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钙释放激活钙通道调节分子1促进结肠癌细胞系SW480的增殖
目的 探讨钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)对结肠癌细胞系SW480增殖的影响及其机制.方法 以ORAI1干扰慢病毒感染SW480细胞,分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞中ORAI1mRNA和蛋白的表达,通过MTT法、集落形成实验和倍增时间检测细胞的增殖,流式细胞仪检测其周期,激光共聚焦显微镜检测细胞钙内流(SOCE),Western blot法检测细胞中ERK1/2、p-ERK1/2和CyclinD1蛋白表达.结果 SW480转染ORAI1干扰慢病毒72 h后,可见明显的荧光表达;干扰组较空病毒组和对照组,ORAI1的表达降低(P＜0.01)、细胞生长减慢(P＜0.05)、集落形成能力减弱(P＜0.01)、倍增时间延长(P＜0.01)、G1期细胞比例增高(P＜0.05)、SOCE内流峰值降低(P＜0.05)、p-ERK1/2和CyclinD1的蛋白表达量降低(P＜0.01).结论 ORAI1可能通过SOCE调节胞内Ca2+浓度,并进一步通过MAPK信号通路促进SW480细胞的增殖.
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TRPC1/ORAI1复合体调节HUVECs SOC和ROC介导的Ca2+内流和NO生成
目的 研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 钙池操纵性钙通道(SOC) 和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca2+内流和NO生成中的作用.方法 取2~3代HUVECs,将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs.用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,real-time PCR和Western blot检测TRPC1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达及抑制效率.细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组及空质粒组(vehicle组),将上述3组细胞分别与CaR激动剂、ROC模拟剂TPA+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法 同步检测[Ca2+]i和NO.随后将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVEC,与CaR激动剂孵育后检测[Ca2+]i和NO,用免疫共沉淀法检测TRPC1和ORAI1的相互作用.结果 1)与对照组相比,TRPC1及ORAI1组,mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05);2)在4种不同处理作用下,TRPC1及ORAI1转染组中细胞内Ca2+浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);3)与对照组及单转染TRPC1及ORAI1组比,共转染组细胞内Ca2+浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);4)TRPC1与ORAI1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下相互作用增强.结论 TRPC1与ORAI1复合体共同调节CaR经SOC和ROC激活介导的Ca2+内流和NO生成.
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ORAI1基因缺陷性联合免疫缺陷病一例并文献复习
目的 报道1例ORAI1缺陷性联合免疫缺陷病,并结合文献对该病临床特征及治疗预后进行探讨.方法 对中南大学湘雅医院儿科2018年2月诊治的1例ORAI1基因变异患儿的临床资料进行分析.以“ORAI1””免疫缺陷”“immunodeficiency”为关键词,对中国知网数据库、万方数据知识服务平台、Pubmed数据库建库至2018年8月收录的文献进行检索,总结该病临床特征、治疗及预后.结果 患儿女,1岁3月龄起病,临床表现为上呼吸道感染后双侧眼睑下垂,急性病程,很快进展出现全身肌无力症状、治疗期间出现反复呼吸道感染,免疫治疗和抗感染治疗效果欠佳;实验室检查补体C3降低,抗甲状腺球蛋白升高,甲状腺过氧化物酶抗体升高,抗乙酰胆碱受体抗体轻度升高,B淋巴细胞(CD3-CD19+)升高,NK细胞(CD3-CD56+)降低;基因检测发现ORAI1c.12(exon 1)G＞T(p.E4D)纯合变异,其父母为杂合变异.文献检索共收集相关病例报道4篇(均为英文),共报道7例ORAI1基因变异患者,其中纯合变异3例、杂合变异2例、复合杂合变异2例,临床表现为早期发作的复发性感染,先天性肌张力减退,血清IgA、IgM升高,NK细胞数减少,都具有家族遗传病史等,该病预后较差,7例患儿中4例死于肺部感染、脓毒症,另外3例虽然存活,但仍然肌张力低下,生活不能自理.结论 ORAI1缺陷性联合免疫缺陷病患儿临床上常表现为反复感染、先天性肌张力减退等症状,呼吸肌无力致反复呼吸道感染等是重症患者以及患儿预后不良的重要因素.该病缺乏有效治疗手段,预后较差.
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钙释放激活钙通道调节分子1促进结肠癌细胞系SW480的迁移和侵袭
目的：探讨钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）对SW480迁移和侵袭的影响及其机制。方法：以ORAI1干扰慢病毒感染SW480细胞，用RT-qPCR和Western blot检测细胞中ORAI1mRNA和蛋白的表达，Transwell小室、黏附实验、血管形成及拟态分别检测细胞侵袭、迁移能力，同、异种细胞间黏附及血管生成能力，激光共聚焦显微镜检测细胞钙内流（store-operated Ca2+entry，SOCE），Western blot法检测细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、VEGF和E-cadherin蛋白的表达。结果：SW480转染ORAI1干扰慢病毒72h后，可见明显的荧光表达；较空病毒组和（或）对照组，干扰组ORAI1的表达降低（P<0.01）；侵袭和迁移能力减弱（P<0.01）；同种黏附能力增强（P<0.05）；异种黏附能力减弱（P<0.05）；血管生成能力减弱（P<0.01）；SOCE内流峰值降低（P<0.05）；p-ERK1/2、MMP-2和VEGF的表达降低（P<0.01）、E-cadherin表达增加（P<0.01）。结论：ORAI1可以促进SW480的迁移和侵袭，其机制可能与SOCE增加有关。
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钙释放激活钙通道研究进展
库操纵的钙(Store Operated Calcium,SOC)进入参与许多重要Ca2+信号生理过程,如细胞分化和凋亡虽然SOC的许多生物物理特性被表述,但研究清楚的是钙释放激活的钙(Ca2+ release-activated Ca2+,CRAC)通道.近通过RNA干扰技术在果蝇和哺乳动物细胞上鉴定出CRAC通道的两个组成蛋白STIM1和Orail细胞静息时,STIM1均匀分布在内质网膜(ER)上.一当钙库耗竭,ER上STIM1会聚集迁移到细胞膜下,相比而言,Orail是一个形成CRAC通道孔的四次跨膜蛋白.有报道说STIM1作为ER上一个Ca2+感受器向细胞膜传导钙库耗竭信号.虽然钙库耗竭激活CRAC通道的过程在近的研究中被定量描述为四个步骤,但还有很多细节仍然不清楚.如STIM1是如何感受钙库耗竭而导致其发生聚集的不清楚,又如STIM1是如何定位到细胞膜下又如何传导信息的不清楚,STIM1和Orai1直接到底是如何相互作用的等都有待进一步的研究.本文对CRAC通道的研究历史和新进展进行了讨论.
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体外高糖环境对H9 c2心肌细胞中STIM1、Orai1及TRP C1的影响
目的构建体外高糖诱导的心肌损伤模型，观察体外高糖环境对H9c2心肌细胞的增殖以及基质作用分子1（ STIM1）、Orai1和瞬时受体电位通道1（ TRPC1）表达的影响。方法体外培养鼠胚H9c2心肌细胞，随机分为4组，正常对照组（5?5 mmol／L葡萄糖）、高渗组（27?5 mmol／L甘露醇＋5?5 mmol／L葡萄糖）、高糖组（33 mmol／L葡萄糖），药物组（2μmol／L SKF96365＋33 mmol／L葡萄糖）。培养72 h。采用CCK8技术检测细胞增殖率；采用RT?PCR以及Western blotting技术测定4组STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果正常对照组和高渗组STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义（ P均＞0?05）；高糖组STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相对表达量较正常对照组增加（ P均＜0?05）；药物组的表达量较正常对照组高（P均＜0?05），较高糖组下降（P均＜0?05）。结论体外高糖在一定程度上抑制心肌细胞增殖，促进STIM1、Orai1及TRPC1蛋白的表达，这可能是体外高糖环境下H9c2心肌细胞损伤的机制之一。
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高糖对肾小球系膜细胞BKCa-Orai1信号复合物表达与功能的影响
目的 探讨在肾小球系膜细胞(GMCs)中,钙库操纵钙内流(SOCE)的主要通道蛋白Orai1与其下游信号分子大电导钙激活钾通道(BKCa)的物理性与功能性相互作用,及其在高糖环境下的改变.方法 采用免疫共沉淀法(co-IP)检测Orai1与BKCa相互作用;利用钙成像检测SOCE引起的细胞内游离Ca2+浓度变化;利用DiBAC4(3)作为荧光指示剂,检测SOCE引起细胞膜电位的改变;免疫蛋白电泳法检测Orai1与BKCa的表达水平.结果 在GMCs,SOCE的主要通道蛋白Orai1可与其下游信号分子BKCa通道蛋白形成信号复合物,引起GMCs膜电位超极化.高糖培养可以明显上调Orai1与BKCa蛋白的表达水平,并增强SOCE引起的膜电位超极化水平.结论 GMCs的Orai1可与BKCa形成信号复合物,参与调节细胞膜超极化过程,并可能参与高糖培养对细胞膜超极化的影响.
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Homer蛋白在钙通道调控中作用研究进展
Homer蛋白是一种支架蛋白,包括Homer1、Homer2和Homer3 3种受体蛋白及其剪接体.Homer蛋白参与调节一系列Ca2+调控蛋白,包括代谢性谷氨酸受体、三磷酸肌醇受体、瞬时受体电位通道、兰尼碱受体、基质相互作用分子1及Orial.Homer蛋白调控细胞内多种钙通道的开关.Ca2+作为细胞内主要信使,参与多种细胞和组织生理活动,包括细胞吞噬、凋亡及基因调节,而细胞内Ca2+稳态的维持需多种钙通道参与,阐明Homer对细胞内钙通道调控的作用有一定意义.本文就Homer蛋白在钙通道调控中作用的研究进展作一综述.
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益气活血方联合PI3K抑制剂Wortmannin对血小板聚集率的影响
目的:观察益气活血方联合PI3K抑制剂Wortmannin对大鼠体外血小板聚集率的影响.方法:高剂量、中剂量、低剂量益气活血方(0.2 g·L-1、0.1g·L-1、0.05g·L.1)体外干预血小板,用比浊法检测二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血小板聚集水平,用钙离子探针fura-2/AM观察血小板胞内Ca2+变化,用qPCR和Western blot法分别检测钙池调控Ca2+流入通道(store-operated calcium channel,SOCC)成分Orai1和基质交感分子1(stromal interaction moleculel,STIM1) mRNA及蛋白表达水平.结果:与对照组比较,益气活血方中剂量组(0.1 g· L-1)和高剂量组(0.2g·L-1)血小板聚集率显著降低(P＜0.05),益气活血方高剂量组(0.2 g·L-1)血小板胞质内Ca2+浓度显著降低(P＜0.05).益气活血方高剂量组(0.2 g·L-) SOCC通路上STIM1、Orai1的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);联合应用PI3K抑制剂Wortmannin能显著抑制血小板聚集率(P＜0.01),抑制作用明显好于单独应用中药或西药.结论:益气活血方联合应用PI3K抑制剂Wortmannin能显著抑制血小板聚集率,其作用与抑制STIM1/Orai1活性有关.
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Orai1在载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成中的表达
目的 探讨Orai1在载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达.方法 选取7～8周龄雄性ApoE-/-小鼠及野生型C57BL/6J小鼠,高脂饲喂20、27和33周后,在各个时点处死动物.取主动脉制备连续切片,HE、Masson染色计算机图像分析仪测定斑块面积占管腔面积百分比,及胶原成分占斑块面积百分比;油红O染色分析斑块中脂质含量;免疫组织化学染色测定平滑肌细胞阳性表达Orai1的百分比;West-em Blot定量分析Orai1在易损斑块形成过程中的动态表达.结果 与同周龄C57BL/6J小鼠相比,ApoE-/-小鼠主动脉Orai1表达增高,且随着其周龄增加,Orai1在ApoE-/-小鼠主动脉的表达动态升高(P＜0.05).结论 Orai1 参与动脉粥样硬化斑块形成的病理过程,在其形成过程中其表达上调.
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小鼠Orai1基因真核表达载体myc-Orai1的构建
目的 构建小鼠Orai1基因的真核表达载体myc-Orai1(△4aa).方法 从小鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Orai1(△4aa)序列,所得片段及真核表达载体pRK5-myc用Sal I和Not I双酶切,后连入pRK5-myc载体中.重组质粒经Sal I和Not I双酶切鉴定后送公司测序.结果 PCR扩增得到预期900 bp大小的目的片段,经SalI和Not I双酶切鉴定正确重组质粒送公司测序,结果与预期一致.结论 成功构建myc-Orai1(△4aa)载体,为后续研究提供了条件.
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血管疾病治疗新靶标:STIM1和Orai1
钙离子(Ca2+)是常见的第二信使,不同于其它第二信使,其主要位于细胞外或存储于内质网(endoplasmic reticulum,ER)等细胞器内.静息状态下细胞内游离Ca2+浓度(intracellular Ca2+ concentration,[Ca2+]i)约为细胞外的1/20000,受体激活或生物信号刺激可通过改变[Ca2+]i进一步发挥生物放大效应.[Ca2+]i的升高主要通过胞内Ca2+释放和胞外Ca2+内流两大途径.随着胞内钙库的排空,位于质膜上的Ca2+内流通道被激活,使Ca2+由胞外进入胞质内,这个过程称为钙库操纵的钙内流(store-operated calcium entry,SOCE),其通道称为钙库操纵的钙通道(store-operated calcium channel,SOCC).近来研究证实组成SOCC的主要蛋白是:Ca2+感受蛋白基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)[1-2]和Ca2+通道蛋白Orai1[3-4].
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STIM1、ORAI1在外伤性癫痫大鼠中的表达
目的 研究基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)和钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1/CRACM1)在外伤性癫痫大鼠脑组织皮层中的表达变化,探讨其与外伤性癫痫的关系及其意义.方法 84只成年SD大鼠随机分为对照组(42只)和实验组(42只),制作FeCl3外伤性癫痫模型,实验组予皮层注射100mmol/L FeCl35μL,对照组皮层注射等量生理盐水,观察记录大鼠伤后癫痫发作的行为学表现,伤后不同时间点(6h、24h、72h、7d、14d、21d、28d)随机取6只大鼠伤侧皮层脑组织,用荧光定量PCR、Western blot和免疫组化技术检测STIM1和ORAI1的mRNA和蛋白的表达.结果 实验组伤后出现典型的癫痫发作,制模成功率达84.0％,对照组未见癫痫发作；实验组STIM1、ORAI1的mRNA表达均较对照组显著增高(P＜0.05),72h为表达高峰(P＜0.05)；实验组STIM1、ORAI1在伤后6h的蛋白表达与对照组比较无统计学差异(P＞0.05),此后6个时间点的表达与对照组比较均显著增高(P＜0.05),72h为表达高峰(P＜0.05).结论 STIM1、ORAI1在外伤性癫痫大鼠皮层脑组织中表达显著上调,钙释放激活的钙(calcium release-activated calcium,CRAC)通道可能与外伤后癫痫的形成有关.
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丁酸钠对人结肠癌细胞株HCT-116细胞凋亡及基质相互作用分子和Orai1蛋白活性的影响
目的 研究丁酸钠诱导结肠癌细胞株HCT-116细胞凋亡机制.方法 hoechst 33342和AnnexinV+PI检测丁酸钠诱导结肠癌细胞HCT-116的凋亡作用；免疫荧光法检测丁酸钠对基质相互作用分子(STIM1)和钙离子通道Orai1蛋白在细胞内定位的影响；免疫印迹法检测STIM1和Orai1蛋白表达量的变化.结果 丁酸钠可诱导结肠癌细胞HCT-116凋亡、STIM1移位并与Orai1具有共定位现象.结论 丁酸钠可通过调节STIM1和Orai在结肠癌细胞中的定位而促发细胞凋亡.
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钙池操纵钙通道STIM1和ORAI1在ⅢA 期非小细胞肺癌中的表达
目的:研究ⅢA 期非小细胞肺癌(NSCLC)患者手术肿瘤组织中STIM1 或ORAI1 蛋白表达和生存预后的关系.方法:应用S-P 免疫组化方法检测70 例ⅢA 期NSCLC 患者手术肿瘤组织STIM1 和ORAI1蛋白表达,统计学分析其与患者无疾病生存预后的关系.结果:男性NSCLC 患者中,STIM1 低表达者预后有好于高表达者的趋势(21 个月vs 12 个月,P ＝ 0.06).鳞癌NSCLC 患者中,STIM1 低表达者预后有好于高表达者的趋势(33 个月vs 9 个月,P ＝ 0.07).结论:在鳞癌和男性ⅢA 期NSCLC 患者中,STIM1 低表达可能预示着患者有较好的无疾病生存预后.
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Orai1和STIM1在姜黄素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中的作用
目的 探讨不同浓度姜黄素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中Orai1和STIM1mRNA水平的改变.方法 A549细胞分别暴露于5、10、15、20、25和30 μmol/L姜黄素12、24和48 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活力;将不同浓度姜黄素孵育A549细胞24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;real-time PCR确定25 μmol/L姜黄素处理24h后,Orai1和STIM1mRNA表达水平.结果 姜黄素对A549细胞的抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性,不同浓度姜黄素处理A549细胞24 h细胞存活率分别为96.5％、95.0％、77.4％、63.9％、57％、39.6％,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).姜黄素处理后,流式细胞仪分析结果显示,细胞凋亡率呈明显剂量依赖关系(P＜0.05或P＜0.01).经姜黄素处理后A549细胞Orai1和STIM1mRNA表达量均明显低于对照组(P＜0.01).结论 姜黄素可能引起A549细胞Orai1和STIM1mRNA表达水平发生改变,通过下调Orai1和STIM1mRNA表达量引起细胞凋亡.
关键词： ORAI1 STIM1 人肺腺癌A549细胞 细胞凋亡 姜黄素 -
利用酵母双杂交研究与Ca2+CRAC通道Orai1相互作用蛋白
目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orai1发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制.方法 :以Orai1-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质, 运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用.结果:以Orai1-C端为诱饵终筛出了几个阳性克隆,经测序分析, 发现了其中一个感兴趣的蛋白.结论:Orai1可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关.
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钙池操控钙通道在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用
目的 研究钙池操控钙离子通道(SOCC)在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中的作用,探讨SOCC与SAH后钙超载致神经元死亡的关系.方法 枕大池单次注血法建立兔SAH模型,使用2-APB干扰SOCC通道活性后建立SAH干预组,Fura-2AM检测胞内钙离子浓度,Western blotting检测SOCC通道蛋白STIM1和ORAI1的表达变化,并与正常对照组、假手术组相比较,TUNEL检测皮层神经元凋亡.结果 SAH后皮层中STIM1和ORAI1蛋白表达均持续升高,在3d时达到高峰,同时皮层神经元胞内钙离子浓度达到峰值.给予SOCC通道阻断剂后,皮层STIM1和ORAI1蛋白表达被抑制,皮层神经元钙内流减低,神经功能评分改善.结论 SAH后神经元的钙超载是造成早期脑损伤的重要原因;抑制SOCC产生的钙内流可缓解神经细胞死亡,改善神经功能.
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SOC可能是防治过敏性紫癜的新靶点
过敏性紫癜(HSP)是一种常见的出血性疾病，近年来发病率逐年升高，部分治疗较困难，尤其是一些顽固性紫癜肾，治疗非常棘手，因此，寻找新的治疗靶点是非常有必要的。细胞内许多生物学过程的实现依赖于Ca2+浓度的改变。 SOC参与机体的多种生理病理过程，并可能对HSP的发生发展起着重要作用。
