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鼻病毒逆转录实时荧光定量PCR方法的建立及应用
目的 建立同时检测A、B、C三型鼻病毒逆转录实时荧光定量聚合酶链(RT-PCR)方法,并检测临床样本.方法 合成能够同时检测A、B、C三型鼻病毒的引物和探针,制备RNA标准品并建立标准曲线,检测灵敏度、特异性和重复性,并对222份临床标本进行回顾性检测.结果鼻病毒A、B、C三型的线性范围分别是109～10拷贝/μl、109 ～ 10拷贝/μl、109～103拷贝/μl,标准曲线相关系数分别是0.999、0.997、0.999,扩增效率分别是96.10％、93.45％、96.98％.组内CV值小于3％.RT-PCR方法的检出率是27.02％,与传统PCR结果对比,RT-PCR方法的敏感性和特异性分别是100％和98.18％.结论 该RT-PCR方法是灵敏度、特异性和重复性均较好的能够同时检测鼻病毒A、B、C三型的分子诊断方法.
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鼻病毒在婴幼儿下呼吸道感染中作用的研究
目的 探讨鼻病毒在婴幼儿下呼吸道感染中的作用.方法 收集2008年5月到2009年4月北京儿童医院下呼吸道感染住院儿童鼻咽分泌物标本240份,使用Real-time RT-PCR方法筛选鼻病毒阳性标本,并进行统计分析.结果 在240例住院儿童中,入院诊断为肺炎的208例,占86.67%(208/240),支气管炎21例(8.14%).毛细支气管炎11例,无死亡病例,男女病例比例为1.93:1,且2009年2月采集标本数达到多.采用Real-time RT-PCR方法检测为鼻病毒阳性的标本71份,阳性率为29.58%(71/240),且主要的临床诊断症状是肺炎.发病年龄以2岁以下婴幼儿为主,占81.69%(58/71),其中以13～18月、≥24月年龄组发病率高,发病率为33.33%.结论 鼻病毒感染季节为春季和冬季,尤以2岁以下婴幼儿感染为主,主要症状表现为肺炎、支气管炎及毛细支气管炎等下呼吸道感染.鼻病毒流行具有季节性,且传染性强,传播速度快.应做好医院内防护措施,避免交叉感染.
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急性呼吸道感染患儿鼻病毒和其他病原检测及分析
目的：探讨湖南急性呼吸道感染患儿中鼻病毒及病原的流行病学分布特征。方法收集急性呼吸道感染患儿1447份鼻咽抽吸物（NPAs）样本及病历资料，用聚合酶链反应方法（PCR）、RT-PCR、巢式PCR方法检测NPAs中鼻病毒（HRV）及其他11种常见呼吸道病毒，同时进行细菌培养、分离及鉴定。结果（1）1447份样本中HRV检出率为18.73%（271/1447），其他呼吸道病毒检出依次为呼吸道合胞病毒（RSV）14.44%、副流感病毒（PIV3）10.85%，博卡病毒（HBoV1）8.15%、腺病毒（ADV）7.12%、偏肺病毒（HMPV）3.59%、流感病毒A、B型（IFVA、IFVB）1.94%和1.52%、副流感病毒1、2型（PIV1、PIV2）0.90%和0.28%、冠状病毒NL63和HKU 10.62%和0.55%；（2）HRV 检出率在年龄、性别分布差异无统计学意义（P＞0.05），在5月份检出率高（38.24%）；（3）HRV检出阳性与混合感染有相关性（P＜0.00），多因素回归分析发现HRV检出阳性与RSV（OR＝0.618，95%CI 0.405～0.944）、HMPV（OR＝0.224，95%CI 0.069～0.725）、ADV （OR＝2.044，95%CI 1.156～3.612）感染密切相关。结论HRV是引起小儿急性呼吸道感染的主要病毒病原体，HRV与RSV、HMPV、ADV的混合感染可能是呼吸道感染致病的主要原因。
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婴幼儿呼吸道合胞病毒和人鼻病毒急性下呼吸道感染临床特征及随访研究
目的：比较婴幼儿呼吸道合胞病毒（RSV）和人鼻病毒（HRV）急性下呼吸道感染的临床特征，探讨婴幼儿期RSV急性下呼吸道感染患儿后期哮喘和反复喘息的发生与HRV感染患儿是否存在差异。方法采用 RT-PCR 或 PCR 方法检测住院患儿咽拭子或鼻咽吸取物中常见的呼吸道感染病毒，选取单一RSV和HRV感染病例，回顾性比较两组患者的临床特征并进行随访。结果 RSV感染组纳入病例80例， HRV感染组纳入32例。两组患儿的临床特征相似，但RSV感染组患儿年龄偏小（P＝0.004），有喘息表现者明显多于 HRV 感染组（P＝0.000）。在与哮喘和反复喘息发生的关系上，两组间的差异无统计学意义（P值均为1.000）。结论婴幼儿RSV和HRV急性下呼吸道感染的临床特征相似，但在平均年龄、临床喘息的发生率等方面存在统计学差异。未发现婴幼儿期 RSV 感染患儿后期哮喘和反复喘息的发生与HRV感染患儿间存在差异。
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手足口病患者体内肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型与常见呼吸道病毒的检测及临床分析
目的 调查手足口病患者中EV71和CA16的感染现状,分析呼吸道病毒合并感染对患者的影响.方法 收集2010年6-10月在北京佑安医院就诊的手足口病患者348例,包括门诊轻症患者100例,住院患者248例.采集患者咽拭子标本提取病毒RNA,用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA,荧光PCR法检测EV71和CA16.以呼吸道病毒多重PCR引物扩增12种呼吸道病毒的基因片段,通过电泳分析判断结果.比较EV71(+)或CA16(+)组与EV71(-)CA16(-)组合并呼吸道病毒感染阳性率和重症患者比例,住院与门诊手足口病患者中合并感染呼吸道病毒的阳性率.结果 348例手足口病患者,共检测出呼吸道病毒感染36例.在248例住院手足口病患者中,111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率7.2%,相比137例EV71(-)CA16(-)组患者呼吸道病毒感染率7.4%,差异无统计学意义(x2=0.059,P＞0.05).在100例门诊轻症手足口病患者中,有17例(17%)合并呼吸道病毒感染,高于111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率,差异有统计学意义(x2=4.830,P＜0.05).在111例EV71(+)或CA16(+)组中,重症患者为101例(91.0%);在137例EV71(-)CA16(-)组中,重症患者为132例(96.4%),两组重症患者率差异无统计学意义(x2=3.099,P＞0.05).在348份标本中检出占前3位的呼吸道病毒分别是人鼻病毒A/B(HRV A/B)、人副流感病毒3(PIV3)、甲型流感病毒(FLU A).结论 手足口病患者中存在呼吸道病毒合并感染,但合并感染对手足口病病情未见明显影响.
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多重RT-PCR同时检测8种呼吸道病毒方法的建立
呼吸道病毒分别在2组多重RT-PCR体系中被成功扩增,评估结果显示呼吸道合胞病毒、鼻病毒和冠状病毒229E第一轮多重RT-PCR与普通RT-PCR结果的一致性分别为97.9%、95.8%和95.8%;第二轮多重半巢氏PCR与普通PCR扩增结果一致性分别为48/48、47/48和48/48;其他5种病毒的2轮扩增的结果一致性均为100%.结论 2组多重RT-PCR与普通RT-PCR扩增结果均具有较高的一致性,一种可以同时检测8种常见呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法被初步构建.
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慢性阻塞性肺疾病患者鼻部及下气道的鼻病毒检出率及载量比较
目的 比较慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)患者鼻部及下气道标本的鼻病毒检出率及病毒载量的差异,为临床检测标本类型的选择提供参考依据.方法 收集慢阻肺患者的鼻拭子(鼻部)及诱导痰(下气道)标本,包括急性加重期标本及稳定期标本,采用荧光定量PCR法进行鼻病毒检测.分别比较急性期及稳定期标本鼻病毒检出率、鼻拭子及诱导痰标本鼻病毒检出率及鼻病毒阳性配对的鼻拭子及诱导痰标本的鼻病毒载量.结果 2009年9月至2013年1月共收集来源于慢阻肺患者的鼻拭子标本及诱导痰标本639对,其中114对匹配的急性期及稳定期标本(鼻拭子及诱导痰),余411对只有稳定期标本(由于患者未出现急性加重,故无相匹配的急性期标本).匹配的114对稳定期及急性期标本鼻病毒检测结果显示,急性期鼻拭子标本鼻病毒的阳性率为13.2％(15/114),高于稳定期的3.5％ (4/114,P＜0.05)；急性期诱导痰标本鼻病毒的阳性率为21.9％ (25/114),亦显著高于稳定期的5.3％(6/114,P＜0.01).639对鼻拭子及诱导痰标本的检测结果显示,鼻拭子鼻病毒的检出率为6.6％(43/639),诱导痰标本鼻病毒的检出率为9.1％(58/639),两者检出率比较差异有统计学意义(P＜0.05),其中匹配的27对鼻拭子及诱导痰标本均检出鼻病毒,诱导痰标本鼻病毒载量为(62.1±9.5) ×108拷贝/L,高于鼻拭子标本的(3.38 ±0.52)×108拷贝/L,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 对于慢阻肺患者,诱导痰标本比鼻拭子更适合于鼻病毒检测,鼻病毒在下气道的载量高于上气道.
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不同基因型人鼻病毒感染所致儿童急性呼吸道感染的研究
目的 了解A、B、C各基因型人鼻病毒(HRV)感染所致儿童急性呼吸道感染(ARI)的临床类型.方法 收集2011年1月至2012年12月首都儿科研究所附属儿童医院门诊或住院的ARI患儿呼吸道标本1412例,采用半巢式PCR方法进行HRV检测,HRV阳性者经序列测定确定基因型别,并对各基因型检测阳性的病例进行临床类型分析.结果 1412例标本中有103例HRV检测阳性(7.3％),序列分析表明,103例中54例为HRV-A(52.4％),14例为HRV-B(13.6％),35例为HRV-C(34.0％)；在下呼吸道感染(LRI)的儿童中,HRV各基因型阳性检出率均高于上呼吸道感染(URI)的儿童(P值分别为0.003、0.011、0.003)；在LRI中,HRV-A、HRV-C的阳性检出率均高于HRV-B(P=0.000,0.026),而HRV-A、C则相近(P =0.112)；HRV各基因型检出率在不同严重程度ARI中的分布差异无统计学意义(Hc=0.044,P＞0.05,Kruskal-Wallis H检验)；HRV与其他病毒的混合感染与单一HRV感染的检出率相比较,在不同严重程度ARI中的分布差异亦无统计学意义(Zc=0.872,P＞0.05,Wilcoxon秩和检验).结论 HRV是引起北京地区儿童急性呼吸道感染(尤其是LRI)重要的病毒病原之一；HRV-C阳性检出率与HRV-A相近,较HRV-B高；尚不能认为HRV-A、B、C不同基因型感染引起的ARI存在严重程度的差别；其他病毒与HRV的混合感染未显著增加ARI的严重程度.
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一步法RT-PCR从临床样本中检测到鼻病毒基因
目的建立一步法RT-PCR检测临床样本鼻病毒基因,并对扩增产物进行测序分析.方法在鼻病毒基因组5′端非编码区选择一对鼻病毒特异性兼并引物建立一步法RT-PCR系统.对2004年春季收集的78份急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子样本进行鼻病毒基因筛测,对扩增阳性的样本进行核苷酸测序并用生物信息学软件分析.结果 78份鼻咽拭子样本用一步法RT-PCR检测出鼻病毒基因阳性11份,阳性率为14.1%,其中包括临床诊断为上呼吸道感染7例、支气管炎3例、肺炎1例.11份鼻病毒阳性样本用测序引物扩增并测序,测得的核苷酸序列经blast比对,与GeneBank中鼻病毒序列同源性分别高达89.0%～95.5%;11份样本序列之间的核苷酸同源性为75.2%～91.8%,核苷酸水平变异率为8.8%～31.0%;11份样本序列在进化树中聚类为两簇;11份样本序列高度保守区基因突变多为固定位点的单个核苷酸变异.结论所建立的一步法RT-PCR系统检测鼻病毒基因有快速、简便、特异性高的优点,适用于临床检测.临床样本测序分析发现,鼻病毒基因组有高度变异的特点.
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鼻病毒与呼吸道炎症相关性研究
鼻病毒属小核糖核酸病毒，不仅能引起普通感冒，还能导致急、慢性支气管炎等其他呼吸系统感染性疾病，探讨鼻病毒的作用机制，研制靶点明确、高效的抗鼻病毒药物始终是本领域的研究重点。随着技术的发展，近年来对鼻病毒的研究日益深入，尤其聚合酶链式反应方法的应用使得鼻病毒家族更趋丰富。本文分别对其病原学、检测方法及其可能的作用机制等做一综述。
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呼吸道病毒感染与支气管哮喘
尽管呼吸道病毒感染导致气道炎症反应的机制尚不明确,但婴儿期严重的下呼吸道病毒感染可导致喘息反复发作,提示呼吸道病毒感染可能参与了哮喘的发病.流行病学资料显示,病毒感染是儿童及成年人哮喘恶化的主要原因之一,病毒感染可激活多种炎症细胞,改变气道平滑肌受体表达,通过调节神经免疫等机制导致哮喘恶化.抗病毒治疗或者针对气道炎症的治疗可减轻哮喘恶化的严重度及减少哮喘恶化的频率.
关键词： 呼吸道合胞体病毒感染 鼻病毒属 哮喘 -
上海地区2009年至2010年婴儿呼吸道感染病毒谱系的特征
目的 使用Seeplex(R)RV15 ACE检测试剂盒检测上海地区婴儿呼吸道感染病毒的病原谱系.方法 征集新华医院儿科呼吸道发热门诊0～1岁组患儿62例,以咽拭子对呼吸道分泌物采样,提取样本中病毒核酸,反转录合成cDNA,使用Seeplex(R)RV15 ACE检测试剂盒扩增15种呼吸道病毒的目的 基因,以琼脂糖凝胶电泳检测特异性产物条带,判定感染病毒.并以检出病毒与检出季节和临床特征进行比较.数据采用Fisher's精确检验和卡方检验.结果 62例呼吸道感染患儿从咽拭子中检出病毒阳性36例,占58.1%,其中呼吸道合胞病毒B型(RSV-B)、鼻病毒、腺病毒、肠道病毒(hEV)、冠状病毒229E-NL63、A型流感病毒、副流感病毒1型和3型、博卡病毒、偏肺病毒、B型流感病毒的检出率分别为12.9%、11.3%、11.3%、8.0%、6.5%、6.5%、4.8%、4.8%、1.6%、1.6%和1.6%.检出双重感染6例,三重感染1例,多重感染占阳性病例的19.4%(7/36).冬季RSV-B检出率,高于其他三季(Fisher's精确检验,P=0.001),夏季检出hEV高于其他三季(Fisher's精确检验,P=0.01).结论 RSV-B、鼻病毒和腺病毒是上海地区婴儿呼吸道感染的前三位病毒病原体,多重病毒感染常见.
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上海地区儿童急性下呼吸道感染的鼻病毒基因检测及临床特征
目的 建立套式RT-PCR检测急性下呼吸道感染(ALRTI)患儿临床样本鼻病毒(HRV)基因的方法,了解上海地区ALRTI患儿HRV感染的现状.方法 收集2005年1月至12月住院的342例确诊为ALRTI的患儿的深部鼻咽分泌物(NPS)标本.用套式RT-PCR方法检测NPS中的HRV基因,并进一步对扩增产物进行序列分析.对HRV在ALRTI患儿中所占比例、性别、年龄、季节分布及临床特点进行分析.结果 在342例ALRTI患儿的NPS标本中,套式RT-PCR检测到46例HRV阳性,占13.5%;选取15份HRV阳性样本,用另一对引物扩增并测序,测得的核苷酸序列经BLAST比较,与基因库中已知HRV序列的同源性为83%～97%;15份样本序列之间核苷酸同源性在64.4%～98.4%,核苷酸变异在1.6%～48.3%;15份样本序列在进化树中聚类为两簇;15份样本序列变异度较大,可表现为核苷酸的点突变,也可是邻近几个碱基同时突变,甚至有单个或邻近几个碱基的核苷酸缺失及插入突变.46例阳性患儿中,男33例,女13例,男女之比为2.5∶1.HRV阳性患儿中,3岁以下婴幼儿检出38例,占HRV总检出数的82.6%;1岁以下患儿检出27例,占58.7%.HRV所致ALRTI全年可见,在3～5月为高峰.本组46例套式RT-PCR检测HRV阳性患儿中,诊断支气管肺炎45例,喘息性支气管炎1例;以中等度以下发热为主;39例患儿末梢血WBC＜10×109/L,占84.8%;37例中性粒细胞＜0.50,占80.4%;36例C反应蛋白＜8 mg/L,占78.3%,均符合病毒性肺炎的特点.合并症较少,绝大部分病情较轻,所有患儿均治愈.结论 套式RT-PCR检测HRV基因快速、简便.HRV基因组有高度变异的特点.HRV感染在本地区小儿ALRTI中占有一定比例.HRV所致ALRTI缺乏特异性,病情相对较轻且预后较好.
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鼻病毒所致儿童中枢神经系统感染的病原学及临床特点分析
目的：探讨鼻病毒（HRV ）作为儿童中枢神经系统感染病原学的意义及临床特点。方法收集2011年6月至2012年12月因发热、抽搐疑似中枢神经系统感染入儿科IC U的205例患儿脑脊液标本205份，应用GeXP多功能遗传分析系统行 HRV筛查，阳性结果行套式反转录‐PCR方法扩增、送基因测序，并对阳性病例进行临床资料分析。结果205份患儿脑脊液标本共检出 H RV 阳性7份，其中 HRV‐A有2份，HRV‐B 有1份，HRV‐C有4份（包括1份 HRV‐Ca型）。7例患儿中，男6例、女1例，除1例9岁，另6例均＜3岁，发病时间主要集中在9至10月份，发热、抽搐为其主要临床表现，病原体检出前临床诊断为病毒性脑炎、癫痫、热性惊厥、轻度胃肠炎伴良性惊厥（CwG）和手足口病等。7例患儿的病情轻重不一，但预后均良好。结论 H RV是引起小儿中枢神经系统感染的病原体之一。各型HRV均可致脑炎，但以 HRV‐C为主。 HRV脑炎的临床表现可类似于热性惊厥、CwG和手足口病。
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奚志敏钟华清沈军王立波
目的：从肺泡灌洗液（BALF）中检测鼻病毒（HRV），以了解 HRV致上海地区儿童社区获得性急性下呼吸道感染（ALRTI）的临床及分子生物流行病学特征。方法收集复旦大学附属儿科医院2014年1月至6月135例ALRTI住院患儿的BALF标本135份，并采集患儿临床信息。采用一步法实时荧光反转录PCR检测 HRV ，进一步检测 HRV阳性株VP4／VP2衣壳蛋白基因序列，绘制基因进化树。阳性检出率及构成比的比较采用卡方检验。结果135份BALF中HRV阳性检出率为4．4％（6／135）。6例感染HRV患儿年龄为8个月～8岁，≤3岁5例。 HRV阳性标本经扩增并测序后分析，结果4株为 HRV-A ，2株未知分型；4株 HRV-A 型内核苷酸同源性为76．5％～100．0％，分别与GenBank中的 HRV-A、HRV-B 和 HRV-C 参考株比较，核苷酸同源性分别为73．1％～91．7％、57．8％～66．0％和59．0％～65．0％。135例临床诊断为ALRTI的患儿中，普通肺炎124例，检出4株HRV（3．2％，4／124）；重症肺炎[合并呼吸衰竭和（或）心力衰竭]11例，检出2株 HRV。 HRV感染者临床均有高热、咳嗽表现，且以与其他病原体合并感染为主（5／6）。5例 HRV感染患儿末梢血白细胞计数＜10×109／L ，中性粒细胞比例＜0．50，C反应蛋白＜8 mg／L ，降钙素原＜0．05μg／L。所有 HRV感染患儿均临床治愈。结论本研究在BALF中检测到HRV ，提示 HRV是本地区ALRTI病原体之一，且以HRV-A多见，HRV致病株VP4／VP2衣壳蛋白基因序列有高度变异的特性。
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病毒性脑炎患儿脑脊液中人类鼻病毒的检测分析
目的 探讨小儿病毒性脑炎与鼻病毒的关系.方法 对1例男性,1岁零6个月的抽搐患儿的脑脊液、咽拭子应用RT-PCR多重检测技术进行呼吸道病毒及脑炎病毒检测,阳性结果再进一步基因测序,并分析其临床资料.结果 该患儿咽拭子及脑脊液样本中均检测到鼻病毒的特异性核酸片段,但其临床表现及脑脊液改变均较轻,未发现其他严重脑损伤的表现.结论 鼻病毒可能是我国小儿脑炎的病原之一,应引起重视.结果首次表明鼻病毒可引起中枢神经系统感染.
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河北省2013-2015年急性上呼吸道感染病毒病原学构成研究
目的 了解河北省2013-2015年引起急性上呼吸道感染(acute upper respiratory infection,AURI)的病原学构成和流行病学特征,为呼吸道感染的诊断和防治工作提供科学依据.方法 采集河北省4家医院门诊就诊的AURI患者的咽拭子标本1 551份,提取核酸后采用多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reac-tion,PCR)方法检测15种呼吸道病毒.结果 采集1 551份临床咽拭子标本,检测出阳性标本714例,阳性率为46.03％,其中鼻病毒阳性率高,为186(11.99％)例,其次为副流感病毒3型167(10.77％)例、呼吸道合胞病毒122(7.87％)例、腺病毒108(6.96％)例、乙型流感病毒56(3.61％)例、人偏肺病毒40(2.58％)例、甲型流感病毒39(2.51％)例、人博卡病毒38(2.45％)例、副流感病毒1型35(2.26％)例、冠状病毒229E/NL63型33(2.13％)例、肠道病毒32(2.06％)例、副流感病毒4型31(2.00％)例、冠状病毒OC43型30(1.93％)例、副流感病毒2型11(0.71％)例.病毒混合感染病例176例,检出率为11.35％.5岁以下年龄组病毒阳性率高为56.07％(337/601).结论 河北省AURI主要以鼻病毒、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒为主,各病毒有各自的流行特征.
