方法 根据Gen-Bank上公布的金黄葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白(nEBPS)基因的全序列,利用生物学软件Primer5.0和Oligo6.0设计了1对特异性引物,采用PCR方法扩增临床分离株nEBPS基因片段. 结果 扩增的基因片段长度为720bp,与标准菌株(CMCC26074)的nEBPS基因片段序列相似性为100％,与GenBank上公布的金黄葡萄球菌菌株(U48826.2)nEBPS基因相似性为97.36％,核苷酸序列共有19处出现碱基突变. 结论 成功克隆出牛乳腺炎金黄葡萄球菌SEB基因,为建立快速检测牛乳中金黄葡萄球菌的PCR检测方法奠定了基础.
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H9亚型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析
目的 扩增、克隆H9N2 HA基因,并进行序列分析,为H9N2流感病毒种间及跨种传播机制研究奠定基础.方法 设计特异性引物,扩增克隆H9N2亚型禽流感病毒,测序后进行序列分析.结果 成功克隆出4株H9N2亚型禽流感病毒,全长均为1.7 kb,ORF为1 683 bp,编码560个氨基酸;联机检索,与参考毒株比对核苷酸和氨基酸同源性均在90%以上.结论 成功克隆4株H9N2亚型禽流感病毒,序列分析显示其核苷酸和推导氨基酸与参考毒株高度同源.
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十二指肠钩虫ASP-1成熟蛋白基因的克隆、原核表达及纯化
目的 获得十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)分泌蛋白1(mAd-ASP-1)编码基因全长并实现其原核表达. 方法 根据GenBank AAD13339公布的序列,设计并合成引物,RT-PCR扩增mAd-ASP-1的成熟肽全基因序列,测序后克隆至pET-22b(+)载体,转化大肠埃希菌,诱导表达Ad-ASP-1,亲和层析纯化. 结果 RT-PCR扩增获得了mAd-ASP-1基因全长,成功构建了原核表达质粒pET-22b-mAd-ASP-1,转化大肠埃希菌Rosetta-gami 2(DE3)菌株,经IPTG诱导,表达预期47 ku的重组蛋白Ad-ASP-1,且主要以可溶形式存在.利用His Trap HP亲和柱获得了纯化的重组蛋白Ad-ASP-1,确定纯化重组蛋白咪唑洗脱液佳浓度为100 mmol/L.Western blot显示,该融合蛋白可被鼠抗His tag抗体识别. 结论 获得了mAd-ASP-1基因全长,并成功构建其原核表达体系,为获得大量Ad ASP-1基因工程产品奠定了实验基础.
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隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素P30基因的克隆及生物信息学分析
目的 克隆隐孢子虫Gal/GatNAc特异性凝集素P30基因并测序,对其进行生物信息学分析. 方法 采用聚合酶链(PCR)技术,从微小隐孢子虫基因组中扩增P30基因,然后将其克隆入pMD18-T载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并对获得的P30基因进行生物信息学分析. 结果 PCR扩增得到特异的微小隐孢子虫P30基因,测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank上提交的序列同源性分别为98%～100%和99%～100%. 结论 成功克隆出序列正确的微小隐孢子虫P30基因,预测的P30蛋白具有9个潜在的抗原表位,为其相关研究奠定了基础.
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恶性疟原虫FCC1/HN株EBA-175因克隆及序列分析
目的将恶性疟原虫FCC1/HN株175 ku的红细胞结合抗原(EBA-175)基因克隆人测序载体,测定其序列,为以后研究其结构与功能奠定基础.方法利用PCR扩增技术,分两个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中,特异扩增EBA-175全基因编码序列.扩增产物经纯化回收后,T-A克隆入测序载体pMD18-T,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,并进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得含有编码EBA-175基因的重组质粒pMD18-T-EBA.用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定.结果 FCC1/HN株EBA-175基因序列与Camp株基本一致,全长4 308bp,编码1 435个氨基酸,含有与Camp株相似的C片段.利用计算机软件对其RII区的F2亚区以及4肽进行抗原表位分析,结果显示这些区域可能含有抗原表位.结论 EBA-175全基因编码序列的测定,为以后其结构与功能的研究奠定基础.
