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消毒效果评价中指示病毒的应用
1选择指示病毒的意义本文所指的指示病毒足指在消毒和灭菌实验中,替代有传染性危险、培养很困难,用于评价消毒和灭菌效果的病毒.
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病毒灭活效果验证相关指示病毒研究进展
在消毒和防护效果评价实验研究中,常需验证和指示某消毒处理措施对微生物的效果. 此过程需要一种既对人安全无害,又能代表微生物对常用消毒处理的抗力,并且易于实验操作和观察的指标性微生物. 目前消毒与灭菌效果评价体系所使用的指标微生物主要包括:细菌(主要为细菌繁殖体)、芽胞、分枝杆菌、真菌类、病毒类等几大类. 其中病毒相关试验要求较高,往往需要以细胞或细菌作为其宿主. 试验用病毒的培养与检测工作比较复杂,因而探寻新型病毒替代指标微生物具有重要的意义.
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钴60-γ射线辐照对动物源性膜材指示病毒灭活效果的验证
目的 验证钴60-γ射线辐照对动物源性膜材中模拟感染指示病毒的灭活效果.方法 将3个连续批次的动物源性膜材中间品,按1∶10(m/V)加入预先测定滴度的CVB3、PRV、BVDV和PPV病毒.设立未经辐照的病毒为对照组,试验组经25 kGy钴60-γ射线辐照后,提取浸提液,采用96孔板细胞病变(CPE)法观察各梯度稀释液的细胞病变情况,按照Reed-Muench法计算对照组和试验组中4种指示病毒的lgTCID50/0.1 ml,并对比辐照前后病毒滴度的变化情况.结果 经25 kGy钴60-γ射线辐照预先感染病毒的动物源性膜材后,实验结果显示4种指示病毒均不能使宿主细胞出现病变,各病毒滴度对数值变化均＞4 logs,符合国家相关法规对动物源性材料病毒灭活效果的要求.结论 25 kGy钴60-γ射线辐照可以作为灭活动物源性膜材中潜在病毒的有效方法.
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干热法对猪凝血酶的病毒灭活效果及其对凝血酶活性影响的评价
目的 探讨干热法对猪凝血酶冻干制剂的病毒灭活效果及灭活后对凝血酶活性造成的影响.方法 向猪凝血酶冻干制剂500 U、2000U中加入辛德毕斯病毒(Sindbis)、猪细小病毒(PPV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和伪狂犬病病毒(PRV)4种病毒,各病毒滴度依次为6.83、6.57、6.34、6.96 Logl0/0.1 mL,在98 ～ 100℃沸水中经30min干热病毒灭活后检测病毒灭活效果和对凝血酶活性影响.结果 经干热法病毒灭活后,猪凝血酶冻干制剂中Sindbis、PPV、EMCV和PRV的病毒滴度分别由6.83、6.57、6.34、和6.96 Logl0/0.1 mL降至1.21、1.43、0.96和1.38Logl0/0.1 mL,经干热法处理后500 U的凝血酶冻干制剂活性损失≤10％,2000U的≤4％.结论 干热法可有效降低猪凝血酶冻干制剂中指示病毒的滴度,处理后的凝血酶活性仍在国家药典规定范围,不失为1种凝血酶冻干制剂病毒灭活的安全、有效方法.
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辛德比斯病毒和伪狂犬病毒制备方法的优化
目的 优化辛德比斯病毒(Sindbis virus)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的培养和制备方法,建立高效价病毒制备方法.方法 从选用不同宿主细胞、不同的宿主细胞培养方式、以及不同的病毒悬液收集方式3方面考察病毒效价.病毒效价测定采用细胞病变法,按Karber氏法计算病毒效价.结果 用非洲绿猴肾(Vero)细胞培养的Sindbis病毒效价(8.63±0.45)明显高于用幼仓鼠肾(BHK)细胞培养的病毒效价(7.63±0.30)(P＜0.05);用Vero细胞培养的PRV效价(8.13±0.59)也明显高于用BHK细胞培养的病毒效价(6.94±0.71)(P＜0.05);宿主细胞长满单层后继续换液培养或再传代培养2种提高病毒效价的方式所制备的病毒效价(7.69±0.98 vs 7.54±0.69)的差异无统计学意义(P＞0.05),可任选其一;收获病毒时,直接收集培养悬液离心组(直收-冻组)病毒效价(8.66±0.83)较先冻融2次再离心组(冻-收-冻组)病毒效价(8.14±0.91)高(P＜0.05).结论建立了制备高效价Sindbis 病毒和PRV的方法;制备Sindbis病毒和PRV宜选用Vero 细胞;病毒培养悬液直接离心分装即可,既简化操作又可获高效价病毒.
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低pH孵放病毒灭活效果回顾性验证评价
目的 回顾和评价连续2次低pH病毒灭活工艺验证效果,为静注人免疫球蛋白制品病毒灭活工艺提供进一步技术支持.方法 将一定量指示病毒加入IVIG中,在pH4.1±0.3,24±1c条件下孵放24 d,并在灭活过程中的不同时间节点取样进行残余病毒滴度检测.结果 低pH孵放法可有效灭活VSV、Sindbis、HIV指示病毒,3种指示病毒滴度下降均大于4个Logs,符合国药监注[2002] 160号文件要求.结论 低pH孵放病毒灭活工艺能有效地增加静注人免疫球蛋白的安全性.
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应用纳米膜(DV20nm)过滤法去除人免疫球蛋白中指示病毒PPV的效果验证
目的:研究验证纳米膜(DV20 nm)过滤法去除人免疫球蛋白中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的去除效果.方法:在人免疫球蛋白中加入滴度为6.94 LgTCID50/O.1 mL的PPV为指示病毒,用纳米膜(DV20 nm)进行加压除病毒过滤.根据不同过滤时间点和过滤量进行取样检测样品中残余病毒滴度以评价去除病毒效果.结果:当过滤量为5L·m-2时,可去除PPV病毒滴度为4.19 ～4.88 LgTCID50/0.1 mL.过滤量为15 L·m-2时,去除PPV病毒滴度为3.00～ 4.19 LgTCID50/0.1 mL.过滤量达到25 L· m-2时,去除PPV病毒滴度为3.00～3.56 LgTCID50/0.1 mL.结论:当总过滤量为60L·m-2时,其过滤初期(过滤量5 L·m-2/时,仅为总量的1/12)去除PPV能力大于4.00 LgTCID50/0.1 mL,而随着过滤量逐渐增加,去除PPV能力逐渐下降.因此,纳米膜过滤法去除病毒必须充分考虑过滤样品的体积、加入指示病毒颗粒大小、产品中蛋白浓度、分子大小、纯度等综合因素,以其达到佳去除效果.
