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靶向沉默c-fos基因表达对胶质瘤U87MG细胞增殖与侵袭的影响
目的 探讨靶向沉默c-fos基因表达对胶质瘤U87MG细胞体外增殖与侵袭的影响.方法 构建慢病毒载体c-fos-shRNA,将其转染人脑胶质瘤U87MG细胞,同时将空载体转染细胞作为空载对照,未转染细胞作为空白对照;观察U87MG细胞形态、c-fos mRNA和蛋白表达变化、细胞侵袭和迁移能力、细胞生存率和细胞凋亡率.结果 c-fos-shRNA慢病毒转染U87MG细胞48 h后,荧光显微镜下观察发现空白对照组U87MG细胞无绿色荧光,而空载体组和转染组U87MG细胞可见绿色强荧光和清晰的细胞轮廓.与空白对照组、空载体组相比,转染组U87MG细胞c-fos mRNA和c-fos蛋白表达显著降低(P＜0.05);慢病毒转染U87MG细胞24 h后,转染组U87MG细胞存活率显著降低(P＜0.05),细胞活力显著减弱(P＜0.05);细胞迁移和侵袭能力明显减弱(P＜0.05);慢病毒转染72 h后,转染组U87MG细胞凋亡数量显著上升(P＜0.05).结论 沉默c-fos基因表达可显著抑制脑胶质瘤U87MG细胞增殖和侵袭能力.
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PPARγ基因沉默对高糖致伤血管内皮细胞增殖活性的影响
目的:构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因沉默的高糖致伤血管内皮细胞株并研究其增殖活性.方法:应用RNA干扰技术沉默PPARγ基因的表达,用高糖培养基持续培养致伤人脐静脉内皮细胞(HU-VEC),采用细胞连续生长计数及MTT比色法测定细胞增殖活性.结果:获得PPARγ沉默的HUVEC细胞株,相对表达量仅有出发细胞的23.56％;复制了高糖致伤模型,其SA-β3-半乳糖苷酶明显增高(P＜0.01),而NO水平明显下降(P＜0.01).与未经高糖处理的PPARγ基因沉默HUVEC相比,高糖致伤的PPARγ基因沉默组细胞增殖活性明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了PPARγ基因沉默的高糖致伤血管内皮细胞株,并提示PPARγ表达下调明显影响了高糖致伤HUVEC细胞的分裂增殖能力,这对进一步研究PPARγ在糖尿病合并急性冠状动脉综合征中的作用机制有重要意义.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 人脐静脉内皮细胞 RNA干扰技术 细胞增殖 葡萄糖 -
RNA干扰技术分子机制的研究新进展
RNA干扰是一种基因沉默技术.目前,它在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面已显示出广阔前景.与此同时,RNA干扰分子机制的研究也取得了飞速发展,包括对转录水平、转录后水平、翻译水平、基因甲基化等层次的研究.清晰阐述RNA干扰的作用机制将为大规模基因系统筛查、新基因的发现、人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理论依据和有力工具.
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RNA干扰技术在肝癌治疗领域的应用新进展
在全球范围内,肝癌是第5大常见的恶性肿瘤,也是导致人类死亡的主要因素之一.目前,几乎没有针对肝癌的有效治疗手段.因此,发展一种新手段意义重大.RNA干扰技术(RNA interfence,RNAi)作为一种基因沉默技术,能高效且特异地抑制相关基因的表达,为肝癌的基因治疗提供了新的手段和希望.对近几年RNAi技术在肝癌领域的应用进行综述.
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RNA干扰技术在眼科疾病中的应用效果
目的:探讨RNA干扰技术(RNAi)在眼科疾病中的临床应用效果.方法:回顾性分析我院2009年6月至2011年3月眼科收治的56例患者的临床资料.结果:治疗2周后,所有患者均临床治愈出院,无其他不良反应发生.治疗后随访3个月,所有患者无术后并发症发生.结论:RNA干扰技术是一种有效地治疗眼科疾病的方法,值得临床广泛推广和应用.
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dsRNA和RNA干扰技术
dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰.其机的阐明使它有可能在基因敲除,基因功能测定等方面成为一项成熟的技术,这将在生命科学领域中引起深刻变化.本文就dsRNA和RNA干扰的关系,RNA干扰的机制和特点,RNA干扰技术的应用前景等作一综述.
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RNA干扰技术沉默脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因对脂肪细胞合成甘油三酯及分泌内脂素的影响
目的 观察RNA干扰技术沉默脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因后,脂肪细胞甘油三酯合成及内脂素分泌的变化.方法 将3T3-L1前脂肪细胞采用体外诱导分化为脂肪细胞,将脂肪细胞与0～1 mmol/L不同浓度脂肪酸共孵育后,测定其甘油三酯及内脂素的浓度.构建针对脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因的微小RNA质粒表达载体,将上述载体转染3T3-L1脂肪细胞,用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因及蛋白的表达,将0.5 mmol/L脂肪酸与沉默前后的脂肪细胞共孵育24h,用逆转录聚合酶链反应检测脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因沉默前后脂肪细胞内脂素mRNA表达的变化,并测定其甘油三酯及内脂素浓度的变化.结果 随着脂肪酸浓度的增高,与其共孵育的脂肪细胞内甘油三酯浓度也随着增加(P＜0.05),其分泌的内脂素浓度也随着增加(P＜0.05)；构建脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白微小RNA质粒载体,转染脂肪细胞后,能显著抑制脂肪细胞内脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)；沉默脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因后脂肪细胞内甘油三酯浓度明显低于沉默前(P＜0.05),其分泌的内脂素浓度也明显低于沉默前(P＜0.05).结论 经RNA干扰技术沉默脂肪细胞内脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因能明显降低脂肪细胞甘油三酯的合成及内脂素的分泌.
关键词： 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白 RNA干扰技术 甘油三酯 内脂素 -
沉默PMR1表达促进胰岛细胞分泌胰岛素的研究
目的 利用RNA干扰技术(RNAi)研究体外合成的siRNA分子对高尔基体膜上钙离子ATP酶1(plasma membrane-related Ca~(2+)ATPase-1,PMR1)的基因沉默作用,并探讨沉默后对胰岛细胞分泌胰岛素的影响.方法 委托公司合成抗PMR1基因的siPMR1,用脂质体方法介导siPMR1转染胰岛NIT-1细胞,采用RT-PCR法观察siPMR1转染前后胰岛细胞中PMR1 mRNA的表达变化,并用放射免疫分析法测定胰岛细胞分泌的胰岛素浓度.结果 siPMR1转染胰岛NIT-1细胞后能明显抑制PMR1 mRNA表达,siPMR1转染的胰岛NIT-1细胞能显著增加胰岛素分泌量.结论 siPMR1 可明显沉默PMR1基因表达,并促进胰岛细胞分泌胰岛素,为用RNAi技术沉默PMR1靶点治疗糖尿病提供了理论基础.
关键词： 膜上钙离子ATP酶1 siRNA RNA干扰技术 胰岛素 -
纳米粒载体在小RNA干扰技术中的研究进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是大多数真核生物体内一种调控基因表达的方式,主要通过siRNA特异性地沉默靶基因的表达,具有高效性、特异性等的优点,已被广泛应用于基因功能、细胞信号转导通路、药物靶点的筛选、基因治疗的等研究领域[1-3].
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RNA 干扰技术抑制人肝癌细胞 POLD1基因表达的研究
目的：应用RNA干扰技术抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的表达，探索该技术干预肝癌的可行性。方法制备4个针对人POLD1基因的shRNA表达质粒，转染SMMC-7721细胞48 h后，荧光定量PCR法检测POLD1基因的表达，CCK-8检测细胞生长情况。结果测序鉴定证实4个shRNA表达质粒构建成功，将其转染SMMC-7721细胞后，NEO-POLD1-1和NEO-POLD1-4表达质粒抑制效果明显，使SMMC-7721细胞的增殖受到抑制，并且使POLD1基因表达在mRNA水平抑制，NEO-POLD1-1相对表达量为（0．1425±0．0205）， NEO-POLD1-4相对表达量为（0．209±0．009）。结论针对POLD1基因设计的shRNA在体外有效地抑制了POLD1基因mRNA的表达和肝癌细胞的增殖，且实现RNA干扰具有序列选择性。
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锌指蛋白A20对人单核细胞LPS应答的影响
目的 调查锌指蛋白A20表达对人单核细胞LPS应答的影响,探讨A20可能的炎症调控作用与机制及其潜在的临床应用价值.方法 采用细胞转染技术制备锌指蛋白A20人单核细胞转基因细胞模型和基因沉默细胞模型,以LPS攻击细胞,用适时荧光定量PCR技术测定锌指蛋白A20表达水平,用ELISA技术分析细胞核转录因子NF-κB活性及其依赖性炎性细胞因子TNF-α水平. 结果 锌指蛋白A20过表达组细胞遭受LPS攻击后其NF-κB活性和TNF-α水平明显低于LPS对照组(P＜0.01),锌指蛋白A20基因表达抑制组细胞其NF-κB活性和TNF-α水平明显高于LPS对照组(P＜0.01).结论 锌指蛋白A20对人单核细胞LPS应答具有明显的调节作用,可以明显降低炎症重要核转录因子活性和降低促炎细胞因子的表达.对脓毒症过度炎症反应实施干预具有潜在的临床应用价值.
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RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究现状
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),高效、特异性降解细胞内同源信使RNA(messenger RNA,mRNA),从而阻断特定基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型.1998年Fire等[1]首次应用RNAi技术将dsRNA正义链与反义链的混合物注入线虫体内,结果发现注入dsRNA比单独注入单链RNA引起的基因沉默要强得多,并可导致子一代同源基因的沉默.
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核干细胞因子的RNA干扰对胶质瘤U251细胞的影响
目的 探讨U251细胞株中NS基因表达及被干扰后,U251细胞株在mRNA、蛋白表达水平及细胞增殖变化情况.方法 考察U251细胞NS-mRNA和NS-protein的表达水平；合成人类NS基因siRNA片段；转染至U251细胞中,RTPCR和Western blot检测转染前后U251细胞中mRNA及蛋白表达水平；MTT检测细胞增殖率.结果 U251细胞NS-mRNA和NS-protein的表达分别为178.91％和97.55％；siRNA转染U251细胞后NS-mRNA抑制率60.79％,NS-protein 抑制率94.00％; MTT结果显示干扰72 h后细胞增殖抑制率为31.3％.结论 NS基因siRNA片段转染U251细胞后,NS基因表达被特异性沉默,细胞增殖受到抑制.
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HIF-1α基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞VEGF和MMP-2基因表达的影响
目的 探讨缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响.方法 构建HIF-1α基因的RNA干扰(RNAi)表达载体(HIF-1α-shRNA-pGenesil-1)和阴性对照载体(shRNA-HK-pGenesil-1),并将其与质粒结合.将人肝癌SMMC-7721细胞分为沉默组、阴性对照组和空白对照组,分别转染HIF-1α-shRNA-pGenesil-1重组载体、shRNA-HK-pGenesil-1重组载体和空载体pGenesil-1.转染细胞经浓度为500μg/mL的G418溶液筛选后获得带有转染重组载体的细胞克隆,分别于常氧、低氧6h、低氧12h及低氧24h条件下培养,再采用实时定量逆转录聚合链式反应(RT-PCR)检测细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达.结果 常氧条件下,沉默组、阴性对照组和空白对照组细胞中均无HIF-1α mRNA的表达,且3组细胞中VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05).低氧培养6、12及24 h时,沉默组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均低于同时点空白对照组和阴性对照组(P＜0.05),但同时点空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).与常氧条件对应组别比较,沉默组、阴性对照组和空白对照组各低氧条件组细胞中HIF-1αmRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均较高(P＜0.05);低氧条件下,3组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均呈下降趋势,同组内3个时点间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 利用RNAi技术有效沉默人肝癌SMMC-7721细胞中HIF-1α基因的表达后,VEGF mRNA和MMP-2 mRNA的表达水平均降低,提示沉默HIF-1α基因可抑制原发性肝癌的浸润和转移.
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RNA干扰技术在肿瘤治疗中的应用
RNA干扰.(RNA interference,RNAi)是近年发现的一种重要的基因表达调控方式,是由转入细胞的小干扰双链RNA诱导同源mRNA特异性降解产生的一种转录后基因沉默现象(post transcription gene silencing,PTGS).
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RNA干扰技术及其在口腔医学领域中的应用
传统认为RAN在遗传过程中只起着信息传递作用.但近研究发现,小RNA也有基因调控作用.小RNA能关闭基因的表达或改变基因表达的水平,从而指导细胞的定向分化.本文从目前研究较多的RNA干扰的作用机制、siRNAs的制备方法及RNA干扰技术在口腔医学领域中的应用等方面作一综述.
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基因沉默策略及其应用研究进展
基因沉默(Gene silencing)是生物体中特定基因由于各种原因不表达或表达减少的现象,是通过表观遗传控制基因表达的重要机制,通过基因沉默技术探索疑难疾病的治疗方法是当下的研究热点.随着基因工程的迅速发展,基因沉默技术不断有新技术出现取代已有的技术.对基因沉默技术所包括的核酶技术、反义寡核酸技术、基因敲除、RNA干扰技术及其应用进行介绍.
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MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响
目的:构建MAD2(有丝分裂阻滞缺陷蛋白2)特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响.方法:构建MAD2 siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901.稳定转染后Western blot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果好的单个克隆.MTF法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布.结果:成功构建MAD2 siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调.MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快(P＜0.01),经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期.结论:小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达.MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用.
关键词： 有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2) RNA干扰技术 胃癌 细胞周期 -
RNA干扰技术及其在乳腺癌研究中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)也称转录后的基因沉默(post-transcriptional-gene silencillg,PTGS),是指将外源性或内源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)导人细胞后引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,其相应的基因受到抑制.它是一种强有效的基因沉默工具.
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活化诱导胞嘧啶核苷酸脱氨酶对膀胱癌T24细胞表型的影响
目的 探讨AID (活化诱导胞嘧啶核苷酸脱氨酶)在人体膀胱癌、癌旁组织中的表达情况以及AID对膀胱癌细胞株 T24增殖、侵袭、迁移以及凋亡的影响.方法 运用Western bolt以及免疫组织化学染色法检测16例临床膀胱癌组织以及癌旁组织中AID的相对表达量;将携带有抑制AID表达的shRNA序列(shAICDA-T24组)或空载序列(NC-T24组)以慢病毒为载体对T24细胞进行感染,利用Western bolt对T24 、NC-T24以及shAICDA-T24组进行 AID表达量的检测;因为转染后的多克隆细胞株AID的表达抑制效果有限,随后我们对转染的T24细胞进行单克隆细胞筛选,通过Western bolt结果选取抑制效果明显的组别用于后续试验;然后运用细胞增值试验(CCK8)、流式细胞术(凋亡)、细胞划痕实验以及细胞小室实验(Transwell)检测抑制AID的表达对T24细胞增殖、凋亡、侵袭以及迁移的影响.结果 人体膀胱癌组织中存在AID的表达,并且膀胱癌组织中AID的表达显著高于癌旁组织(P＜0 .05) ;通过RNA干扰技术(RNAi)抑制AID的表达可显著降低膀胱癌细胞株 T24的增殖、侵袭和迁移能力,并且增加了T24细胞的凋亡率(P＜0 .05).结论 抑制AID的表达可显著降低 T24细胞增殖、侵袭以及迁移能力,并且增加T24细胞的凋亡,其表达可能与膀胱癌的进展具有相关性.
