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RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展
RNA干扰（ RNAi）技术是利用双链 RNA，高效、特异性降解细胞内同源信使 RNA，从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。与反义寡聚核苷酸技术相比，RNAi技术具有更高的特异性，是更有效的方法。目前，RNAi技术是肿瘤基因治疗领域的一个热点技术，它抑制癌基因表达及肿瘤血管生成，沉默细胞凋亡相关基因、肿瘤转移相关基因及肿瘤耐药相关基因，在肿瘤基因治疗领域显示出广阔的应用前景。
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RNA干扰抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原基因的表达*
目的：利用RNA干扰技术（RNAi）下调肌腱细胞中V型胶原蛋白的表达，拟为后续探讨V型胶原在损伤肌腱修复过程中的作用提供可行的试验方法。方法：分别设计干扰大鼠V型胶原[COL5（1）2（2）]两个亚基COL51和COL52表达的siRNA序列，转染大鼠肌腱细胞。通过实时荧光定量PCR和免疫荧光法检测V型胶原在基因和蛋白水平的表达。结果：转染特定的siRNA后，V型胶原两个亚基的基因表达被抑制约70%，蛋白表达也被明显抑制。结论：RNAi法可有效地抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原的基因和蛋白水平表达。为进一步研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的作用提供了可行的试验方法。
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RNA干扰对Survivin基因抑制效应的测定
目的：利用RNAi技术沉默Survivin基因对其抑制效应进行测定。方法应用RNAi技术，以Survivin-siRNA重组质粒为载体，通过RT-PCR和Western-blot法检测Survivin基因的表达。结果 Survivin 基因的表达明显低于对照组，达到抑制效果；采用Western blot检测Survivin在基因表达水平上的抑制作用，同样达到了抑制效果。结论利用RNA干扰技术沉默Survivin基因抑制细胞生长，促进凋亡。表明Survivin基因参与了信号转导，有望成为基因治疗的新靶点。
关键词： Survivin基因 抑制效应 RNA干扰技术 -
RNA干扰技术的临床应用需要更多的安全性研究
看到关于RNA干扰(RNAi)技术的一期和二期临床试验的文章发表,是一件令人兴奋的事.RNA干扰是一种可以选择性地(序列特异性地)使目标基因沉默的技术.已经发表的临床试验文章是关于将该技术应用于治疗人类的少数几种疾病的,虽然有人相信该技术有被用于成千上万种疾病的潜力.对于4种潜在RNAi产品进行的6项临床试验的文章的发表,象征着这种迷人的基因沉默技术已经距临床应用很近了,从而很快将给临床医师提供与诸如恶性肿瘤、病毒感染、某些年龄相关性变性性疾病,以及可能许许多多与基因的突变或过度表达相关疾病的战斗中可用的崭新武器.本篇评论旨在根据国际医学期刊上发表的文献了解RNAi技术安全性研究方面的概况,包括在临床和动物实验研究中对安全性问题的研究情况,并对将此技术安全应用于人类作出一些建议.
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矽肺纤维化发展过程中差异基因MMP-12功能的实验研究
目的 构建基质金属蛋白酶-12(MMP-12)基因小干扰RNA片段(siRNA)表达质粒,探讨MMP-12基因在矽肺纤维化发展过程中的功能.方法 利用RNA干扰技术,将构建的MMP-12-siRNA表达质粒转染大鼠肺成纤维细胞(FB),筛选出佳干扰基因序列.实验分为3组:对照组(C),加未经SiO2粉尘刺激的肺泡巨噬细胞(AM)培养上清液;SiO2刺激组(S),加经SiO2粉尘刺激的AM培养上清液;转染组(T),首先将筛选出的含佳干扰基因序列的质粒转染FB,基因沉默后,再加经SiO2粉尘刺激的AM培养上清液.运用免疫细胞化学法检测各组中Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的表达情况.结果 经条件上清培养液刺激后,S组FB中各时段Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原表达均比C组增加,S组Ⅰ型胶原蛋白为0.360 8±0.006 9～0.694 3±0.007 3,C组为Q.240 9±0.005 8～0.257 8±0.009 0,差异均有统计学意义;Ⅲ型胶原蛋白为0.198 9±0.027 8～0.412 9±0.010 8,差异亦均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);T组FB中Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的表达均比S组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 利用RNA干扰技术将MMP-12-siRNA表达质粒转染FB,可沉默MMP-12基因的表达,并可减少Ⅰ及Ⅲ型胶原蛋白的沉积,证实MMP-12基因在矽肺纤维化的发展中起重要作用.
关键词： 矽肺纤维化 成纤维细胞 基质金属蛋白酶-12 RNA干扰技术 胶原 -
小干扰RNA技术治疗自身免疫性疾病应用展望
自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应,导致自身组织受损而引起的疾病,可累及全身各个系统,临床表现多种多样.RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是指利用小干扰RNA(small interfering,RNA,siRNA)沉默致病基因表达的技术.RNAi现象在生物中普遍存在,由于RNAi技术具有高效性、特异性、位置效应、竞争效应和可传播性等特点,因此越来越多的研究人员将RNAi技术应用于多种研究领域中,如基因功能研究、基因治疗、开发新药,以及病毒感染、遗传性疾病和恶性肿瘤的治疗等.因此,siRNA技术将会成为治疗AID的新途径.
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RNA干扰沉默信号转导及转录激活因子1与支气管哮喘
RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性转录后的基因沉默现象,是生物界一种古老而进化上高度保守的基因表达调节机制.随着分子生物学理论与技术研究的不断深入,近几年利用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因表达而防治疾病成为医学界研究的热点.信号转导及转录激活因子1(signal transdnction and activator of transcription-1,STAT1)是一种能被多种配体激活而使相关免疫应答基因表达的转录因子.STAT1的激活可诱发支气管哮喘气道的炎症和气道高反应性.利用RNAi技术沉默STAT1基因表达,阻止气道变应性炎症反应,对防治支气管哮喘的发生发展具有重要的临床意义.
关键词： RNA干扰 RNA干扰技术 信号转导及转录激活因子1 支气管哮喘 -
RNA干扰技术及其在口腔肿瘤研究中的进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)首先由Fire等[1]提出,为双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的细胞内序列特异性转录后基因沉默过程,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制.RNAi技术现已广泛应用于逆基因分析和基因治疗等领域,并日益成为口腔肿瘤患者分子病因和基因治疗研究的重要工具.
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RNAi抑制内源性基因表达在肝脏疾病研究中的应用
RNA干扰(RNA interference, RNAi ),即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing PTGS ).
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RNAi技术及抗HBV治疗研究进展
RNA干扰(RNA interference , RNAi )是由21个～23个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象,是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制.利用RNAi技术的高效性和特异性抵御病毒感染及其它外源性核酸入侵的研究,已取得了很大进展,针对乙肝病毒感染这一全球性的健康问题,RNAi有着广泛的应用前景.
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矽肺大鼠肺纤维化发展过程中差异基因PAI-1功能的实验研究
目的 构建纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)基因小干扰RNA片段(siRNA)表达质粒,探讨PAI-1基因在矽肺纤维化发病中的功能.方法 利用RNA干扰技术,将构建的PAI-1-siRNA表达质粒转染大鼠肺成纤维细胞(FB),筛选佳干扰序列.实验分3组:对照组(C),加入未经二氧化硅( SiO2)粉尘刺激的肺泡巨噬细胞(AM)培养上清；SiO2刺激组(S),加入经SiO2粉尘刺激的AM培养上清；转染组(T),先将筛选出佳干扰序列的质粒转染FB,再加入经SiO2粉尘刺激的AM培养上清.用免疫细胞化学法检测各组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达.结果 经条件上清刺激后,S组与C组比较,FB中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加(P＜0.05或P＜0.01)；T组与S组比较,FB中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达明显下降(P＜0.01).结论 通过RNA干扰技术将PAI-1-siRNA表达质粒转染FB,可使PAI-1基因沉默,且可减少细胞外基质的沉积,提示PAI-1基因与矽肺纤维化的发生、发展密切相关.
关键词： 成纤维细胞 纤溶酶原激活物抑制因子-1 RNA干扰技术 胶原 -
RNA干扰技术及其临床应用与进展
基因沉默是广泛存在于生物界的古老现象,是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制,广泛存在于真核生物细胞中.通常基因沉默发生在两种水平上:①由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应引起转录水平上的基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS);2在基因转录后水平上通过对目的RNA特异性降解而使基因失活的转录后基因沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS).RNA干扰 (RNA interference,RNAi)即属于转录后水平的基因沉默.随着近年来对RNA干扰机制和功能的深入研究,RNA干扰技术在人类多种疾病的治疗方面显示出了良好的应用前景.本文就RNA干扰技术及其临床应用现状和进展做一综述.
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神经胶质瘤基因治疗新位点的应用
RNA干扰(RNAi)是一种新发现的通过dsRNA介导的特异同源靶基因途径[1].自从1998年发现以来[2],就以其独特的优势在功能基因组学研究中迅速占有一席之地,迄今已成为基因研究中不可或缺的工具之一,并且随着对其作用机制的逐步了解和应用技术的日渐成熟,已开始应用于疾病防治等多个方面,同时RNAi技术的出现为胶质瘤基冈治疗的研究提供了新的策略.
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DJ-1基因siRNA对三阴性乳腺癌细胞侵袭和迁移影响的研究
目的:探讨D J-1基因siRNA对三阴性乳腺癌细胞体外侵袭和迁移能力的影响.方法:设计DJ-1基因的小分子干扰RNA(siRNA)片段,脂质体介导转染入三阴性乳腺癌细胞株MAD-MB-231,转染分3个组:A组(空白对照control组)、B组(转染非特异性对照Scramble组)、C组(转染si DJ-1组).应用Western blotting免疫印迹法检测转染前后DJ-1表达水平;运用细胞迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化.结果:C组D J-1蛋白的表达强度弱于A组和B组(t=9.831,P＜0.05),而A组与B组比较,D J-1蛋白表达水平则无明显差异(t=1.629,P＞0.05).细胞迁移实验中,A组细胞为(218.37± 12.75);B组的细胞为(214.46±11.38);C组的细胞为(129.65±8.59),C组细胞明显少于A组和B组(t=10.927,9.984,P＜0.05),而A组与B组之间,差异无统计学意义(t=0.512,P＞0.05).细胞侵袭实验中,A组细胞为(127.28± 12.65);B组的细胞为(123.06± 13.08);C组的细胞为(52.85±9.58),C组穿过人工基底膜的细胞明显少于A组和B组(t=7.927,8.643,P＜0.05),而A组与B组之间,差异无统计学意义(t=0.627,P＞0.05).结论:DJ-1基因siRNA可抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭和迁移.
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RNA干扰技术在胰腺癌基因治疗中的应用
RNA干扰(RNAi)是双链RNA(dsRNA)介导的、由特异性引起的转录后基因沉默现象. RNA干扰技术作为基因沉默的有效手段,在肿瘤治疗方面显示出良好的前景.现就RNA干扰的机制、双链RNA的设计、小干扰RNA(siRNA)的制备方法和RNA干扰技术在胰腺癌治疗研究中的应用进展作一综述.
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RNA干扰YAP基因对人膀胱癌T24细胞株增殖和迁移能力的影响
背景与目的：膀胱尿路上皮癌是泌尿统系常见的肿瘤，术后易复发及转移，Yes相关蛋白(Yes associated protein，YAP)基因与膀胱癌关系密切，本研究探讨通过RNA干扰技术沉默膀胱癌T24细胞中YAP基因的表达，观察YAP基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、迁移能力的影响。方法：用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中，采用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain reaction， qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后T24细胞中YAP基因及蛋白的表达水平，细胞增殖活性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)、Transwell迁移试验以及划痕实验观察siRNA在体外对人膀胱癌T24细胞增殖、迁移能力的影响。结果：转染siRNA后，YAP RNA和蛋白表达量同空白对照以及阴性对照组相比被显著抑制(RNA：F=93.91，P＜0.0001；蛋白：F=4.62，P＜0.05)，CCK-8增殖活性实验结果显示，RNAi干扰YAP表达可以显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(12 h：F=6.00，P=0.037；24 h：F=41.72，P=0.0003；36 h：F=462.8，P＜0.0001；48 h：F=236.6，P＜0.0001；72 h：F=140.5，P＜0.0001)，通过Transwell实验和划痕试验发现，RNAi干扰YAP表达显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(Transwell：F=43.55，P＜0.05；划痕：F=43.55，P＜0.05)。结论：YAP基因是膀胱肿瘤增殖及迁移的重要调控因子。
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siRNA干扰鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1的表达抑制黑素瘤细胞增殖
目的:研究siRNA干扰鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)的表达对小鼠黑素瘤B16-F1细胞增殖的影响.方法:构建OAZI-1特异性siRNA表达质粒psilencer2.1-U6/OAZI-I及对照psilencer2.1-U6/scrambled质粒,脂质体转染法将质粒转染入B16-F1细胞,Western blotting和定量PCR检测B16-F1细胞中OAZI-1的表达.MTT法和流式细胞术检测psilencer2.1-U6/OAZI-1对B16-F1细胞增殖和细胞周期的影响；MTT法检测干扰OAZI-1表达后B16-F1细胞对抗肿瘤药物紫杉醇(docetaxel)的敏感性.结果:成功获得稳定转染psilencer2.1-U6/OAZI-1质粒的B16-F1细胞(B16/OAZI-1细胞),B16/OAZI-1细胞中OAZI-1 mRNA和蛋白表达分别为阴性对照B16/scrambled细胞的25.0％和18.9％.干扰OAZI-1的表达抑制B16-F1细胞的增殖,G0/G1期细胞比例增加[(57.0±0.8)％ vs (63.5±0.7)％,P＜0.01],而S期和G2/M期细胞比例减少[(31.5±0.7)％ vs (27.5±0.3)％,P＜0.05；(11.5±0.3)％ vs (9.1±0.6)％,P＜0.01].干扰OAZI-1的表达能降低B16-F1细胞对紫杉醇的敏感性.结论:siRNA干扰OAZI-1的表达能抑制黑素瘤B16-F1细胞的增殖,并降低其对紫杉醇的敏感性.
关键词： 鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1 RNA干扰技术 黑素瘤细胞 -
稳定转染重组信号转导及转录激活因子3对喉癌Hep-2细胞侵袭性的影响
目的 应用RNA干扰技术沉默信号转导及转录激活因子3(STAT3)后,观察对喉鳞状细胞癌2(Hep-2)黏附、迁移、侵袭能力的影响及细胞内细胞黏附分子1(ICAM-1)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的改变,探讨STAT3作用于喉癌的可能侵袭机制.方法 在前期试验筛选出稳定表达siRNA-STAT3的Hep-2细胞系的基础上,应用MTT比色法、划痕法、Transwell法,分别检测其黏附力、迁移力及侵袭力的变化；Western印迹法检测细胞ICAM-1和VEGF蛋白的表达.以siRNA-shNC组和空白组作为对照.结果 ①接种20 min后,各组细胞的黏附率差异不大(P=0.886)；40 min后,siRNA-STAT3组的黏附率小于siRNA-shNC组和空白对照组(P =0.02)；60 min后,黏附抑制效应更加明显(P=0.012).②接种48 h后,空白对照组和siRNA-shNC组的Hep-2细胞向划痕区生长速度明显快于siRNA-STAT3组.③接种24 h后,200倍光学显微镜下显示:siRNA-STAT3组穿过Matrigel基质和滤膜的细胞数明显少于空白对照组和siRNA-shNC组.④Western印迹法结果显示:siRNA-STAT3组ICAM-1和VEGF蛋白的表达量低于siRNA-shNC组和空白对照组.结论 稳定转染重组STAT3基因能显著抑制喉癌Hep-2细胞的黏附、迁移及侵袭能力.STAT3在喉癌的侵袭中起着重要的作用,可能与其调控ICAM-1和VEGF蛋白的表达有关.
关键词： 喉癌 稳定转染 RNA干扰技术 信号转导及转录激活因子3 细胞侵袭 -
针对 MAG,OMgp,NogoA 基因的 scFv (OMgp)-9R-siRNA 复合物的制备和鉴定
目的 运用抗体靶向技术联合siRNA形成双特异性复合物scFv-9R-siRNA的高效递送系统,该系统通过抗OMgp的scFv把MAG,OMgp和Nogo A的特异性siRNA特异性运输至受损神经细胞,从而抑制这三种轴突抑制物的表达,改善脊髓损伤后的局部微环境,阻断这些髓磷脂相关抑制物对轴突再生的抑制作用,为后续的大鼠模型试验奠定基础.方法 (1)根据基因重组技术,利用制备好的高效抗OMgp单克隆抗体构建单链抗体scFv(OMgp),并在此基础上非共价合成针对MAG,OMgp,NogoA基因的scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物;(2)体外鉴定scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物效果:鉴定MAG,OMgp,NogoA三种抑制物的mRNA和蛋白表达水平,同时与非神经细胞对比,研究引入scFv后所产生的靶细胞特异性.结果 (1)成功制备抗大鼠OMgp单克隆抗体E811,并通过ELISA和Western blot对已制备的抗大鼠OMgp单克隆抗体E811进行了特异性和敏感性鉴定,在此基础上成功获得scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物;(2)体外实验证实:scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物同时特异性下调MAG,OMgp和Nogo A基因表达.结论 单链抗体技术(scFv)解决了siRNA的特异性导入受损神经元问题,为体内应用siRNA技术治疗脊髓损伤奠定了基础.
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SiRNA技术在胰腺癌研究中的应用
近年来,胰腺癌的分子遗传学和分子病理学研究取得了突破性进展,胰腺癌的发生涉及到多种癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、细胞粘附因子及DNA修复基因等的异常和积累,基因治疗有可能成为胰腺癌治疗的发展方向.
