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山楂叶提取物及其制剂对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤中性粒细胞黏附的影响
目的 研究山楂叶提取物(牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷)及其制剂奥沙恩注射液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧损伤时中性粒细胞(PMN)黏附的影响及其分子机制.方法 以HUVEC为实验对象,复制缺氧复氧损伤模型,用酶标仪检测山楂叶提取物牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷及其制剂奥沙恩注射液对HUVEC缺氧60 min复氧30 rain和复氧240 min时PMN黏附的影响;应用流式细胞学方法,观察牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷及奥沙恩注射液对PMN表面黏附分子CD11/CDl8表达的影响.结果 缺氧60 min后可见HUVEC皱缩,变形;复氧30 min,模型组PMN-HUVEC之间有明显的细胞黏附现象,正常组细胞之间黏附较少,各用药组与模型组比较,PMN-HUVEC黏附较少.复氧240 min处理的细胞各组情况与复氧30 min相似.山楂叶提取物牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷及其制剂奥沙恩注射液均可显著抑制复氧30 min和240 min时PMN-HUVEC之间的黏附,且呈现出一定的量效关系.牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷可显著抑制HUVEC缺氧复氧损伤导致的PMN表面CD11/CDl8分子表达,且奥沙恩注射液和牡荆素葡萄糖苷均表现出良好的量效关系.结论 在静息状态下,PMN表面几乎不表达CD11/CD18分子,但缺氧复氧30 min和240 min处理的HUVEC上清液孵育中性粒细胞30 min,可增强PMN表面CD11/CD18分子表达的增加.且第1个时相即复氧后30 min时PMN-HUVEC的黏附比第2个时相点更为明显.复氧时经牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷及其制剂奥沙恩注射液处理的HUVEC上清液可抑制PMN表面CD11/CD18分子表达的增加,降低PMN-HUVEC黏附,这可能是山楂叶提取物及其制剂奥沙恩注射液保护心脏免于缺血再灌注损伤的重要分子作用机制之一.
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红花苷对模拟微重力下细胞迁移的作用
目的 观察红花苷修复模拟微重力下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞迁移抑制的作用并探讨其机制.方法 MTT比色法选出红花苷干预HUVECs的佳浓度；模拟失重-2D回转仪模拟失重培养HUVECs,分为正常重力对照组、模拟微重力组、红花苷微重力组.采用透膜侵袭小室模型检测细胞迁移；激光共聚焦显微镜观察红花苷干预后细胞骨架纤维状肌动蛋白(F-actin)的形态及对黏着斑(FAs)的影响.结果 与正常重力对照组比较,模拟微重力组细胞迁移数下降(P＜0.01)；红花苷微重力组较模拟微重力组细胞迁移数增加(P＜0.05).正常重力对照组的F-actin呈现明显极化、微丝集结成束,模拟微重力可导致F-actin骨架重构,极化下降并呈现弥散特点；而红花苷微重力组的F-actin排列有序,伪足较模拟微重力组增多,方向性显著增强.模拟微重力组较正常重力对照组FAs数量(VN)、面积(VA)及FAs到细胞边缘距离(DS)显著降低(P＜0.05)；红花苷微重力组较模拟微重力组VN、VA、DS显著升高(P＜0.05).结论 红花苷可改善模拟微重力作用导致的HUVECs迁移抑制,修复模拟微重力作用导致的HUVECs骨架F-actin的重构,改善FAs的生成及定位.
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龙蛭汤含药血清对人脐静脉内皮细胞增殖及自噬的影响
目的 探讨龙蛭汤促人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的可能作用机制.方法 采用400μmol/L过氧化氢(H2O2)干预人脐静脉内皮细胞4h建立自噬模型,通过CCK-8法观察龙蛭汤含药血清对模型组细胞增殖的影响,观察HUVECs自噬微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)和Bcl-2同源结构域蛋白(Beclin-1)表达. 结果 与正常组比较,空白组细胞增殖OD值及相对增殖率差异无统计学意义(P＞0.05);与空白组和正常组比较,模型组HUVECs增殖OD值及相对增殖率降低,LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达均升高(P＜0.05);与模型组比较,龙蛭汤组HUVECs增殖OD值及相对增殖率及LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达上升(P＜0.05).正常组和空白血清组细胞未见明显变化,模型组细胞胞质内双层膜样结构和空泡数量减少,龙蛭汤组细胞24 h后胞质内双层膜样结构增多,弯曲延展,包裹部分细胞器. 结论 龙蛭汤含药血清对H2O2诱导的HUVECs损伤细胞具有明显保护作用,其能维持细胞形态的完整和促进细胞增殖,其机制可能与上调细胞自噬水平相关.
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活血益气方及其拆方对缺氧人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨活血益气方及其拆方促进血管新生的可能作用机制.方法 建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧损伤模型,分为模型组、活血益气方组、活血方组及益气方组.另设正常对照组常规培养.活血益气方组、活血方组及益气方组给予含10％相应药物血清培养,模型组及正常对照组给予生理盐水血清培养,干预24h.采用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染法检测HUVEC凋亡,WST-1法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力,微板法测定丙二醛(MDA)含量及细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)含量,实时荧光定量PCR法检测细胞蛋白激酶C(PKC)、Ras、Raf-1 mRNA水平. 结果 与正常对照组比较,模型组HUVEC增殖明显减少,SOD活力及PKC、Ras、Raf-1 mRNA均显著下降,细胞凋亡及MDA、LDH含量明显增加(P＜0.05或P＜0.01).与模型组比较,活血益气方组、活血方组及益气方组HUVEC增殖均显著增加,LDH含量均显著降低,活血益气方组SOD活力显著提高,活血益气方组、活血方组细胞凋亡显著减少,活血益气方组、益气方组MDA含量显著降低,PKC、Ras、Raf-1 mRNA水平显著升高(P＜0.05或P＜0.01).结论 活血益气方及其拆方可不同程度地促进缺氧后HUVEC增殖并抑制其凋亡,可能与增强细胞抗氧化能力和调节PKC/Ras/Raf-1信号通路有关;活血益气方对细胞的保护作用优于活血方和益气方,二者发挥协同作用.
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Wnt信号参与氯化锂下调低氧复氧诱导HUVEC表达趋化因子FKN
目的 研究低氧复氧诱导培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达趋化因子FKN与Wnt信号通路中关键信号分子β-catenin、GSK-3β的相关性.方法 HUVECs,随机分为对照组、低氧复氧组和氯化锂(LiCl,10 mmol/L)组.免疫细胞荧光FITC法检测FKN蛋白表达,免疫细胞化学技术检测GSK-3β及β-catenin的表达.RT-PCR技术检测GSK-3β和FKN mRNA表达.结果 与正常对照组比较,低氧复氧引起GSK-3β、β-catenin及FKN表达明显增加(P＜0.05),于复氧2h达表达高峰;与低氧复氧组比较,LiCl组β-catenin表达明显增加(P＜0.05),FKN与GSK-33表达明显降低(P＜0.05),但仍然高于正常对照组.LiCl组FKN mRNA表达高于正常对照组(P＜0.05)而低于低氧复氧组(P＜0.05),于复氧1h达表达高峰;GSK-33 mRNA在低氧前后及复氧各时间点无差异表达.结论 Wnt 信号通路的激活可能在转录后翻译阶段参与LiCl下调低氧诱导HUVECs表达FKN的过程.
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NADPH氧化酶在TNF-α诱导HUVEC HO-1表达中的作用
目的探讨NADPH氧化酶来源的活性氧(ROS)在TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血红素氧化酶1(HO-1)表达中的作用.方法用小分子RNA干扰(siRNA)技术消除HUVEC的NADPH氧化酶p47phox亚基,用分子探针2,7-DCF测定细胞内ROS的产生量以及用RT-PCR测定HO-1 mRNA的表达.结果TNF-α(200 U/mL)作用24 h后,HUVEC中ROS的产生量增加了138%,细胞内HO-1 mRNA表达较对照组增加146.5%;转染p47phoxsiRNA后,细胞内NADPH氧化酶p47phox亚基的mRNA表达消失,ROS的产生量降低至对照组水平,而HO-1 mRNA的表达水平降低约54%.结论TNF-α刺激后,HUVEC内产生的ROS主要来源于NADPH氧化酶的活化,但ROS仅部分介导了TNF-α对HO-1基因表达的诱导作用.
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Orai2参与了HUVEC外钙敏感受体介导的Ca2+内流和NO生成
目的 研究钙释放激活的钙调素2(Orai2)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞外钙敏感受体(CaR)介导Ca2+内流和一氧化氮(NO)生成中的作用.方法 1)用转染技术将构建的Orai2干扰质粒(Orai2shRNA)转染人HUVEC,用实时定量RT-PCR和Western blot检测Orai2 mRNA和蛋白的表达.2)取2～5代HUVEC,分别以精胺激活CaR(钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)均激活)、ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA) +CaR负性变构调节剂Calhex231(激活ROC及阻断SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967(阻断ROC及激活SOC)为细胞模型.实验分为3组:特异性质粒转染组(Orai2shRNA组),未转染组(空白对照组),空质粒组(vehicle组),用荧光探针Fura-2/AM、DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO的生成.结果 1)与control组相比,shOrai2-71干扰后,Orai2 mRNA和蛋白的表达均明显降低,抑制率分别为75.75％和70.58％ (P ＜0.05).2)与对照组和空质粒组相比,在4种不同处理因素作用下,Orai2shRNA转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P＜0.05).结论 Orai2参与了HUVEC中CaR经SOC和ROC激活介导的Ca2+内流和NO生成.
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同型半胱氨酸抑制人脐静脉内皮细胞eNOS活性
目的 研究不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)作用不同的时间对人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响机制.方法 取2～3代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度Hcy孵育以及孵育不同时间.用Western blot和实时荧光定量RT-PCR法检测热休克蛋白90(HSP90)、蛋白激酶B(Akt)蛋白表达,小凹蛋白(Caveolin-1)、eNOS、P-eNOS蛋白及mRNA的表达,二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)mRNA表达.结果 与静息和激活状态下的对照组相比,在Hcy作用下,Caveolin-1蛋白的表达上调(P＜0.05),而Akt蛋白的表达下调(P＜0.05),且均呈浓度、时间依赖性.eNOS蛋白的表达无明显改变.Hcy对其他检测指标无影响.结论 Hcy引起的eNOS活性降低与增强Caveolin-1蛋白表达使其与eNOS藕联增加,减少HSP90、Akt和eNOS复合物的形成,进而抑制了eNOS的活性有关.
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尼古丁促人脐静脉内皮细胞凋亡
目的 研究不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞的促凋亡作用及作用机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,根据尼古丁浓度分组为10-6、10-7和10-8 mol/L组及对照组.尼古丁作用24 h后,用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-FITC荧光双染色法检测细胞凋亡.Western blot检测Bax、Bcl-2和PARP-1蛋白表达,对其作用机制进行研究.结果 与对照组相比,10-6、10-7 mol/L尼古丁组细胞增殖活性下降(P<0.05);凋亡数目增多(P<0.01).促凋亡蛋白Bax的表达量增加(P<0.01);抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少(P<0.01);PARP-1表达增加(P<0.01).结论 一定浓度的尼古丁对血管内皮细胞具有促凋亡作用,加速动脉粥样硬化性疾病的发生发展.
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脂联素减轻高糖诱导的人血管内皮细胞系损伤
目的 观察脂联素(APN)对高糖诱导血管内皮细胞系损伤的保护作用及NF-κB与LOX-1蛋白表达在其中的作用.方法 30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC-12(人脐静脉内皮细胞系),不同浓度的脂联素(10、20和40 μg/mL)作用48 h及20μg/mL脂联素作用不同时间(12、24、48和72 h)后,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态,Western blot检测核转录因子NF-κB和LOX-1蛋白表达,间接免疫荧光法检测NF-κB核转位情况.结果 脂联素作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC-12,内皮细胞形态改善,折光性增强,胞内颗粒物减少,细胞排列相对规整;同时,LOX-1蛋白表达下调(P＜0.05),NF-κB活性降低(P＜0.05),并呈现时间和浓度依赖性(n=3,P＜0.05).结论 脂联素可能通过NF-κB信号通路引起LOX-1蛋白表达下调,从而发挥其对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用.
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CYP19增强脱氢表雄酮抑制高脂诱导的兔主动脉及人脐静脉内皮细胞MMP-9的表达
目的 探讨脱氢表雄酮(DHEA)抗动脉粥样硬化(AS)的作用及其机制.方法 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为对照组、ox-LDL组(30 mg/L ox-LDL)、DHEA(低或高浓度)干预组(30 mg/L ox-LDL+0.1或1μmol/L DHEA)、DHEA+全反式维甲酸(ATRA)干预组(30 mg/L ox-LDL+1μmol/L DHEA+0.01μmol/L ATRA)及DHEA组(1μmol/L).用real-time PCR和ELISA检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA及蛋白的表达.通过脂质体介导的方法将pcDNA3.1-CYP19-GFP真核表达质粒(细胞色素P450芳香酶基因)及pcDNA3.1-GFP空质粒分别转染至HUVEC,给予ox-LDL诱导及DHEA干预,用real-time PCR和ELISA检测转染细胞MMP-9 mRNA及蛋白的表达.将兔分为对照组、高脂组(口服1％胆固醇和3％猪油)、DHEA干预组(口服0.27％DHEA)、DHEA+ATRA干预组[口服0.6 mg/(kg·d)ATRA]及单DHEA组.用real-time PCR和免疫组织化学法检测兔主动脉MMP-9 mRNA及蛋白的表达.结果 ox-LDL组HUVEC MMP-9的表达较对照组明显升高(P<0.05);DHEA干预组呈浓度依赖性使MMP-9的表达明显回降(P<0.05).高脂组兔主动脉MMP-9的表达较对照组明显升高(P<0.05);DHEA干预组能明显缓解高脂组的变化(P<0.05).CYP19+ox-LDL+DHEA组较空质粒+ox-LDL+DHEA组MMP-9的表达显著降低(P<0.05).结论 DHEA能抑制高脂诱导的兔主动脉及HUVEC MMP-9的表达,过表达细胞色素P450芳香酶基因(CYP19)能增强此作用.
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TRPC1/ORAI1复合体调节HUVECs SOC和ROC介导的Ca2+内流和NO生成
目的 研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 钙池操纵性钙通道(SOC) 和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca2+内流和NO生成中的作用.方法 取2~3代HUVECs,将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs.用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,real-time PCR和Western blot检测TRPC1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达及抑制效率.细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组及空质粒组(vehicle组),将上述3组细胞分别与CaR激动剂、ROC模拟剂TPA+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法 同步检测[Ca2+]i和NO.随后将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVEC,与CaR激动剂孵育后检测[Ca2+]i和NO,用免疫共沉淀法检测TRPC1和ORAI1的相互作用.结果 1)与对照组相比,TRPC1及ORAI1组,mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05);2)在4种不同处理作用下,TRPC1及ORAI1转染组中细胞内Ca2+浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);3)与对照组及单转染TRPC1及ORAI1组比,共转染组细胞内Ca2+浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);4)TRPC1与ORAI1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下相互作用增强.结论 TRPC1与ORAI1复合体共同调节CaR经SOC和ROC激活介导的Ca2+内流和NO生成.
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miR-328对高糖诱导HUVECs上皮间质转换的调控及信号机制
目的 探讨miR-328对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上皮间质转换的调控作用及机制.方法 培养HUVECs,构建携带miR-328基因的重组慢病毒,转染HUVECs.细胞分7组:正常葡萄糖、甘露醇、高浓度葡萄糖、miR-328、miR-328病毒阴性对照、高浓度葡萄糖+U0126、miR-328+U0126.免疫荧光双染色鉴定HUVECs间质转分化;RT-qPCR检测miR-328表达;Western blot检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2表达.结果 1)经高糖处理HUVECs呈CD31、α-SMA染色双阳性;2)与对照组比较,高糖组miR-328表达增高(P<0.05);与高糖及miR-328组比较,U0126处理后miR-328表达降低(P<0.05);3)与对照组比较,高糖及miR-328组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增多(P<0.05);与高糖及miR-328组比较,U0126处理后Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达减少(P<0.05);4)与对照组比较,高糖及miR-328处理后p-MEK1/2、p-ERK1/2表达增高(P<0.05);而U0126处理则能抑制这一现象(P<0.05).结论 高糖可诱导HUVECs上皮间质转换,同时miR-328表达增高;miR-328可诱导HUVECs上皮间质转换;HUVECs上皮间质转换与MEK1/2-ERK1/2信号通路有关.
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CML患者循环内皮细胞的分子标志物与其体外增殖能力相关
目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)患者循环内皮细胞(CECs)的分子标志物与其体外增殖能力的关系.方法 免疫磁珠分离CML患者的CECs,与同期培养的HUVECs进行生物学特性比较.用FISH检测CECs上bcr/abl融合基因的表达.结果 CML患者的CECs与HUVECs均有典型的血管内皮细胞形态,两者均高表达CD146及VWF,与HUVEC相比,CECs高表达CD34、KDR及CD133(P ＜0.05),增殖能力更强.12名CML患者CECs中bcr/abl阳性率为10.77％,与疾病进程呈正相关的趋势.结论 证实CML患者的CECs不同于成熟内皮细胞,它们的高增殖能力可能与表达肿瘤特异融合基因有关.
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氧化修饰减弱HDL上调人脐静脉内皮细胞ABCA1表达
血脂异常是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的始动性因素.血浆高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL.)在体内能被多种因素氧化,其抗AS的作用随之减弱.
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川崎病急性期患儿血清活化HUVECs NF-κB并促进MMP-9分泌
川崎病（ Kawasaki disease ，KD），又称皮肤黏膜淋巴结综合征（ mucocutaneous lymph node syndrome ， MCLS ），是一种好发于5岁以下儿童和婴幼儿的急性全身性血管炎性疾病。病变可累及动脉、静脉和毛细血管，尤以冠状动脉为明显，成为小儿后天性心脏病的主要病因［1］。目前，KD病因与发病机制尚不十分清楚，本实验观察川崎病患儿急性期血清对人脐静脉内皮细胞（ human umbilical vein endothelial cells ， HUVECs ） NF-κB P65表达及MMP-9分泌的影响，及NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂（ PDTC）对上述过程的影响。
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肿瘤坏死因子对人脐静脉内皮细胞PAI-1活性、mRNA的影响以及促分裂原活化蛋白激酶的作用
目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)活性及mRNA水平的影响,以及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在其中的作用. 方法进行HUVECs的培养和鉴定.加入不同浓度TNF-α,并选择佳时间条件.采用发色底物法测定PAI-1活性,Northern blot法检测PAI-1 mRNA的水平.运用MAPK激酶抑制剂PD98059观察对上述PAI-1l表达系统的作用. 结果不同浓度TNF-α(5×104IU/L、1×105IU/L、2×105IU/L和4×105IU/L)均明显增高HUVECs PAI-1的活性(P<0.01),1×105IU/L TNF-α作用不同时间(12、18、24 h),PAI-1活性均明显增加(P<0.01).1×105IU/L TNF-α作用18 h时,PAI-1 mRNA水平为正常对照组的2.88倍.MAPK激酶抑制剂PD98059能显著抑制TNF-α对PAI-1活性和mRNA表达增强的作用. 结论 TNF-α增强HUVECs PAI-1活性与mRNA表达;PAI-1活性提高与其mRNA表达增加呈正相关;MAPK途径在TNF-α诱导PAI-1反应中起着重要作用.
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胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学观察
目的探讨胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学特征. 方法利用电镜技术观察血管内皮细胞ECV304和C6胶质瘤细胞共培养(混合共培养、Transwell共培养、Transwell膜两面共培养)后的内皮细胞的孔窗、内皮细胞之间的连接及内皮细胞与肿瘤细胞的相互关系、瘤细胞的"血管周足"等的形态学特征;并与4例人脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障进行比较.结果电镜下发现ECV304细胞经与C6细胞按3种不同方式共培养汇合后均为无孔窗型内皮细胞,细胞间出现紧密连接;Transwell共培养的膜上C6细胞未见伸出伪足突向膜的微孔;经膜两面共培养的瘤细胞则可通过Transwell的微孔突向内皮细胞侧,但瘤细胞未伸出伪足包绕内皮细胞或突入内皮细胞间隙,瘤细胞的"血管周足"不完整,后两者与脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障的形态特征相类似. 结论在体外经Transwell膜两面共培养的ECV304和C6胶质瘤细胞的系统可在一定程度模拟体内的血瘤屏障的形态学特征.
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藏红花素对人脐静脉内皮细胞增殖及细胞外调节蛋白激酶信号通路的影响
目的 观察藏红花素(crocin)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外增殖、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2表达及活性的影响.方法 用藏红花素及MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂PD98059分别处理HUVECs,EdU细胞增殖法检测细胞体外增殖活力,Western blotting法检测crocin对磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和总ERK1/2表达的影响,激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca2浓度.结果 在1 μmol/L和10 μmol/L浓度水平,藏红花素可明显促进细胞的增殖能力,提高磷酸化ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达水平,并增加细胞内Ca2浓度;给予MEK抑制剂PD98059后,细胞的增殖能力下降,磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的表达减弱,细胞内Ca2浓度降低.结论 藏红花素通过活化ERK1/2信号途径,提高细胞内Ca2浓度,促进入脐静脉内皮细胞的体外增殖能力.
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中电导钙激活钾通道调节表皮生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞体外增殖
目的 观察表皮生长因子(EGF)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)离子通道中电导钙激活钾通道(KCa 3.1)表达的影响,以及KCa 3.1在EGF诱导HUVECs体外增殖过程中的作用.方法 MTT法筛选EGF佳实验浓度;免疫荧光和Western blotting技术检测EGF对HUVECs细胞KCa 3.1的表达;经KCa 3.1阻断剂TRAM-34处理,MTT法分析EGF诱导的HUVECs增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期,RT-PCR法分析细胞周期蛋白D1(cyclinD1)及周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)表达的水平.结果 EGF处理细胞48h后,MTT实验证实25 μg/L浓度的EGF促细胞增殖效应强.免疫荧光染色显示,EGF明显促进KCa 3.1蛋白表达,且Westernblotting提示KCa 3.1的表达上调1.4倍.进一步研究显示,高选择性阻断剂TRAM-34阻断KCa 3.1通道48h后EGF的促细胞增殖作用显著下降,并呈时间和剂量依赖性;细胞周期G1期细胞百分比明显增加;CDK4的mRNA表达下调,而cyclinD1表达无明显变化.结论 KCa 3.1可能通过影响细胞周期进程调节EGF诱导的HUVECs增殖过程.
