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多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用
目的 建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌.方法 设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法.利用已知菌株,验证方法的特异性和低检出限.与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性.结果 多重PCR方法检测艰难梭菌的低检出浓度为0.7 pg/μl,特异性为100％.53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA +/tcdB+为39株,tcdA-/tcdB-为14株.ELISA法检测毒素A/B显示23株为阳性、30株为阴性.23株ELISA法毒素A/B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA+ /tcdB+.结论 多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值.
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艰难梭菌感染治疗方法
艰难梭菌为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，可引起艰难梭菌相关性腹泻（CDAD），导致一系列的肠道感染症状。CDAD的发病率在全球范围内不断提高，尤其是高产毒株在北美地区造成了医院内的暴发流行，引起了世界范围的关注。近年来，国外相继出现了耐甲硝唑和万古霉素的艰难梭菌的报道，传统的治疗方法面临严重挑战，一些新的治疗方法应运而生。本文将对CDAD的治疗方法及其进展做一简要综述。
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院内感染艰难梭菌的毒素检测及核糖体分型研究
目的:研究院内艰难梭菌毒素分离株的毒素情况,对核糖体分型展开研究.方法:抽选出100例腹泻病住院患者未成形的大便制成标本后,完成艰难梭菌的分离培养,鉴定菌落;提取出菌株DNA,并采用PCR法扩增毒素基因tcdA和tcdB;并对核糖体进行分型研究.结果:100例患者培养阳性率为15.00%,共分离出55株艰难梭菌,产毒株占比83.64%;毒素类型集中为A+B+型,占比54.55%;核糖体分型检测相对优势为R4型占比18.18%;R8型占比21.82%.结论:A+和B+毒素型为主要艰难梭菌型;住院腹泻患者主要为院内感染,核糖体分型未提示暴发流行.
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1例艰难梭菌感染患者粪便移植治疗的护理
总结1例艰难梭菌感染患者实施粪便移植治疗的护理经验。艰难梭菌感染的长期腹泻给患者带来巨大的身心痛苦，实施粪便移植治疗过程中，护士主动做好心理护理，增加患者战胜疾病的信心，消除其心理压力，取得其积极配合；重点做好肛周皮肤护理和消毒隔离，注意补充营养，摄入充足的蛋白质、维生素，以增强机体抵抗力。患者经积极治疗及精心护理后痊愈出院，经过3个月的随访，该患者无腹痛、腹泻情况，大便呈黄色成形软便。
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艰难梭菌毒素B基因克隆和分子生物学特性研究进展
艰难梭菌毒素B是一种细胞毒素,可以引起肠黏膜损害,以往认为毒素B的毒性比毒素A大,但必须通过毒素A才能致病.但近些年来,一些地区爆发了毒素A阴性毒素B阳性的病例,引起了人们对毒素B研究的重视,本文将对重点阐述毒素B基因功能片段克隆及其分子生物学特性的研究概况.
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艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究
背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性.本实验拟研究艰难梭菌 A毒素诱导人肝癌细胞株( SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞( Vero细胞)凋亡的作用. 方法:由脑心浸液对艰难梭菌 VPI 10463菌株培养产毒 , 经甲状腺球蛋白亲合层析和 Q Sephrose层析提纯得到精制 A毒素.对 SMMC7721细胞的研究以 Vero细胞为对照.抑制细胞增殖的检测采用 MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测 DNA碎片.结果:不同浓度 A毒素 (0.293～ 4.690 mg@ L- 1)明显抑制了 SMMC7721及 Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与 A毒素共同培养 48 h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化; SMMC7721细胞与 A毒素共同培养 48 h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带.结论: A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡 ; A毒素对 SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用.
关键词： 艰难梭菌 A毒素 细胞凋亡 SMMC7721细胞 Vero细胞 -
抗生素相关性腹泻患者艰难梭菌的鉴定和敏感药物治疗
目的鉴定所致抗生素相关性腹泻的艰难梭菌并用敏感药物进行治疗.方法新鲜粪便标本在厌氧条件下进行细菌分离鉴定,可疑菌经小鼠毒素致死试验.用K-B法进行药敏试验并用敏感药物进行治疗.结果11例腹泻患者检出艰难梭菌,其检出率为2.9%.该菌对庆大霉素、氟哌酸、黄连素、痢特灵耐药各11株(100%),对甲硝唑、万石霉素、杆菌肽敏感各11株(100%).用敏感药物经2周治疗,11例患者全部治愈.结论细菌鉴定和药敏试验比较实用,对临床选择合理治疗药物提供依据.
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艰难梭茵毒素基因3'末端重复区域基因片段的PCR克隆
目的探寻一种简单、快速、灵敏的检测艰难梭菌的方法.方法以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3'末端高度保守重复区分别设计一对引物,进行PCR反应,同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增,比较二者结果.结果从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3'端重复区域960 bp的基因片段及毒素B基因3'端重复区域1851 bp的基因片段,不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带,并通过测序鉴定;而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现.结论从艰难梭菌毒素A、毒素B基因3'末端重复区域克隆的基因片段具有保守性,可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测,该方法简便、灵敏,可直接用粪便标本进行检测.此外,这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域,可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究.
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艰难梭菌感染患者的临床特征分析
目的：研究艰难梭菌感染患者的临床特征，为临床对此类感染患者的诊断及治疗提供依据。方法回顾性分析感染性腹泻患者的艰难梭菌分离情况以及临床感染特点。结果从291份感染性腹泻标本中分离出33株艰难梭菌，阳性率为10.3％（18／174），其中26株为产A／B毒素菌株（12例患者）。艰难梭菌主要分离自老年男性，均具有严重基础疾病，且使用过质子泵抑制剂和多种广谱抗菌药物；粪便常规和血液学相关指标对艰难梭菌感染及产毒与否具有一定的指示作用。结论严重的艰难梭菌感染患者病死率高，且易引起院内感染的播散，医院可以根据此类患者的临床特征进行规范干预，从而有效地控制院内感染的爆发。
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广州地区艰难梭菌耐药检测与耐药机制分析
目的：了解广州地区腹泻患者中分离的艰难梭菌（ CD）耐药情况及耐药发生的可能机制。方法收集广州3 家医院的腹泻患者粪便标本467 份。PCR 方法直接检测粪便中CD 种特异性tpi 基因，对tpi 基因阳性的粪便标本富集芽孢后，采用厌氧培养法用CCFA 培养基进行CD 的分离培养，然后PCR 鉴定可疑菌株的CD 种特异性tpi 基因；采用Etest 法测定CD 对常用抗菌药物的MIC 值并判定菌株对这些药物的敏感性；对耐药菌株，通过PCR 和基因测序方法检测相关的耐药基因如克林霉素耐药相关基因ermB 及喹诺酮类耐药主要相关DNA 旋转酶基因gyrA 和gyrB 的突变情况。结果 467 份粪便标本共检测出tpi 阳性标本29 份，从中共培养出22 株CD。药敏结果显示，所有菌株对甲硝唑、万古霉素、阿莫西林／克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦均敏感，未检测到对上述5 种抗菌药物耐药和中介的菌株。测试菌对克林霉素、青霉素、莫西沙星的耐药率分别是90畅9％（20／22）、27畅3％（6／22）和13畅6％（3／22）。所有耐药菌株中，有2 株同时对克林霉素、莫西沙星、青霉素耐药。20 株对克林霉素耐药的CD 中，有40％（8／20）的菌株ermB 基因阳性，3 株莫西沙星耐药菌株中均检出gyrA、gyrB 基因发生突变。结论 广州地区CD 对临床常用抗菌药物耐药率不高，但对克林霉素有较高的耐药率，ermB 基因的存在是CD 对克林霉素耐药的原因之一，而gyrA、gyrB 基因的突变与CD 对喹诺酮类耐药有关。另外，已出现同时耐3种抗菌药物的多重耐药CD 菌株。
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艰难梭菌毒素A羧基端基因原核表达载体的构建及生物信息学分析
目的构建表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因的原核表达载体.方法PCR扩增艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因(CDTAR),并将其克隆到表达载体pET-22b(+),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),重组载体经EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切鉴定及测序进行分析,并以生物信息学软件分析其生物活性.结果构建了含CDTAR的重组质粒pET-CDTAR,生物信息学分析示该序列具有良好的抗原性及疏水性.结论艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因原核表达载体的构建为艰难梭菌疫苗的研究奠定了基础.
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重型颅脑损伤患者感染艰难梭菌1例
患者，男，58岁，2013年4月18日因脑外伤后意识障碍16 d平车入院。2013年4月2日晚上患者发生车祸，送往当地市人民医院，治疗方案包括脱水降颅压，营养脑神经、维持水电解质、抗感染等治疗。4月18日为求进一步治疗来我院，门诊拟“重症颅脑损伤”收入院。入院时体格检查：体温36.7℃，脉搏71次／min，呼吸18次／min，体重67 kg，发育正常，精神状态差，强迫仰卧位。起病以来，患者呈昏睡状，通过鼻胃管进食，大便未解，小便正常；患者家属主诉一直长期使用抗生素预防肺部感染和泌尿系统感染，主要是头孢类抗生素。4月26日患者出现腹泻，大便次数多，恶臭，血常规：白细胞计数24.34×109· L-1，淋巴细胞百分比11.3％，中性粒细胞百分比84.2％；降钙素原0.11μg／L。5月2日患者开始出现发热，体温37.2～39.2℃，大便次数多，多达10余次，主要为棕褐色水样大便，量大，恶臭、腹胀。实验室检查：血常规：白细胞计数32.76×109· L-1，淋巴细胞百分比5.0％，中性粒细胞百分比90.9％；血沉53 mm／h，降钙素原7.24μg／L；病原学检查：采集患者腹泻粪便标本1份，先利用传统的方法检测常见的细菌：沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、气单胞菌、弯曲菌等，再用胶体金检测病毒包括腺病毒40／41型、轮状病毒A型。后用化学发光法检测艰难梭菌毒素A抗原和（或）B抗原为阳性，同时将粪便标本用70℃金属锅加热20 min然后接种厌氧平板进行厌氧培养，48 h观察结果，挑取疑似菌落涂片为革兰阳性芽孢杆菌，用质谱仪鉴定为艰难梭菌，将可疑菌落纯培养24 h后再用化学发光法重新测定强阳性。治疗：4月26日至5月1日期间口服蒙脱石散剂3.0 g／次，3次／d；盐酸洛哌丁胺胶囊4.0 mg／次，1次／d；疗效欠佳。随后静脉滴注头孢曲松2.0 g／次，2次／d；哌拉西林／他唑巴坦4.5 g／次，3次／d；血浆300 mL／次，1次／d和25％人血白蛋白12.5 g／次，1次／d等进行腹泻治疗，疗效极差；在5月14日培养出艰难梭菌及艰难梭菌毒素阳性后立即停止所有药物的使用，口服甲硝唑0.4 g／次，3次／d，并继续静脉滴注血浆300 mL／次，1次／d和25％人血白蛋白12.5 g／次，1次／d。第2天体温下降，偶有低热，但无需治疗即可自行调为正常；第3天腹泻明显好转，继续静脉滴注血浆300 mL和25％人血白蛋白12.5 g，增强营养和抵抗力。5月23日使用开塞露40 mL 后解条形大便，因脑部损伤继续住院治疗。
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艰难梭菌性肠炎21例
近年来大量的临床和实验研究证明抗生素诱发的肠炎大多数因艰难梭菌(简称CD)在肠道内过度生长，产生毒素所致［1］。1994～1997年，对我院183例腹泻患者的粪便作CD检查，结果21例阳性，现报道如下。1 资料与方法1.1 一般资料男17例，女4例。除6例先天性巨结肠症患者为3～7岁外，其余15例年龄为58～87岁。1.2 原发病 21例CD性肠炎患者的原发病为：胃癌3例，结肠癌5例，先天性巨结肠症手术6例，胆道手术1例，其他手术1例，肝硬化1例，慢性粒性白血病2例，糖尿病1例，下消化道出血1例。
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艰难梭菌和炎症性肠病相关性研究进展
艰难梭菌是一种革兰染色阳性的厌氧杆菌,是人类肠道中的定植菌群之一.当患者肠道菌群失调,艰难梭菌过度生长并且释放毒素时,便引起艰难梭菌感染(clostridium difficile infection,CDI)相关疾病,是抗生素相关性腹泻病原体[1]. 多来越多的报道显示,在全世界范围内,艰难梭菌感染的发生率和严重性都有急剧增加. 随着CDI的发病率越来越高,在炎症性肠病(IBD)患者中,CDI拥有更高的发病率. 本文主要总结IBD的流行病学、危险因素、诊断、治疗的新数据,阐述IBD与CDI的相关性.
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质子泵抑制剂与艰难梭菌院内感染关系的研究进展
艰难梭菌的感染率在世界范围内持续升高,其医院内感染的发病率和死亡率也明显增加,造成大量的医疗支出.质子泵抑制剂(PPI)在临床上有着广泛的使用,但近的研究发现,PPI的使用与艰难梭菌的院内感染有着一定的相关性.本文就PPI与艰难梭菌院内感染的关系以及可能的机制进行综述,以期为临床PPI的规范化使用提供一定的参考.
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亚MIC剂量的抗生素对艰难梭菌tcdC、tcdE、tcdR转录的影响
目的 亚小抑菌浓度(MIC)剂量的某些抗生素能够诱导和促进艰难梭菌毒力编码基因及其毒素的表达,但具体机制不明.本文从艰难梭菌的毒力调控基因(tcdC、tcdE、tcdR)着手来试图解释亚MIC剂量的抗生素对艰难梭菌毒力编码基因和毒素的影响.方法 中国株艰难梭菌BJ08分别生长在含有1/2 MIC剂量的克雷霉素或头孢噻肟或无抗生素的脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基中.每4h,取一定量的艰难梭菌,通过实时荧光定量PCR检测其毒力调控基因(tcdC、tcdE、tcdR)mRNA的表达.结果 BJ08在1/2 MIC剂量的克雷霉素存在的情况下,对毒力调控基因mRNA表达的影响不大;但是在1/2 MIC剂量的头孢噻肟存在的情况下,tcdCmRNA的表达在培养早期和中期低于对照组,tcdE和tcdR的表达比起对照组都增高且提前,但两者增加幅度不同,高峰期也不同.结论 在某些亚MIC剂量的抗生素存在的情况下,艰难梭菌毒力编码基因和毒素表达的变化可能是通过调节调控基因而实现的.
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克雷霉素、头孢噻肟对艰难梭菌毒素转录和表达的影响
目的 研究1/2小抑菌浓度(MIC)剂量的克雷霉素和头孢噻肟对中国艰难梭菌A-B+高分离株BJ08的生长、毒力基因转录和毒素分泌的影响.方法 BJ08菌株分别生长在含有1/2 MIC的克雷霉素或头孢噻肟以及无抗生素的脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基中.每4个小时,通过检测其OD值以确定其生长曲线；通过实时荧光定量PCR检测其毒力基因的表达；通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清和细胞内B毒素的表达.结果 BJ08在1/2 MIC剂量的克雷霉素存在的情况下,菌株的生长和毒素表达几乎不受影响；但是在1/2 MIC剂量的头孢噻肟存在的情况下,菌株生长变慢,到达对数期的时间延迟；毒力基因和B毒素的表达提前且增加.结论 实验证明:在亚MIC剂量的不同的抗生素存在的情况下对中国株A-B+艰难梭菌的生长和毒力基因表达影响不同.我们的研究对于临床医师规范治疗CDAD和合理应用抗生素有一定的参考价值.
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住院腹泻患儿粪便艰难梭菌毒素检测与分析
目的 对住院腹泻患儿的粪便标本进行艰难梭菌毒素筛查,以了解患儿艰难梭菌的感染情况,为院内感染的防控提供基础数据.方法 采用VIDAS艰难梭菌A&B毒素(CDAB)检测试剂对2013年6月～11月收集的146例住院腹泻患儿粪便标本进行毒素检测,并结合其他实验室检测结果及临床资料进行综合分析.结果 146例患儿中有10例检出CDAB,阳性率6.8％.10例CDAB阳性患儿均使用过美洛西林/舒巴坦、头孢他啶、头孢克洛等抗生素,占抗生素相关性腹泻患者(56例)的17.9％.结论 住院患儿艰难梭菌相关性腹泻感染率较高,抗菌药物的使用是诱使艰难梭菌感染的重要因素,年幼体弱的儿童更容易感染艰难梭菌.
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溃疡性结肠炎患者粪便中艰难梭菌毒素基因A/B携带情况的研究
目的 检测溃疡性结肠炎(UC)患者和健康体检者粪便标本中艰难梭菌毒素基因A/B携带情况,探讨艰难梭菌毒素基因携带情况与UC之间的关系.方法 收集53例UC确诊患者(活动期32例,静止期21例)和45例健康体检者的粪便标本,提取粪便总DNA,采用荧光定量PCR方法 分别检测粪便中艰难梭菌毒素A(cdtA)基因及艰难梭菌毒素B(cdtB)基因,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,并对扩增产物进行测序验证.结果 UC组共检出7例cdtA、4例cdtB,其中UC活动期组5例cdtA、2例cdtB;静止期组2例cdtA、2例cdtB;健康对照组共检出5例cdtA、2例cdtB.UC组cdtA和cdtB检出率与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);活动期组cdtA和cdtB检出率与静止期组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 粪便中cdtA/B的携带情况与UC发病、疾病分期无明显相关性.
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艰难梭菌实验室不同检测方法的比较
目的 比较不同方法检测艰难梭菌(CD)的临床可行性.方法 选取2016年疑似抗菌药物相关腹泻患者大便标本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和鉴定培养基培养法进行检测,比较两种检测方法的灵敏性、特异性和一致性.结果 ELISA检出抗原阳性标本29例,其中毒素阳性25例,毒素阴性4例;鉴定培养基培养法检出可疑菌株29例,经质谱仪鉴定,其结果为CD28例,1例未检出种属;ELISA和鉴定培养基培养法的灵敏度和特异度分别为97%、100%和93%、95%,两者有极好的一致性(Kappa=0.92).结论 ELISA具有快速、高效、省时、操作简单、判读容易等特点,可快速准确地筛检CD相关性腹泻病患;培养基培养法特异性好,可以快速得到感染株;二者联合使用可大大提高CD检出率,并对后期治疗有很大帮助.
