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3株弓形虫GRA7基因的保守性鉴定
目的比较弓形虫不同地理株(RH株、ZS2株、GT株)GRA7基因的异同. 方法从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因,对目的基因用限制性内切酶(Esp3I、CfrI、MboI)酶切并比较.将目的基因克隆至pGEX-4T-1质粒,转化大肠埃希菌JM109,进行测序并比较. 结果 PCR扩增出3株弓形虫的目的基因片段,大小均在500～750 bp之间;经3种限制性内切酶酶切,其大小均与理论值相符;3株弓形虫GRA7基因序列相同. 结论弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性.
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日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达
目的从日本血吸虫(S. japonicum)尾蚴文库扩增S. japonicum再感染相关蛋白(RIRP)基因,进行克隆并原核表达出RIRP,为进一步的功能研究奠定基础. 方法根据已登陆的S. japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物,以S. japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA, 将该基因的cDNA克隆入原核表达载体pGEX-4T-1 和真核载体 pcDNA3.1.转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和后的测序鉴定. 重组的pGEX-4T-1/RIRP 在大肠埃希菌 BL21(DE3)中进行表达.SDS-PAGE 鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量.用抗-26 ku GST 单抗作western 杂交进一步鉴定融合蛋白的表达. 结果从S. japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为462 bp 的cDNA片段,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA.它编码含153 个氨基酸的蛋白质-RIRP,预测其分子质量单位为17.545 ku. RIRP cDNA已被成功克隆入 pGEX-4T-1和pcDNA3.1载体, 大肠埃希菌 BL21(DE3) 编码一个约17 ku的蛋白质. 结论 RIRP基因首次从S. japonicum尾蚴文库中扩增出来,并成功构建了原核和真核表达载体,而且,它首次由大肠埃希菌表达,表达蛋白的分子质量单位约17 ku.
关键词： 血吸虫 日本 再感染相关蛋白(RIRP) 克隆 表达 -
日本血吸虫CuZn-SOD基因全长cDNA的识别及真核表达载体的构建
目的识别日本血吸虫大陆株铜锌超氧化物歧化酶(Sj CuZn-SOD)基因,构建Sj CuZn-SOD的真核表达载体.方法将曼氏血吸虫(Sm)的CuZn-SOD全长cDNA序列上网比对, 寻找Sj 相关EST.设计特异性引物从尾蚴cDNA文库扩增相应序列,经双酶切、连接、转化,克隆入pcDNA3.0真核表达质粒,并鉴定阳性克隆. 结果找到Sj 相关EST(登录号BU794891),核酸阅读框(ORF)分析和BLAST比对分析等方法判断为Sj CuZn-SOD完整的cDNA编码序列,含462 bp完整阅读框,编码154aa.经单双酶切、PCR扩增、核酸测序鉴定,验证成功构建了pcDNA3.0-SOD真核重组表达载体. 结论成功构建真核重组表达载体pcDNA3.0-SOD,为在真核表达系统研究Sj CuZn-SOD基因功能奠定了基础.
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刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析
目的克隆刚地弓形虫RH株致密颗粒抗原(Dense granule antigen, GRA6)分子基因,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础. 方法根据己知的GRA6序列合成一对引物,抽提弓形虫速殖子mRNA,以速殖子mRNA为模板,通过反转录PCR(RT-PCR)扩增出GRA6的cDNA条带.目的基因DNA条带被克隆到质粒pUC19中形成重组质粒.对重组质粒DNA进行纯化,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析. 结果通过RT-PCR从mRNA中扩增出一条分子量约700 bp的DNA条带.核苷酸序列分析表明,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为693 bp,编码230个氨基酸分子,与已报道的RH株GRA6分子具有100%的同源性. 结论本研究获得了刚地弓形虫RH株的GRA6分子基因,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础.
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犬贾第虫端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析
目的 对犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因进行克隆及序列分析. 方法 根据人源贾第虫的端粒酶催化亚基TERT基因(AF195121)设计1对引物,以犬贾第虫滋养体总核酸为模板,扩增犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因,PCR产物连接到PGEM-T载体并转化入DH5α感受态菌进行测序,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索,并用分子生物学软件进行分析. 结果 测得犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因全长2 883 bp,该基因序列与人源贾第虫的端粒酶催化亚基基因同源性为99%,氨基酸的同源性也为99%. 结论 成功扩增了犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因,为进一步研究该基因的功能及筛选抗犬贾第虫药物靶标奠定了基础.
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华支睾吸虫钙调理蛋白的克隆表达、组织定位及功能的初步研究
目的 克隆和原核表达华支睾吸虫钙调理蛋白(CsCALP),并初步研究其功能及免疫学意义.方法 利用生物信息学相关软件分析CsCALP蛋白的基本理化特征和三维结构；将CsCALP基因克隆到原核表达质粒pET 28a(+)中,诱导表达CsCALP蛋白并用镍离子亲和层析柱进行纯化；通过凝胶覆盖(Gel overlay)试验鉴定纯化的CsCALP蛋白与F Actin的结合能力；使用纯化的CsCALP蛋白免疫SD大鼠,获得抗血清,通过Western blot分析其免疫学特性；应用免疫荧光化学法观察华支睾吸虫CsCALP蛋白在成虫的定位.结果 CsCALP基因编码序列长度为1086bp,编码361个氨基酸,理论分子质量单位为39.770 8 ku,具有1个calponin homology结构域和5个calponin-like repeat结构域；该基因在大肠埃希菌BL21/DE3中可被表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别；CsCALP蛋白主要定位于虫体富含肌肉组织,包括口、腹吸盘、咽部以及皮下肌层；Gel-overlay试验显示CsCALP蛋白能与F-Actin结合.结论 构建的pET 28a(+) CsCALP能在大肠埃希菌中表达可溶性CsCALP蛋白.该蛋白具有良好的抗原活性,主要分布在华支睾吸虫成虫肌肉组织中,可能为分泌排泄抗原的组分之一.
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微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析
目的 获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因(CPRho和CARho)部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性.方法 应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析.结果 经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723 bp.经DNA MAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99.6%,氨基酸同源性为99.2%.二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99.9%和99.7%,而氨基酸同源性均为99.6%.结论 获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础.
关键词： 微小隐孢子虫 安氏隐孢子虫 Rhomboid基因 克隆 -
肺炎衣原体Cpn0147基因的克隆、表达与定位及其重组蛋白的生物信息学分析
目的 重组表达肺炎衣原体Cpn0147基因,并对表达的内源性蛋白进行细胞内定位,对重组蛋白进行生物信息学分析. 方法 使用PCR方法从肺炎衣原体菌株AR39基因组中扩增第0147段开放读码区基因,使用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切目的片段和载体PGEX-6P2,T4连接酶连接后转化入大肠埃希菌感受态XL-Blue,并诱导表达融合蛋白GST-Cpn0147.用融合蛋白免疫小鼠,制备抗体,应用IFA方法对衣原体感染细胞内Cpn0147基因表达的内源性蛋白进行定位.利用软件Expasy对重组蛋白进行生物信息学分析. 结果 克隆出肺炎衣原体基因Cpn0147,全长450 bp,编码蛋白分子质量单位为14.727 ku,表达的融合蛋白GST-Cpn0147分子质量单位约为43 ku;用制备的抗体做IFA,显示现该蛋白定位于肺炎衣原体包涵体膜上.生物信息学分析该蛋白含2个抗原决定簇,具有良好的抗原性和亲水性. 结论 肺炎衣原体Cpn0147基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白,抗原性和亲水性较好.
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白纹伊蚊AL-100 30 ku蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建
目的 克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku蛋白基因,并构建其原核表达载体. 方法 RT-PCR克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku的全长基因,设计简并引物,扩增白蚊伊蚊30 ku的完整开放阅读框,与Pet-28a载体连接,构建原核表达载体. 结果 成功克隆白纹伊蚊主要过敏原30 ku基因并构建其原核表达载体.该基因含有长度为816 bp的开放阅读框,编码271个氨基酸.该蛋白质的分子质量单位为28.33 ku,等电点为4.04,编码序列与数据库中已知的白纹伊蚊30 ku基因的同源性为99%. 结论 成功克隆了白蚊伊蚊主要过敏原30 ku基因并构建了原核表达载体,为白纹伊蚊主要过敏原30 ku蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础.
关键词： 白纹伊蚊 过敏原 AL-100 30 ku 克隆 原核表达载体 -
刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析
目的 对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18 (TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列. 方法 提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR (RT-PCR)扩增ROP18基因,并对其产物进行测序;采用在线生物软件预测TgROP18蛋白的结构与功能. 结果 TgROP18基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为1 665 bp;测序分析显示,ROP18基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致.TgROP18蛋白含有554个氨基酸,分子式为C2753H4405N801O811S20,分子质量单位为62.34 ku,理论等电点为9.34;在TgROP18蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为41.52％、19.13％、7.76％和31.59％;TgROP18蛋白含有10个亲水性较高的区域(临界值为2.0),28个表面可及性较高的区域(临界值为1.9),10个保守结构区域,7个翻译后修饰位点,21个B细胞抗原表位,21个CTL抗原表位及26个Th抗原表位有. 结论 生物信息学分析表明,TgROP18蛋白具有良好的免疫原性,这将为弓形虫疫苗的研究提供基础资料.
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奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a骨架蛋白BP基因的克隆及其抗原性预测
目的 克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿BP基因片段并进行序列分析. 方法 根据GenBank已公布牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因序列,采用Primer 5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区分离的乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板PCR扩增BP基因片段,并进行生物信息学分析. 结果 克隆的BP基因序列大小为609bp,编码203个氨基酸残基,其基因序列与GenBank上公布的牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因(EU930008)相似性为100％.菌毛岛屿骨架蛋白BP二级结构的a螺旋在N端分布较多;β折叠较丰富,且分布于C端较多;无规则卷曲分布较均匀.菌毛岛屿骨架蛋白BP的亲水区分布较广,遍布于整个多肽区,属于亲水性蛋白.BP蛋白分子表面可及性较高,区域占比达57.0％,且抗原性较好. 结论 奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛骨架蛋白BP基因具有高度保守性,其编码蛋白具有良好的抗原性,可作为防治无乳链球菌性乳腺炎的候选抗原序列.
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弓形虫表面抗原P22蛋白的研究进展
弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性寄生于人和多种动物组织有核细胞内的原虫,呈世界性分布.近年来关于弓形虫细胞表面抗原作为诊断试剂及免疫疫苗的双重潜在价值得到广泛研究,主要发现有5种表面抗原:P22、P23、P30、P35、P43.其中P22基因依据克隆的顺序也被称为SAG2.本文就弓形虫重要抗原P22的基因和蛋白结构,及该抗原在弓形虫虫株的分型、血清诊断、疫苗方面的研究作简要介绍.
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屋尘螨变应原Der p 1基因的克隆和原核表达
目的 克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达.方法 分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+),将表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定.结果 成功构建了表达质粒pET-28a(+)-Derf 1,Western blotting显示原核表达获得成功.序列分析表明所获得的Der p 1编码基因与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸222个.屋尘螨和粉尘螨1类变应原氨基酸序列相似率为60%,而粉尘螨与梅氏嗜霉螨1类变应原相似率为85%,分子进化分析亦提示粉尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近.推测所获rDer p 1二级结构中,α螺旋占33.78%,延伸链占21.62%,随机线圈占44.59%.结论 尘螨变应原Der p 1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础.序列分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合.
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鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及其保护力
目的:对鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及其保护力进行研究. 方法:PCR、化学转化及电穿孔法.结果: 采用PCR方法,特异地扩增了鼠疫菌F1抗原caf 操纵子的5Kb基因片段.将PCR产物与质粒载体连接后,经化学方法转化大肠杆菌LE392, 获得 caf基因克隆子,所得克隆子能较好地表达F1抗原基因.应用电穿孔法将克隆子的重组质粒转入鼠伤寒沙门氏菌G30内获得转化子,其F1抗原表达水平与在大肠杆菌LE392中的表达水平相同,反向血凝滴度可达1∶80以上,与EV株相近.用该株免疫小鼠,20d后用141株攻击,可延长平均死亡时间.结论:caf基因的克隆子在鼠伤寒沙门氏菌G30中能够有效表达,且对小鼠显示出保护效果.该研究为构建新型鼠疫菌苗提供了线索.
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伯氏疏螺旋体PD91外膜蛋白C克隆表达及序列分析
目的构建伯氏疏螺旋体PD91菌株外膜蛋白C(OspC)的表达载体,克隆表达OspC,用于莱姆病的预防、诊断和致病机理上的研究.方法用PCR扩增PD91 ospC基因,定向克隆到表达载体PET-11D,构建重组质粒.采用酶切分析及序列测定等方法鉴定重组质粒的正确性.结果 ospC基因被正确克隆到表达载体PET-11D中.序列测定结果证实与已报道的ospC基因序列同源性介于62%～86%之间.结论我国PD91菌株的ospC编码基因与已报道菌株的ospC菌株在同源性上存在较大的差异.PET-11D-ospC重组质粒的成功构建为我国莱姆病的进一步研究奠定了基础.
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苏云金芽孢杆菌杀蚊蛋白基因cry11Aa的克隆与表达
目的 克隆苏云金芽孢杆菌以色列亚种的杀蚊毒素蛋白基因cry11Aa,并使其在酵母双杂交系统受体菌Saccharomyces cerevisiae L40中获得表达.方法 应用聚合酶链反应扩增获得cry11Aa基因,构建表达载体pHybLex/Zeo-cry11Aa,转化到酵母菌Saccharomyces cerevisiae L40.结果 用Cry11Aa抗体和LexA抗体进行的Western blot免疫杂交表明cry11Aa基因在酵母菌L40中成功表达,生成了Cry11Aa-LexA融合蛋白.结论 成功地克隆、表达了cry11Aa基因,为进一步利用酵母双杂交系统寻找与毒素蛋白Cry11Aa特异性结合的蚊幼中肠受体蛋白,揭示苏云金芽孢杆菌毒杀蚊虫的分子生物学机制奠定了基础.
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尘螨变应原Der p 2基因克隆及原核表达
目的 原核表达尘螨主要变应原Der p 2.方法 分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 2核酸序列设计引物用RT-PCR扩增Der p 2编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a(+),将表达质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定.结果 成功构建了表达质粒pET28a(+)-Der p 2,SDS-PAGE和Western blotting显示原核表达获得成功.序列分析表明所获得的Der p 2编码基因与参考序列同源性达99.54%,推测其编码氨基酸130个,相对分子质量约为14 348.5.结论 尘螨变应原Der p 2原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础.
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家蝇抗菌肽及其基因的克隆进展
家蝇抗菌肽是一类由结构基因编码的小分子肽类物质,是构成其自身防御体系的重要组分,具有广谱的抗菌、抗病毒、抑肿瘤细胞等生物活性,已引起人们的广泛关注.文中主要介绍家蝇抗菌肽的产生、结构特点、生物学功能及其基因的克隆进展.
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TFPI-2/KD1的克隆表达及其生物学性质研究
目的 克隆表达人组织因子途径抑制物-2(hTFPI-2)Kunitz结构域1(KD1)基因.方法 提取健康女性正常分娩胎盘中总RNA,采用RT-PCR法合成hTFPI-2全长cDNA后行PCR扩增,以扩增得到的hTFPI-2/KD1基因片段与原核表达载体pET22b进行连接并转化E.coli DH5α,获得重组质粒pET22bhTFPI-2/KD1.将重组质粒pET22b-hTFPI-2/KD1转化至E.coli BL21,获得重组菌株E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1].以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,并利用Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化,采用发色底物法和明胶酶谱法分别检测hTFPI-2/KD1抑制胰蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMP)的活性.结果 核酸序列测定显示克隆的hTFPI-2/KD1基因序列与理论序列相符.SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1]诱导表达产物相对分子质量与预期相符,经纯化后获得了完整的hTFPI-2/KD1蛋白,发色底物法和明胶酶谱法检测显示其具有抑制胰蛋白酶、MMP-2和MMP-9的活性.结论 通过原核表达系统成功获得高效表达并具有生物活性的hTFPI-2/KD1,为进一步研究其功能奠定了基础.
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乙醇脱氢酶的克隆表达及酶活优化
目的 构建表达重组粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶的工程菌,并对乙醇脱氢酶酶活测定条件进行优化,为氧化还原酶酶法催化在手性药物中间体合成中的应用提供指导.方法 采用 PCR技术,以粗糙脉孢菌基因组 DNA为模板,克隆得到粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶基因,连接到表达载体 pET-28a上,得到重组质粒 pET-ADH.将该重组质粒导入大肠杆菌 BL21中,并经培养、筛选、酶切、测序鉴定.用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并测酶活力,同时对影响酶活的条件进行研究.结果 粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶活力较高,适反应介质为 Tris-HCl缓冲液,在 30 ~ 35℃、pH 7 ~ 8时酶活力较稳定,较适底物为 2-氯苯乙酮.结论 通过采用 PCR技术,成功克隆表达粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶,并优化得到优酶活条件.
