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三株克里米亚-刚果出血热病毒中国分离株糖蛋白基因的全序列测定与比较分析
目的测定克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）中国分离株（即新疆出血热病毒，XH-FV）BA66019、BA8402及BA88166糖蛋白（M）基因的全部序列并分析各毒株之间的相互关系。方法 病毒RNA在只与其保守末端互补的特异引物PCM-Tag和随机引物的共同引发下逆转录成Cdna，以单一PCM-Tag和高保真DNA聚合酶扩增出完整的M基因。扩增产物纯化后作为模板进行序列测定，并将所得序列经计算机辅助分析其种系发生与编码策略。结果 XHFV代表株BA6019的M基因与国际原型株IbAr10200的M基因比较多5个碱基，为5365bp；比BA8402、BA88166多4个碱基，即5364bp。3株XHFV长ORF起始于M基因的第78位碱基，比IbAr10200株提前15bp。编码的前体蛋白共1689个氨基酸，比IbAr10200株多6个。4株病毒之间核苷酸序列的同源性分别为：80.9％（IbAr10200-BA66019），80.2％（IbAr10200-BA8402），80.2％（IbAr10200-BA88166），83.7％（BA66019-BA8402），83.6％（BA66019-BA88166），99.0％（BA8402-BA88166）；对应的氨基酸序列的同源性分别为85.1％，86.3％，86.6％，87.8％，88.0％，98.8％。它们与Dugbe病毒在核苷酸和氨基酸的同源性较低，大约是55％和37.7％。结论 XHFV BA66019、BA8402和BA88166与国际原型株IbAr10200的M基因在进化上形成各自单独的分支，人源分离株BA88166可能是来自蜱的BA8402株的变异株，提示20世纪80年代在新疆疫区可能只流行一种XHFV。
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以新型杆状病毒载体在昆虫、哺乳动物细胞中表达克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白基因
目的构建可以在哺乳动物细胞中高效表达的新型杆状病毒载体,并利用其将克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)中国分离株(新疆出血热病毒,XHFV)BA88166的核蛋白(NP)基因在昆虫和哺乳动物细胞中进行表达.方法将人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子连接至杆状病毒载体pFastBac1多角体启动子下游形成新载体pCB1,然后将XHFV NP基因克隆至该载体,通过重组质粒转染和病毒感染,检测其在哺乳动物细胞(COS-7和Vero)及昆虫细胞中的表达.结果连接至pCB1的XHFV NP基因均能在相应的细胞中获得良好表达;以重组杆状病毒感染的Vero细胞可以作为抗原检测XHF血清,与ELISA的检测结果完全一致,并与临床诊断有很好的平行性.结论新型杆状病毒载体能够驱动外源基因在昆虫和哺乳动物细胞中高效表达,不仅能方便快速地制备诊断抗原,还具有发展重组病毒疫苗和基因治疗的潜力.
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新疆南部地区蜱传虫媒病毒分子生物学调查
目的了解新疆南部地区蜱传虫媒病毒的种类和分布情况.方法在新疆南部地区的23个采集地36个采集点,采集蜱标本5045只,分别建立蜱标本cDNA文库,用PCR方法检测标本可能携带的病毒.结果黄病毒属引物、加利福尼亚血清组病毒引物对34份cDNA文库检测结果均为阴性;内罗毕病毒属引物和新疆出血热病毒巢式引物在巴楚县蜱标本中检测到新疆出血热(XHF)病毒核酸序列,对检测到的XHF病毒L和S片段进行系统进化分析.结论对新疆南部地区5045只蜱进行四种六对引物的PCR检测,未检出黄病毒属和加利福尼亚血清组病毒核酸序列,获得新疆出血热病毒L和S片段的核酸序列,研究了其分子流行特征.
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表达新疆出血热病毒S基因片段的重组腺病毒特异性CTL功能测定
目的通过表达新疆出血热病毒(XHFV)S基因片段的重组腺病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能测定,探求由XHFV S 基因片段编码的核衣壳蛋白作为抗原诱导的特异性CTL细胞对重组腺病毒致敏的靶细胞杀伤能力大小.方法 PCR扩增XHFV S 基因的cDNA片段,将扩增后的cDNA片段克隆入腺病毒自主载体,使其成为重组腺病毒,用重组腺病毒感染Balb/c小鼠后,利用非放射性乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定重组腺病毒的特异性CTL功能.结果在一定比例范围内,效应细胞与靶细胞的比例越高,特异性CTL%越高.结论由XHFV S 基因片段编码的核衣壳蛋白抗原诱导的特异性CTL细胞,能特异性地杀伤重组腺病毒致敏的靶细胞;证实由腺病毒自主载体本身所表达的一些蛋白质也可诱导细胞免疫,由该载体所引发的细胞免疫对疫苗接种不利.
