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针刺对痛经大鼠中枢及外周β-EP含量的影响
RNA干扰(RNAi)技术作为一种新的反义基因工具,较以往的重组反义DNA,反义寡聚脱氧核糖核苷酸的效率更高,细胞内少许siRNA分子就能发挥显著基因下调作用[1].
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RNA干扰技术及其在病理性瘢痕中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指将双链RNA(dsRNA)导入细胞,其序列与靶基因同源,它在细胞内可与靶基因mRNA结合,并迅速将其降解,从而抑制该基因的表达.2001年,Elbashir等[1]在哺乳动物细胞中用化学合成的21nt的dsRNA诱导产生了特异性的RNAi,RNAi技术迅速扩展到哺乳动物领域.研究证实,转染小的双链siR-NA进人细胞,siRNA能特异地结合相应的靶基因mRNA,导致其降解,进而引起>90%的相应蛋白表达的减少.基于RNAi的上述特点,该技术完全有望成为一种新的基因治疗技术,为各类疾病的治疗提供一个新的途径[2].
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青光眼滤过泡瘢痕化临床药物治疗的基础研究
青光眼滤过手术是目前治疗青光眼的主要方式之一,而青光眼滤过泡术后瘢痕化是术后眼压失控、手术失败的主要原因.近年来,随着生物化学、分子生物学等学科的发展,青光眼术后抗瘢痕化的方法有了很大的进展,由以往单纯的药物治疗、细胞因子治疗发展为多种治疗方法方式相结合,为抗青光眼术后瘢痕化提供了更广阔的空间及前景.
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RNA干扰技术在药物研究中的应用
RNA干扰是由双链RNA引发的转录后基因沉默.双链RNA经Dicer酶降解成21-23 nt的小干扰RNA,并以其为模板,特定位点、特定间隔降解与之序列相应的mRNA.随着RNA干扰机制的深入研究与广泛应用,RNAi已用在药物研究中的各个领域,尤其在药物开发上,能够解决临床前药物开发的一些瓶颈问题,如药靶鉴定,优化药靶,从而节省时间和资金,并提高成功率,加速药物的临床研究.同时RNAi在药物研究的其他领域都也显示了卓越的作用,为药物研究提供了强大的工具.
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RNA干扰技术在血吸虫病研究中的应用进展
血吸虫病在当前仍是危害严重的人兽共患寄生虫病,全球约有2亿人受到感染[1].目前治疗血吸虫病的药物尽管疗效显著,但其对已造成的组织损害没有影响、治疗后容易再感染、巩固疗效费用高,并且可能产生抗药性虫株,因而控制血吸虫病的效果尚待改进.
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RNA干扰技术在肝细胞癌治疗方面的研究现状及进展
RNA干扰(RNAi)是生物进化过程中高度保守且借助双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发,高效特异性降解同源mRNA的现象.近来研究发现RNAi技术可高度特异地剔除或关闭目的靶基因,从而操控其表达.目前该技术广泛应用于研究靶基因功能、治疗部分疾病特别是恶性肿瘤的基因治疗.肝癌在我国高发,严重威胁患者的生命,针对肝癌的早期诊断、治疗和预后评估一直是外科肿瘤学领域的研究重点.近年,将RNAi技术与肝癌分子生物学机制方面的研究相结合,呈现出很多令人期待、值得深入的研究成果.对此领域的近期研究成果做扼要综述.
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PPARγ siRNA抑制子宫内膜腺癌细胞增殖与侵袭并诱导其凋亡
目的:应用siRNA技术沉默子宫内膜癌细胞PPARγ的表达,探讨其对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和凋亡的变化.方法:构建小干扰RNA重组质粒,用于转染KLE与HEC-1A细胞,Western blotting检测沉默效应.沉默PPARγ后,MTT法观察两种细胞增殖能力的改变,Hoechst染色法观察细胞的凋亡情况,侵袭试验观察肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果:转染干扰载体后48h,沉默效率可分别达到62.9%±3.3%、72.9%±10.29%;KLE与HEC-1A细胞增殖能力在转染后48h差异有统计学意义,72h后细胞增殖能力明显降低;细胞60h已表现出早期凋亡现象,72h凋亡明显增多;转染后48h细胞的侵袭能力已降低.结论:抑制PPARγ的表达可以抑制高表达PPARγ的子宫内膜样腺癌细胞KLE与HEC-1A的增殖,诱导其凋亡,同时降低细胞的侵袭能力,表明PPARγ在子宫内膜样腺癌细胞生长和侵袭生物学特征上发挥调控作用.
关键词： RNA干扰技术 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 子宫内膜肿瘤 -
RNA干扰技术的研究进展
RNA干扰技术具有高特异性、高效性等显著优势,近年在医学领域广泛应用,包括基因组研究、病毒性疾病治疗、肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗及新药开发等. 本文就RNAi技术的研究现状作一综述.
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RNA干扰技术在治疗肿瘤及制药方面的优势
RNA干扰技术是近年发展起来的一项新技术,与内源mRNA同源的小片段外源双链RNA导人细胞,产生约21～23bp的小干扰RNA,导致特定基因表达沉默.自1998年RNA干扰技术出现伊始,得到了迅猛发展,连续三年被评为十大科技突破之一,Andrew Fire和Craig Mell曾凭借在RNA干扰技术方面的杰出贡献荣获诺贝尔奖.本文就其在肿瘤治疗及制药方面的优势作一介绍.
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敲低lncRNA SNHG16对胃癌细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)核内小RNA宿主基因16(SNHG16)对胃癌细胞凋亡的影响及其机制.方法 取人胃癌高分化细胞株AGS(以下称AGS细胞),体外传代培养.取传3代、对数生长期、生长状态良好的AGS细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组、si-SNHG16组.si-SNHG16组、阴性对照组分别转染si-SNHG16干扰序列、阴性对照序列,空白对照组不予转染.转染48 h,收集各组细胞,采用qRT-PCR法验证si-SNHG16干扰效率以及敲低lncRNA SNHG16后p53基因表达;采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术、Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡情况;采用Western blotting法检测p53、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达;采用酶标仪检测Caspase-3酶活性.结果 与空白对照组、阴性对照组比较,si-SNHG16组转染48 h lncRNA SNHG16相对表达量明显降低、p53基因相对表达量明显升高,细胞凋亡率和细胞凋亡数均明显增加,p53蛋白及凋亡相关蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达均明显上调,而Bcl-2表达明显下调,且Caspase-3酶活性明显增加(P均<0.05).阴性对照组与空白对照组上述指标比较P均>0.05.结论 敲低lncRNA SNHG16可促进胃癌细胞凋亡,其机制可能与激活p53信号通路下游凋亡相关蛋白表达,继而启动细胞凋亡程序有关.
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Notch1基因沉默的人绒毛膜上皮癌细胞增殖及侵袭能力变化
目的：观察Notch1基因沉默后人绒毛膜上皮癌细胞增殖及侵袭能力变化。方法查阅GenBank提供的Notch1序列（NM-001105721．1）设计引物，合成Notch1 siRNA。分离培养人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞，分为A、B、C组。 A组不做转染，B组转染control siRNA ，C组转染Notch1 siRNA。分别于转染后12、24、36、48、60 h采用MTT法检测各组细胞增殖能力（ OD值）。转染后48 h采用Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭能力。转染后72 h采用Western blotting法检测各组细胞中的MMP-2、MMP-9蛋白。结果转染后36、48、60 h C组OD值低于A、B组（ P均＜0．05）。 A、B、C组穿膜细胞数分别为（109±6）、（118±7）、（59±4）个，C组与A、B相比，P均＜0．05。 A、B、C组细胞中MMP-2蛋白相对表达量分别为0．91±0．08、0．87±0．01、0．29±0．05，MMP-9蛋白相对表达量分别为0．85±0．04、0．79±0．03、0．35±0．05，C组MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量与A、B组相比，P均＜0．05。结论Notch1基因沉默后，人绒毛膜上皮癌细胞增殖受到抑制，侵袭能力减弱。
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靶向HIF-2siRNA对人胰腺癌BXPC-3细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察靶向缺氧诱导因子2 (HIF-2)的小干扰RNA (siRNA)对人胰腺癌BXPC-3细胞增殖和凋亡的影响.方法 将BXPC-3细胞随机分为A、B、C组,A组转染HIF-2 siRNA、B组转染非特异性siRNA、C组不转染,分别予常氧、缺氧环境下培养；采用MTT法检测培养24、48、72、96 h时BXPC-3细胞的光密度(OD)值观察增殖情况,用流式细胞仪检测培养48 h时BXPC-3细胞凋亡率.结果 在缺氧培养48 h时,A、B、C组细胞OD值分别为0.54 ±0.07、0.69 ±0.09、0.72 ±0.13,72 h时分别为0.55±0.11、0.88 ±0.07、0.88±0.05,96 h时分别为0.56±0.12、0.93 ±0.11、0.94 ±0.09；A组与B、C组比较,P均＜0.05.在缺氧培养48 h时,A、B、C组细胞凋亡率分别为21.37％±0.17％、7.12％±0.03％、7.24％±0.07％；A组与B、C组比较,P均＜0.05.在常氧状态下,各组细胞OD值及凋亡率无明显差别.结论 缺氧状态下,靶向HIF-2 siRNA可抑制人胰腺癌BXPC-3细胞增殖,诱导其凋亡.
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cripto-1基因siRNA对乳腺癌细胞侵袭力的影响
目的 观察cripto-1基因小干扰RNA(siRNA)对乳腺癌细胞侵袭力的影响.方法 将人乳腺癌MDA-MB468细胞分为4组,A组不处理,B组转染空载脂质体,C组转染错配siRNA,D组转染分别转染含3.125、6.25、12.5 nmol/L cripto-1基因siRNA的脂质体.分别于处理24、48、72 h收集各组细胞.采用实时定量RT-PCR法和Western blot法检测MDA-MB468的cripto-1 mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测MDA-MB468的锚着不依赖性增殖和侵袭能力.结果 与A、B、C组比较,D组MDA-MB468的cripto-1 mRNA、cripto-1蛋白、集落形成数量、穿膜细胞数均呈浓度依赖性减少(P均＜0.005).结论 cripto-1基因siRNA可抑制乳腺癌细胞侵袭.
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AKT 基因沉默对人卵巢癌细胞增殖及 Fas、Fas L、Caspase-3蛋白表达的影响
目的：观察丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（ AKT）基因沉默对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖及细胞中Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表达的影响。方法体外培养SKOV3细胞，随机分为对照组、空白载体组与实验组。空白载体组加入脂质体、不转染AKT siRNA，实验组转染AKT siRNA，对照组不给予任何干预措施。转染24 h后观察各组细胞增殖情况，采用免疫荧光双重标记法检测各组细胞中的Fas、FasL、Caspase-3蛋白。结果实验组细胞密度低于对照组、空白载体组，且细胞突起减少，胞体折光性减弱，细胞变圆离壁。实验组细胞密度为27．31％±1．22％，空白载体组、对照组分别为89．56％±2．17％、92．01％±3．22％，实验组与空白载体组、对照组相比，P均＜0．05；实验组细胞增殖率为31．17％±1．38％，空白载体组、对照组增殖率分别为183．77％±4．22％、181．56％±3．77％，实验组与空白载体组、对照组相比，P均＜0．01。实验组Fas、FasL、Caspase-3蛋白阳性表达率分别为18．62％±0．78％、85．69％±1．34％、74．22％±2．11％，空白载体组分别为14．01％±0．12％、58．67％±1．33％、43．24％±1．02％，对照组分别为16．06％±0．03％、32．77％±1．07％、38．01％±0．92％，实验组细胞中Caspase-3、FasL蛋白阳性表达率与空白载体组、对照组相比，P均＜0．05。结论 AKT基因沉默后，SKOV3细胞增殖受到抑制，且细胞中FasL、Caspase-3蛋白表达上调。
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RNA干扰技术在临床中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)早于上世纪90年代初在植物细胞中被发现,后来很快发现在其他生物中也存在这种现象,现已明确RNAi是生物界广泛存在的一种基因表达调控方式.
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RNA干扰抑制人结肠癌SW480细胞EGFR的表达及其对体外生长情况影响的研究
目的 研究利用RNA干扰技术抑制人结肠癌SW480细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,并观察受抑制后SW480细胞体外生长情况的改变.方法 利用脂质体将siRNA转染进入SW480细胞(野生型K-ras基因表达阳性),在细胞内形成双链siRNA,识别并降解EGFR mRNA.通过荧光定量RT-PCR检测EGFR mRNA的表达水平,Western blot检测EGFR蛋白的表达,MTT法检测SW480细胞的增殖抑制情况,流式细胞学检测细胞凋亡情况.结果 转染EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA的SW480细胞其EGFR mRNA及蛋白表达均较对照组明显降低(P＜0.05);转染EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA的SW480细胞增殖率较对照组降低(P＜0.05),凋亡率增高(P＜0.05).结论 siRNA能有效抑制SW480细胞EGFR基因的表达,具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用.
关键词： 表皮生长因子受体 RNA干扰技术 人结肠癌SW480细胞 -
RNAi阻断人膀胱癌组织中成纤维细胞内透明质酸合成酶3的表达研究
目的探讨RNA干扰技术阻断人膀胱移行细胞癌组织中成纤维细胞内透明质酸合成酶3(hyaluronic acid synthase 3,HAS3)的表达与膀胱移行细胞癌生物学行为之间的关系.方法设计、体外化学合成HAS3 mRNA序列特异性、非特异性小干涉双链RNA(small interferencing RNA,siRNA),分别与脂质体LipofectamineTM 2000结合后转染体外培养的人膀胱移行细胞癌组织中的成纤维细胞.实验分为A、B、C、D四组:孵育48 h后,取各组细胞培养液进行放免法透明质酸浓度测定、免疫细胞化学染色了解透明质酸的合成、RT-PCR法检测HAS3 mRNA的表达.结果与A组相比,D组细胞HAS3 mRNA表达减少了78.2%,HA染色明显变淡,细胞培养液中HA浓度下降了60.3%(P<0.01);B、C组mRNA表达分别减少了4.7%、5.4%,HA染色几乎无变化,HA浓度分别下降了5.2%、5.8%(P>0.05).结论 RNA干扰技术可以显著地减少膀胱移行细胞癌组织中成纤维细胞的HAS3的表达,从而大幅度地降低该细胞内透明质酸的合成.
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短发夹RNA靶向沉默大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞胰岛素样生长因子结合蛋白-3的研究
目的 筛选靶向抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)基因表达有效的短发夹RNA(shRNA),为基因沉默IGFBP-3治疗大鼠勃起功能障碍提供依据.方法 构建4对靶向IGFBP-3的短发夹RNA(shRNA)质粒和阴性对照,体外原代培养CCSMC,分6组:空白对照组、转染pGPU6/GFP/Neo-IGFBP-3 (611)组、转染pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP-3 (526)组、转染pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP-3 (866)组、转染pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP-3 (710)组和转染pGPU6/GFP/Neo-shNC阴性对照组;转染48h后各组分别用实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot方法检测靶向沉默IGFBP-3的效果.结果 CCSMC转染后实时定量PCR和Western blot检测发现,pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-526、pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-611、pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-866均有明显的沉默效果,与空白对照组和转染pGPU6/GFP/Neo-shNC组比较差异有统计学意义,而其中pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-526沉默效果明显,实时定量PCR和Western blot结果显示分别可以抑制72%和79%.结论 靶向IGFBP-3基因的shRNA能够高效抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中靶基因的表达,为进一步体内实验奠定基础.
关键词： 勃起功能障碍 胰岛素样生长因子结合蛋白-3 基因治疗 RNA干扰技术 大鼠 -
RNA干扰技术靶向c-Myc基因抑制胃癌SGC7901细胞的体内外影响
目的 观察RNA干扰c-Myc对胃癌SGC7901细胞体内外增殖的影响.方法 利用RNA干扰技术沉默胃癌SGC7901的c-Myc基因,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测胃癌SGC7901的c-Myc基因表达,噻唑蓝(MTT)法及体内成瘤法检测胃癌SGC7901增殖.结果 RNA干扰技术沉默c-Myc基因后,胃癌SGC7901的增殖速度及体内成瘤生长速度明显下降,第7天时,相对于空白组,小干扰RNA (siRNA)-Scramble组肿瘤抑制率为98.78％ (P＞0.05),实验组肿瘤抑制率为49.96％ (P＜0.05).结论 干扰c-Myc后胃癌SGC7901体内外增殖速度下降.
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膜联蛋白A11对人胃癌细胞株SGC7901氟尿嘧啶耐药性的影响及机制
目的 观察膜联蛋白A11(ANXA11)对人胃癌细胞株SGC7901 5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药性影响.方法 检测人胃癌细胞株SCG7901、BGC823的ANXA11表达.将ANXA11-小干扰RNA(siRNA)及阴性对照序列瞬时转染入SGC7901细胞,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染后各组细胞对不同剂量5-Fu(1、10、20、40、80 μg/ml)的药物敏感性改变.应用流式细胞术检测不同处理组凋亡率,应用定量聚合酶链反应(qPCR)、Western blot检测胸腺嘧啶脱氧核苷合成酶(TS)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bax)表达的改变.结果 ANXA11 mRNA及蛋白表达量在SGC7901中显著高于BGC823(t=3.212,P=0.033;t=-10.768,P=0.000).转染组(转染ANXA11-siRNA)细胞的半数抑制剂量(IC50)及20％抑制剂量(IC20)值明显低于阴性、空白对照组(F =47.500,P=0.000;F =45.523,P=0.000).转染组、联合组凋亡率较阴性(转染NS-siRNA)、空白对照组(转染LipofectamineTM2000)显著升高(F=117.525,P=0.000),且联合组凋亡率较转染组明显升高(=9.004,P=0.000).转染组及联合组ANXA11蛋白表达较阴性、空白对照组显著降低(F=118.403,P=0.000).转染组及联合组bax的表达上调(F =35.608,P=0.000),而bcl-2、TS的表达降低(F=30.048,P=0.000;F=22.874,P=0.000).结论 抑制ANXA11表达能提高人胃癌细胞株SGC7901对5-Fu的敏感性,可能与抑制TS、bcl-2、上调bax的表达有关.
