日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆及真核表达载体的构建

血吸虫卵壳蛋白基因是探讨血吸虫病免疫预防的重要靶标.本研究根据已发表的多个血吸虫卵壳蛋白基因的核苷酸序列,设计合成了特异引物,体外扩增和克隆了编码日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因SjESG的cDNA,测序结果表明与已发表的卵壳蛋白基因序列有较高同源性.为进一步研究该基因的功能,将其克隆入pcDNA3中,成功构建了真核表达载体,为SjESG DNA疫苗的研究打下了基础.

弓形虫RH株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定

为构建弓形虫速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库,用CF-11纤维素柱快速提纯速殖子,以盐酸异硫氰酸胍(AGPC)一步法抽提总RNA,oligo-dT纤维素分离mRNA后,用ClonTech公司的SmartTMPCRcDNA文库构建试剂盒,构建了弓形虫RH株的表达型文库.获得5×106个独立克隆,重组率为90%,插入片段的平均长度约为1kb.根据已知序列设计引物,从cDNA文库中扩增出编码棒状体蛋白l(ROPl)的基因(不含编码信号肽的序列),本文库可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选.

恶性疟原虫海南株翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因在M15中的表达

获得翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因后与表达载体pQE-30重组,然后转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导后表达TCTP融合蛋白,薄层扫描结果显示目的蛋白占菌体总蛋白的23.4%,目的蛋白中可溶性蛋白所占比例高于非溶性蛋白.Ni-NTA纯化后C端测序,结果C端13个氨基酸序列与由GenBank国际基因库中恶性疟原虫TCTP基因推导出的C端13个氨基酸序列及组成完全一致.结果表明成功地在M15中表达了恶性疟原虫海南株TCTP基因,为进一步研究提供了实验材料.

日本血吸虫毛蚴相关蛋白基因SjMP13的克隆表达及免疫学鉴定

利用日本血吸虫感染者唾液免疫筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库,对获得的阳性克隆进行序列分析,其中一阳性克隆插入片段包含一个351 bp的开放读码框,其编码116个氨基酸,预测分子量为12.9 kDa,将其命名为SjMP13,该蛋白与血吸虫尾蚴相关蛋白(GenBank序列号:AF448823.1)同源性高达96%.将该序列克隆入原核表达质粒pET32a(+)并转化宿主菌B121/DE3,经IPTG诱导表达后,其重组表达产物经亲和层析纯化,再用Western-blot进行免疫学分析,该序列的原核表达产物能被日本血吸虫感染者唾液以及血清识别,提示该分子具有诊断抗原的开发价值.

华支睾吸虫卵黄前体蛋白B基因的识别、序列分析和克隆表达

为识别和克隆华支睾吸虫新基因,对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,并利用在线生物信息学工具进行序列分析,识别华支睾吸虫未知基因,同时根据PGEX-4T-1多克隆位点及未知基因的序列设计引物,PCR扩增目的基因,并构建原核重组质粒.结果发现了Cs vpB基因,其完整阅读框含762个碱基,编码254个氨基酸,理论分子量为27.7kDa.序列分析表明,Cs vpB蛋白与其它物种的卵黄前体蛋白有较高的同源性,所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-vpB经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符.

白纹伊蚊和埃及伊蚊防御素(defensin)成熟肽基因克隆及结构推测

应用PCR技术从白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组中扩增出defensin成熟肽基因并对其分子生物学特性进行分析,发现埃及伊蚊(Bora Bora株、海口株)、白纹伊蚊( 成都株、宜兴株、广州株)推导的氨基酸序列与埃及伊蚊defensin A相同;通过Chou Fasma n预测法对defensin A成熟肽的二级结构进行预测,可以看出在defensin成熟肽氨基酸序列的15～23位有一个α螺旋,35～39位有一个β折叠,32～34位有一个转角;通过同源性比较推测蚊虫defnsin A的三级结构.

牛东方泰勒虫P32主要表面蛋白基因的克隆与分析

通过PCR技术从感染吉林株东方泰勒虫的病牛血液中扩增出868 bp的表面蛋白P32基因,经测序比较分析发现与韩国株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和98%.和我国延边株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和98%.将所得的吉林株东方泰勒虫P32蛋白基因序列提交GenBank,基因注册号为EU047751.

镰形扇头蜱IgG结合蛋白基因的克隆与表达分析

本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出一个IgG(IgG binding protein,IGBP)基因的全长序列,该基因全长683bp,编码178个氨基酸,预测分子量为19.5 kDa,经同源性比较该基因与具尾扇头蜱的IGBP-MB基因序列的同源性高达92%.用RT-PCR方法分析了该基因表达的性别特异性、各个器官、不同发育阶段的表达情况,结果表明,该基因表达没有性别特异性;IGBP基因在唾液腺、壳这2个器官有所表达,但在肠中却没有表达;在蜱的各个发育阶段均有表达.

大劣按蚊血淋巴中疟原虫感染相关蛋白的cDNA克隆

疟疾是一种严重的传染病,大劣按蚊是我国及东南亚地区的重要传疟媒介.对大劣按蚊抗疟原虫感染分子机制的研究,具有重要意义.我们先前已成功分离了大劣按蚊血淋巴中约氏疟原虫感染相关蛋白(PIRP1),并对该蛋白进行了质谱检测.本研究在已获得PIRP1质谱检测信息的基础上,利用分子生物学技术,成功克隆了该相关蛋白的部分cDNA序列(CenBank序列号为EF409973).为下一步对该蛋白的功能研究奠定了基础.

美洲大蠊变应原Cr-PⅡ基因的克隆、表达及结构预测

采用RT-PCR技术从美洲大蠊中扩增出变应原Cr-pⅡ基因,并将其克隆至pMD18-T载体中.经序列测定和分析证实,所克隆的片段含有长度为1 185 bp的完整开放阅读框(ORF),与台湾株来源的Cr-pⅡ(Per a1.0103)有95.9%的同源性.用Nde Ⅰ和Not Ⅰ将目的片段从T载体中切下,定向亚克隆入表达载体pET24a(+),然后成功转化大肠杆菌菌株BL21 Star.经IPTG诱导得到45kDa的重组蛋白,Western-blot分析表明其具有良好的IgE结合活性.并通过生物信息学方法获得了目的蛋白的抗原表位和3D结构模型.

德国小蠊Allatostatin cDNA的克隆及序列分析

用3'-Rrace和5'-Race技术获得了德国小蠊咽侧体抑制肽Allatostatin(AST)的cDNA全长,共有1 560bp,包括1 125bp的开放阅读框.起始密码子ATG位于第125位,终止密码子TAA位于1 249位,其后为310bp的非编码序列;开放阅读框共编码375个氨基酸,这些氨基酸在水解蛋白酶的作用下可转录翻译出13个AST的前体蛋白,它们分别由6～18个氨基酸组成,在C末端均具有相同的Y/F-X-F-G-L氨基酸特征序列.

鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达

分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT_PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)江苏分离株5401基因.测序结果表明该序列全长为864 bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T.第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V.其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%.将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达.用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90 kDa和80 kDa左右.

恶性疟原虫GLURP基因的体外扩增,克隆及序列分析

通过体外扩增,克隆恶性疟原虫海南(FCCl/HN)株GLURP基因,测定其基因序列,了解该基因的结构及在FCCl/HN株与其它分离株间的序列差异.根据GLURP基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCCl/HN株基因组DNA中扩增3个部分序列重叠的GLURP基因片段;并分别克隆入测序用PMD-18T载体.用双脱氧链末端终止法测定GLURP基因序列,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较.恶性疟原虫FCCl/HN株GLURP基因全长3711bp,编码l 236个氨基酸.FCCl/HN株与F32株GLURP基因核苷酸序列同源性为96.27%;编码氨基酸序列同源性为95.78%.本文为继续进行FCCl/HN株GLURP抗原的免疫原性和保护性研究奠定基础.

淡色库蚊乙酰胆碱酯酶全基因的克隆鉴定及蛋白同源模拟

根据已知的尖音库蚊乙酰胆碱酯酶(AChE1)的全基因序列在非编码区设计一对特异性引物,对淡色库蚊的cDNA进行扩增.PCR产物经T/A克隆,PCR鉴定和DNA测序,利用DNAStar软件与部分已知物种的AChE1氨基酸序列进行同源性分析并构建系统进化树.淡色库蚊Ace1基因的ORF序列为2 103bp,翻译成蛋白序列为700个氨基酸.蛋白序列与尖音库蚊的AChE1相比只有12个氨基酸的差异,缺失了一段8个残基的序列.同源性分析表明,除尖音库蚊外,其与冈比亚按蚊的同源性高(79.5%),与黑腹果蝇AChE2相比则比较低(31.1%).应用SWISS-MODEL软件对该蛋白进行了同源模拟.

基因克隆的常用方法介绍

为能快速、准确地克隆出有意义的基因,本文介绍了目前常用的一些基因克隆方法,如差异显示PCR、抑制性差减杂交、RAP-PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cDNA直接捕捉法等;并对这些方法作了简要的评价,以利于大家选择适合自己的方法.

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.

SD大鼠βB2-晶体蛋白的克隆、表达与纯化

目的得到大量纯的βB2-晶体蛋白,为研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.方法从SD大鼠晶状体中抽提总RNA,用RT-PCR法克隆βB2-晶体蛋白的cDNA,装入原核表达载体pGEX-4T-1后用萘啶酮酸(IPTG)诱导表达;用GST纯化系统纯化并用蛋白水解酶对融合蛋白进行酶切.结果βB2-pGEX重组质粒经测序及限制性内切酶分析等鉴定,与预期结果一致;IPTG诱导后,蛋白质在大肠杆菌BL21中得到高效表达.纯化酶切后,经Westen blot 方法验证,得到了高纯度的βB2-晶体蛋白.结论成功构建了βB2-pGEX原核表达载体,高效表达了βB2-GST融合蛋白,经纯化和酶切得到了高纯度的βB2-晶体蛋白,为进一步研究其生物学特性及潜在的生理功能打下基础.

广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2的基因克隆与序列分析

目的研究广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2(APLA2)的基因克隆与序列分析.方法从广西眼镜王蛇毒腺中提取总RNA,根据种属关系接近的台湾眼镜蛇毒APLA2两端非翻译区的保守序列设计引物,利用RT-PCR进行体外扩增,获得磷脂酶A2基因,克隆至pMD18-T载体,经测序筛选出APLA2-1,APLA2-2及一个新的酸性磷脂酶A2(命名为APLA2-3).根据测序结果确定了APLA2-3基因的全序列,并由此推导编码的氨基酸序列. 结果利用Antheprot 4.3c蛋白质序列分析软件包计算它的等电点为4.885,相对分子质量为16.543kD,并预测了它的二级结构和部分理化性质.同源性比较表明,APLA2-3的1～39位氨基酸残基序列与APLA2-2相同,其同源性为64%,而40～108位氨基酸残基序列与APLA2-1相同,其同源性为69%,109位氨基酸残基序列皆不同于这两种APLA2.结论 揭示了APLA2具有基因多样性,可能与物种进化和生物活性有关,并为进一步研究PLA2的结构与功能的关系提供更多的信息.

杆状病毒splt MNPV S1136基因的克隆,表达及其产物功能

CD133+结直肠癌SW480细胞系克隆亚系的建立

目的 建立CD133+结直肠癌SW480细胞系克隆亚系.方法 通过有限稀释法进行单细胞克隆培养,从结直肠癌SW480细胞系48个单细胞孔中培养出8个单细胞源性细胞亚系(编号Y1～8).对所建立的细胞亚系进行RT-PCR、流式细胞分析及免疫细胞化学筛选CD133+的细胞亚系(Y6、Y2);并通过MTT法体外增殖实验、划痕实验、体外运动实验和皮下成瘤实验,比较CD133+之间及与CD133-单细胞源性细胞亚系的生物学特性.结果 筛选出CD133+单细胞源性细胞亚系2个(Y2、Y6),CD133-单细胞源性克隆6个(Y1、Y3、Y4、Y5、Y7、Y8).结论 通过单细胞克隆培养建立CD133+结直肠癌SW480细胞亚系,为下一步结直肠癌转移机制研究提供相关的单细胞源性细胞亚系.