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辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立
目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBR GREEN I荧光PCR检测方法.方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物.病毒在BHK-21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录.以病毒cDNA为模板分别进行SYBR GREEN I荧光PCR和常规RT-PCR扩增,并对SYBRGREEN I PCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析.结果适退火温度为55℃,适引物浓度为O.5 μmol/L.用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性.根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBR GREEN I荧光PCR方法进行检测.结果SYBR GREEN I荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1 PFU/ml.对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响.对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性.结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREEN I荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段.
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含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的辛德毕斯病毒的制备与鉴定
目的 制备含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的辛德毕斯病毒,并对其进行鉴定.方法 采用融合PCR技术将报告基因EGFP融合到辛德毕斯病毒XJ-160感染性克隆pBR-XJ160的结构基因编码框后,并在报告基因前面添加亚基因启动子SP6,通过反向遗传学技术拯救得到EGFP标记的辛德毕斯病毒.结果 成功拯救并获得了EGFP标记的XJ-160病毒,该重组病毒具有良好的荧光表达特性和遗传稳定性.结论 EGFP标记的辛德毕斯病毒可用于观测病毒的侵染轨迹,为进一步研究辛德毕斯病毒嗜性、生物学功能,以及感染机制奠定了基础.
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基于辛德毕斯病毒载体的重组丙肝病毒颗粒的制备与鉴定
目的 利用自主研发的辛德毕斯病毒载体构建含有丙型肝炎病毒( HCV)结构蛋白E1E2的重组病毒颗粒.方法 将编码HCV包膜糖蛋白的E1 E2基因克隆至辛德毕斯病毒载体,构建重组质粒pBR-XJE1E2和pVA-XJE1E2,转染BHK-21细胞后获得重组丙肝病毒颗粒.并通过RTPCR、间接免疫荧光和Western Blot方法鉴定表达E1E2蛋白的重组病毒颗粒.结果 酶切、PCR和测序分析表明重组质粒构建成功.RT-PCR、间接免疫荧光和Western-Blot鉴定结果表明重组质粒转染细胞后能包装出表达E1E2的丙肝病毒颗粒.结论 以辛德毕斯病毒载体为基础构建的重组质粒可在真核细胞中包装出重组丙肝病毒颗粒,这为进一步研究其在动物体内免疫反应奠定了基础.
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核黄素光化学法灭活Sindbis病毒的研究
目的 探究核黄素光化学反应对Sindbis病毒的灭活效果.方法 将10 mmol/L的核黄素0.050 mL加入到4.95 mL的Sindbis病毒(XJ-160株)悬液中,经440 nm波段的可见光(40 J/cm2)双侧照射后,接种至幼仓鼠肾细胞(BHK-21)中培养,观察细胞病变情况(CPE),检测病毒滴庋,用PCR检测病毒核酸的变化,并在透射电镜下观察病毒形态.结果 经终浓度为100 μmol/L核黄素结合440 nm可见光作用,可将滴度为6.5 log TCID50 Sindbis病毒灭活至≤0.5 logTCID50;PCR法未能扩增出病毒核酸片段;透射电镜显示病毒颗粒塌陷.结论 核黄素光化学法能有效灭活Sindbis病毒,其主要作用靶点为核酸.
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辛德比斯病毒和伪狂犬病毒制备方法的优化
目的 优化辛德比斯病毒(Sindbis virus)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的培养和制备方法,建立高效价病毒制备方法.方法 从选用不同宿主细胞、不同的宿主细胞培养方式、以及不同的病毒悬液收集方式3方面考察病毒效价.病毒效价测定采用细胞病变法,按Karber氏法计算病毒效价.结果 用非洲绿猴肾(Vero)细胞培养的Sindbis病毒效价(8.63±0.45)明显高于用幼仓鼠肾(BHK)细胞培养的病毒效价(7.63±0.30)(P＜0.05);用Vero细胞培养的PRV效价(8.13±0.59)也明显高于用BHK细胞培养的病毒效价(6.94±0.71)(P＜0.05);宿主细胞长满单层后继续换液培养或再传代培养2种提高病毒效价的方式所制备的病毒效价(7.69±0.98 vs 7.54±0.69)的差异无统计学意义(P＞0.05),可任选其一;收获病毒时,直接收集培养悬液离心组(直收-冻组)病毒效价(8.66±0.83)较先冻融2次再离心组(冻-收-冻组)病毒效价(8.14±0.91)高(P＜0.05).结论建立了制备高效价Sindbis 病毒和PRV的方法;制备Sindbis病毒和PRV宜选用Vero 细胞;病毒培养悬液直接离心分装即可,既简化操作又可获高效价病毒.
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丙型肝炎病毒样颗粒作为亚甲蓝光化学法灭活HCV效果评价物的可行性研究
目的 探讨丙型肝炎病毒样颗粒(HCVLPs)在亚甲蓝光化学灭活处理过程中的变化趋势及其作为亚甲蓝光化学法灭活HCV效果评价物的可行性.方法 以HCV阳性血浆作为平行对照组(HCV RNA载量约6.53 logcopies/mL)(n=6),将HCVLPs用代血浆调整成合适浓度(HCV RNA定量约为6.74 logcopies/mL)的悬液作为实验组(n=5),将2组分装至PVC血袋中,MB+L 1μmol/L进行病毒灭活处理,分别于光照处理0、5、10、20、30 min时取样,用荧光定量PCR技术检测病毒核酸载量;同时以细胞病变法测定HCV模型病毒sindbis病毒的残余滴度,验证MB+L灭活HCV的效果.结果 模型病毒sindbis的病毒滴度降至检测限以下(logTCID50/mL≤0.5);MB +L处理过程中,随着光照处理时间的增加,HCV及HCVLPs的核酸载量明显下降,分别从6.53与6.74下降至4.51和2.89log copies/mL(P＜0.05),且2组在不同取样点的HCV RNA载量之间具有相关性(R2 ＞0.98,Significance F＜0.01).结论 HCVLPs能够反映MB+L灭活处理中HCV RNA动态变化,或有望成为安全而有效的HCV灭活评价物来监控HCV灭活效果.
