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靶向人VEGF165的SiRNA慢病毒的构建和鉴定
目的:构建靶向VEGF基因的SiRNA慢病毒载体,并包装病毒.方法:针对已经筛选确定的SiRNA有效靶序列,合成靶序列的0ligoDNA,经双酶切后与PGC SIL-GFP慢病毒载体连接,构建慢病毒载体PGCSIL-SiVEGF,以293T细胞包装得到干扰病毒LV-SiVEGF,根据细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度；病毒感染人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过定量RT-PCR检测VEGF的mRNA表达.结果:测序结果表明,靶向人VEGF的SiRNA慢病毒载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为2 x 109ifu/μl；感染HUVEC细胞后,实验组和对照组相比VEGF mRNA表达水平显著降低.结论:成功构建人VEGF SiRNA慢病毒LV-SiVEGF.
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RNA干扰技术在视网膜疾病治疗中的研究进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种在动物中广泛存在的、通过双链 RNA 分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程.作为一种阻断基因表达的新手段,RNAi技术日趋成熟完善,开辟了一条基因治疗的新途径.RNAi技术能够有效阻止视网膜新生血管的形成,抑制增生性玻璃体视网膜病变的发生和发展,诱导视网膜母细胞瘤细胞的凋亡.现将RNAi技术在上述视网膜病变中的研究进展作一综述.
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RNA干扰技术抑制EC-109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究
目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对survivin基因的siRNA,抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡. 方法:构建针对survivin的siRNA表达质粒,转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒,观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达46.70%. 半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC-109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论:survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达,并能有效地诱导EC-109细胞的凋亡,为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.
关键词： RNA干扰技术 食管肿瘤 Survivin基因 EC-109细胞 -
RNA干扰技术在医学上的应用前景
RNA干扰技术是2002年以来生物技术的重大突破，是近几年生物医学领域的研究焦点。它在医学的基因组研究、遗传性疾病治疗、病毒性疾病治疗、肿瘤治疗及新药开发中有广阔的应用前景。
关键词： RNA干扰(RNAi) RNA干扰技术 医学上的应用前景 -
RNA干扰技术在寄生虫学研究中的应用前景
RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)是一种在真核生物中普遍存在的自身防御反应,是外源性或内源性的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)介导的特异基因关闭或基因沉默现象[1].
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Nogo-66受体单链RNA干扰对大鼠脊髓半切损伤的治疗效应
目的 观察Nngo-66受体(NgR)单链RNA干扰(siRNA)对大鼠脊髓半切损伤的治疗效应. 方法 建立大鼠脊髓半切损伤模型,脑室内注射筛选出的有效NgR siRNA,采用运动功能评分、辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪、HE染色等方法,评价NgR siRNA对损伤脊髓的治疗效应. 结果 神经功能评分示,从第4周起,siRNA治疗组的运功功能恢复好于等渗盐水组和空白对照组,但差异无统计学意义.HRP逆行神经示踪示,治疗组多数可于脊髓前角见较多的标记细胞,与等渗盐水组和空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).HE染色示脊髓损伤后8周,等渗盐水组和对照组的损伤区纤维排列紊乱,siRNA组部分大鼠损伤区见有较连续的纤维通过.结论NgR siRNA可促进脊髓损伤后的神经再生修复.
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小分子RNA干扰Smad3基因对人增生性瘢痕的作用
近年来对于增生性瘢痕形成机制的研究较多,TGF-β信号转导的中介分子Smad家族,位于TGF-β家族配体-受体信号转导系统的下游,通过调控核内靶基因的转录控制创面愈合和病理性瘢痕形成[1-2].本研究中,笔者利用小分子RNA干扰技术特异性抑制Smad 3基因的表达,观察其对瘢痕增生和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成等的影响,为进一步临床应用基因治疗瘢痕提供理论依据和实验基础.
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RNA干扰Gα13对人卵巢癌HO-8910PM细胞侵袭转移的影响
目的:利用小干扰RNA技术沉默Gα13基因的表达,探讨其对人卵巢癌HO-8910PM细胞生长与转移的影响.方法:以Shuttle Vector 1.O-CMV为载体,构建针对Gα13的shRNA重组表达质粒;转染人卵巢癌细胞HO-8910PM,利用RT-PCR和Western Blot分别检测Gα13基因mRNA和蛋白的表达水平.体外通过MTT法、Transwell小室、Matrigel胶模型、流式细胞术,观察Gα13被沉默后对人卵巢癌HO-8910PM细胞生长与侵袭转移的影响;放射自显影方法分析Rho GTPases活性.结果:RT-PCR和Western Blot结果显示,Shuttle Vector 1.0-CMV Gα13 B siRNA转染组Gα13基因的表达水平被有效抑制.与对照组相比,Shuttle Vector 1.0-CMV Gα13 B siRNA转染组的细胞侵袭、迁移力明显下降(P＜0.01),细胞被阻滞在G0/G1期,且膜上Rho GTPases与GTP结合活性明显下降.结论:靶向Gα13的重组shRNA质粒能够有效抑制Gα13基因在HO-8910PM细胞中的表达,并能降低HO-8910PM细胞侵袭迁移的能力,其机制可能与降低细胞膜上Rho GTPases活性有关,可为卵巢癌的靶向治疗提供参考.
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siRNA抑制DNA-PKcs表达及对HeLa细胞增殖的影响
背景与目的:建立抑制DNA-PKcs表达的细胞模型,以此探讨DNA-PKcs的功能.材料与方法:构建DNA-PKcs的siRNA抑制表达载体,利用Lipofectamine介导,转染HeLa细胞,筛选稳定表达的转化克隆.Western blot检测DNA-PKcs表达.通过细胞生长速度检测细胞辐射敏感性变化.结果:设计了作用于DNA-PKcs不同位点的3条siRNA,并构建表达质粒,转染HeLa细胞,获得了3个稳定转化克隆,Western blot分析表明其DNA-PKcs表达受到明显抑制,细胞对γ射线和紫外线的敏感性增加,接种裸鼠后的肿瘤生长速度减慢.结论:成功建立了DNA-PKcs表达抑制细胞模型,并且发现DNA-PKcs表达抑制后除影响细胞的辐射敏感性外,还可能与肿瘤细胞增殖有关.
