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干扰ClC-2基因表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响
目的观察抑制容积调控氯通道ClC-2基因的表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响.方法设计和构建两个针对ClC-2基因的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒和两个重组质粒分别转染入BT-325细胞(依次为对照组、PP1组和PP2组);通过RT-PCR检测ClC-2基因mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期.结果与对照组相比较,干扰组ClC-2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期.结论干扰胶质瘤细胞系BT-325细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的生长,提示ClC-2基因可能成为控制胶质瘤恶性生长的新靶点.
关键词： ClC-2基因 胶质瘤 RNA干扰(RNAi) BT-325细胞 -
Nup88-shRNA对人结肠癌细胞株HT-29生长及侵袭力影响的实验研究
目的：构建重组慢病毒介导的Nup88-shRNA载体，由RNA干扰（RNAi）技术沉默Nup88，研究其对结肠癌HT-29细胞的增殖、黏附、侵袭和转移的影响，为结肠癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法 Nup88重组慢病毒载体的构建后包装检验效价，以佳感染复数转染结肠癌HT-29细胞，实验分为沉默组、阴性对照组和空白组3组，其中沉默组分为Nup88-shRNA1、Nup88-shRNA2、Nup88-shRNA3、Nup88-shRNA44个亚组。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot印迹检测各组表达效率，主要是HT-29细胞的mRNA和蛋白；四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测Nup88基因被干扰后对HT-29细胞增殖和凋亡的影响；细胞侵袭实验检测Nup88基因被干扰后对HT-29细胞侵袭力的影响。结果沉默4组病毒及1组阴性对照均构建成功，滴度均为4E+8 TU/mL。沉默组Nup88 mRNA与阴性对照组和空白组相比，蛋白表达差异均有显著统计学意义（P<0．01）。 Nup88-shRNA1转染后，沉默率可达到86%。沉默组细胞增殖程度显著减少，与空白组和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P<0．05）。沉默组细胞凋亡率（30．28%±0．19%）显著增加，与阴性对照组（4．15%±0．24%）和空白组（2．98%±0．27%）相比，差异有统计学意义（P<0．05）。培养肿瘤细胞常规24 h 后，沉默组穿膜细胞数（120．5±8．7）和抑制率（49．22%）与阴性对照组（232．2±13．4，-2．14%）和空白组（276．4±10．2，0）相比，穿膜细胞数明显减少，抑制率明显增加，差异具有统计学意义（P<0．05）。结论 Nup88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制HT-29细胞中Nup88基因的表达，并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。
关键词： Nup88 人结肠癌细胞HT-29 RNA干扰(RNAi) 慢病毒载体 -
反义治疗在宫颈癌中的研究进展
利用基因芯片、蛋白质芯片筛选肿瘤转化和发展过程中的靶基因取得成果,反义治疗是在基因水平针对这些靶基因而设计,从而干扰致病蛋白的产生,由于其高特异性及低毒副作用,为抗癌药的发展带来新的希望.着重介绍反义治疗在宫颈癌方面的进展.
关键词： 宫颈癌 反义治疗 反义寡核苷酸(as-ODN) RNA干扰(RNAi) -
RNA干扰技术抑制宫颈癌细胞低氧诱导因子-1表达的研究
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,使用特异的靶向作用HIF-1基因的小干扰RNA(siRNA)作用于宫颈癌细胞株SiHa,以了解siRNA对HIF-1基因的特异性抑制作用.方法:设计合成针对HIF-1的四个siRNA,鉴定无误后均借助脂质体转染宫颈癌细胞株SiHa.检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中mRNA和蛋白的表达变化.筛选出抑制率高的siRNA.用筛选出的siRNA转染SiHa细胞,检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中不同时间点mRNA和蛋白的表达变化,验证RNAi作用的特异性及时效性.结果:H2siRNA引起常氧和低氧培养的SiHa细胞中HIF-1基因表达水平的下降显著(P<0.05);将H2siRNA转染常氧和低氧培养的SiHa细胞,转染后24、48、72及96h均可观察到HIF-1基因的显著降低,均以48h时靶基因表达水平的下降显著(P<0.05),对应的非靶基因无明显抑制作用.结论:针对HIF-1构建的四个siRNA对HIF-1基因的干扰效率不同.本实验中,常氧及低氧培养SiHa细胞均以H2siRNA对HIF-1表达水平的降低作用明显.将H2siRNA作用于SiHa细胞,可引起靶基因特异、高效性抑制,常氧及低氧条件下至少维持到转染后96h,且均以48h时基因表达水平的下降显著.在SiHa细胞株,HIF-1 siRNA通过下调HIF-1发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用,RNAi技术可望为宫颈癌提供一种新的特异性基因治疗方法.
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RNAi介导Frizzled-9基因沉默对肝癌细胞株HepG-2增殖和转移的影响
背景与目的 肝癌(hepatic carcinoma)是我国常见恶性肿瘤之一,死亡率高,在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位.本研究将探索性地研究Frizzled-9在所有的肝细胞癌中都有表达,并且表达多少与肝癌的扩散及侵袭相关,而且,干扰了肝癌细胞FZ9后,通过Transwell小室模型检测被剔除了FZ9基因HepG-2细胞移动能力,为探寻治疗胰腺癌的新策略提供思路.方法 应用RT-PCR方法 检测肝癌细胞株HepG-2的FZ9的表达情况.并应用脂质体基因转染技术转染FZ9-siRNA至肝癌细胞株HepG-2.通过Transwell小室模型分析肝癌细胞的移动、侵袭性.结果 Frizzled-9特异的siRNA明显抑制HepG-2细胞中FZ9及蛋白的表达,与对照组比较其抑制率为97.6%.转染Frizzled-9-siRNA(5nM)24小时后对肝癌细胞的转移及侵袭能力有显著影响(P〈0.05),实验组较空白组转移及侵袭能力减弱.
关键词： Frizzled-9 RNA干扰(RNAi) 肝癌 细胞侵袭 -
针对PAI基因的小干扰RNA特异性调节PAI及tPA表达的实验研究
目的 设计针对纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI)基因的小干扰RNA(PAI siRNA),研究其对PAI和组织型纤溶酶原激活物(tPA)表达的影响.方法体外化学合成PAI siRNA,电转染法转染人主动脉平滑肌细胞(HASMC),采用RT-PCR及Western印迹法分别从mRNA和蛋白水平上检测转染细胞PAI及tPA蛋白的表达情况.结果转染细胞PAI mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显下降(P＜0.01),tPA蛋白表达较对照组明显升高(P＜0.01).结论 PAI siRNA可快速特异性封闭PAI基因表达,并调节tPA蛋白表达,使其升高,为进一步研究PAI在血栓性疾病中作用机制以及探讨PAI与tPA之间关系提供了实验基础.
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遗传学研究的新工具:RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是近年来发现的一个新的遗传学现象,近年来在遗传学的研究中巳用于基因功能的研究,遗传病的基因治疗等领域,成为遗传学研究的新工具.本文就其在遗传学方面的应用作一综述.
关键词： RNA干扰(RNAi) 遗传学 基因 -
成纤维生长因子(FGF)23基因沉默对甲状旁腺激素(PTH)促成骨细胞分化作用的影响
目的 研究内源性成纤维生长因子23 (fibroblast growth factor 23,FGF23)对甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)促成骨细胞分化作用的影响.方法 采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,应用小发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)干扰技术(RNAi)沉默成骨细胞FGF23表达,应用MTT法和PNPP法检测细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性,应用real-time RT-PCR法检测其FGF23、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)等基因mRNA水平,研究PTH对培养成骨细胞和FGF23基因沉默细胞的作用.结果 rhPTH1-34对培养成骨细胞增殖促进作用明显,分化促进作用弱.1×10-10～1×10-8mol/L rhPTH1-34作用3天,细胞增殖率增加31.6％～50.5％ (P＜0.05),而细胞比活性未见明显改变.同时其ALP和OCN转录水平轻度上调,分别较对照组增加35％ (P＜0.05)和16％ (P＞0.05).rhPTH1-34上调成骨细胞FGF23 mRNA水平(4倍),该作用可被针对FGF23特异的shRNA转染所抑制.FGF23基因沉默后PTH促分化作用明显增强,其ALP和OCN mRNA水平分别较对照组增加1.8倍(P＜0.05)和5.8倍(P＜0.05),显示内源性FGF23对PTH促分化的干扰作用.结论 内源性FGF23可能参与PTH促分化作用的调节,FGF23上调可干扰PTH的促成骨细胞分化作用.
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RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)与非编码RNA(ncRNA)调控的研究进展
RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)是一类以单链RNA为模板合成互补RNA链的聚合酶.根据其来源可分为病毒RdRP和细胞RdRP,病毒RdRP对病毒基因组复制及病毒引起的宿主免疫反应有重要作用,宿主细胞RdRP主要参与RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象.越来越多研究证明RdRP的功能与非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)密不可分,本文对病毒RdRP、细胞RdRP与ncRNA调控之间的关系作了较详细的阐述,同时对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)诱发的肝癌机制提出新的观点.
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利用RNAi和表达谱芯片分析日本血吸虫Sj34.9基因的功能
目的 分析日本血吸虫新基因Sj34.9的功能,为进一步研究该基因提供依据.方法 采用RNA干扰(RNAi)技术对Sj34.9基因在血吸虫体内的表达进行干扰,利用血吸虫寡聚核苷酸表达谱芯片分析Sj34.9基因表达沉默后血吸虫基因的表达情况.结果 Sj34.9基因RNAi组与对照组相比,显著差异表达的基因共378个,其中上调基因202个,下调基因176个;通路分析显示,表达差异基因主要与信号转导、信号分子间相互作用及各类物质代谢有关;基因本体论分类结果显示,多数基因与分子间结合、膜构成、细胞过程和机体生长发育及代谢相关.结论 Sj34.9基因可能对日本血吸虫的形成、生长、发育、调节、代谢等具有重要作用.
关键词： 日本血吸虫 RNA干扰(RNAi) 表达谱芯片 基因表达 -
食管鳞癌细胞中缺氧诱导因子-1α与基质金属蛋白酶-2基因相关性研究
目的:观察食管鳞癌细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)基因表达的关系以及与肿瘤的侵袭、转移行为的相关性.方法:以RNA干扰(RNAi)手段抑制HIF-1α的表达,构建HIF-1α基因沉默食管鳞癌细胞株;以稳定沉默HIF-1α基因的Eca-109细胞、100μol/L氯化钴模拟缺氧细胞及未干预细胞为研究对象,通过Westem blot检测MMP-2基因在3种细胞中的表达差异,以了解其与HIF-1α基因的关系.结果:4个HIF-1α基因沉默Eca-109细胞组与空白对照细胞组相比HIF-1α蛋白表达均有明显下调,同时MMP-2的蛋白表达均出现不同程度的下降,灰度扫描提示差异有统计学意义(P＜0.05).结论:食管鳞癌中HIF-1α与MMP-2基因之间存在相关性.
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组蛋白乙酰化酶RNAi慢病毒文库构建及其对胆囊癌细胞的感染
目的 构建人基因组中16个组蛋白乙酰化酶的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体文库,为进一步研究表观遗传因子对胆囊癌的调控机制提供有利的工具.方法 依据shRNA引物设计原则,分别针对每个基因设计4对shRNA引物,将引物退火形成粘性末端后连接至慢病毒载体；经菌落PCR、酶切验证正确后,进行转化及质粒抽提.结果 构建了16个组蛋白乙酰化酶基因的shRNA慢病毒载体,共64个shRNA慢病毒载体克隆；并对胆囊癌细胞SGC996和GBC-SD进行了病毒感染的MOI值(multiplicity of infection)摸索,以确保可通过RNA interference(RNAi)慢病毒干扰的方式对这两株细胞进行研究.结论 成功构建了16个组蛋白乙酰化酶的shRNA慢病毒载体,从而为在SGC996和GBC-SD胆囊癌细胞中研究人组蛋白乙酰化酶奠定坚实的基础.
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RNA干扰技术的研究进展
RNA干扰(RNAi)指由dsRNA或siRNA诱发的转录后基因沉默现象，其机制是通过与靶序列特定位点互补配对，通过阻碍靶基因的翻译或者诱导mRNA降解来抑制基因表达，是一项高效率、强特异性的基因沉默技术。 RNAi技术不仅在基础研究方面成为基因功能和蛋白功能研究的工具，也广泛的应用于临床研究，在肿瘤、病毒性疾病以及其他疾病的治疗方面显示了广阔的前景。
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RNA干扰及其在喉癌基因治疗中的应用现状
将外源性或内源性双链RNA(double-stranded BNA,dsRNA)导人细胞后引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,其相应的基因受到抑制,这种发生在转录后的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)[1]现象被称之为RNA干扰(RNAi).
关键词： 喉鳞状细胞癌 癌基因 RNA干扰(RNAi) -
RNA干扰在治疗脑胶质瘤中的研究
脑胶质瘤是颅内肿瘤中一类高发病率、高致残率、高死亡率的肿瘤,但目前,其临床治疗效果难以令人满意.如何提高疗效、改善预后是神经外科工作者研究的重点.RNA干扰(RNAi)技术作为一项新的基因治疗技术,因其独特的作用机制和优越性,正越来越受到研究者的重视.近几年,RNAi在治疗脑胶质瘤研究方面不断深入,对多种干扰策略中多个基因靶点的研究都取得了进展,并朝着联合干扰的方向发展,同时在载体和给药途径等技术环节上也有了很大改进.RNAi技术的发展将为脑胶质瘤的治疗带来新的希望.
关键词： RNA干扰(RNAi) 胶质瘤 小干扰RNA(siRNA) -
RNA干扰技术的演进及其在基因功能和基因治疗研究中的应用
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指双链RNA(double strands RNA, dsRNA)引起的mRNA水平互补序列基因表达的关闭,即序列特异性转录后基因沉寂,是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制.RNA干扰技术不仅被广泛地运用于基因功能研究,而且在基因治疗中显示出极大潜力.体外RAN干扰技术包括双链RNA的合成、基因导入及干扰作用评价等.本文阐述了近年来这一新兴生物学技术的发展与演进以及在基因功能及基因治疗研究中的应用和前景.
关键词： RNA干扰(RNAi) siRNA 基因沉寂 基因治疗 -
RNAi在胃癌研究中应用的进展
胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,其发病率在恶性肿瘤中占第四位,死亡率居第二位,且胃癌发病率在世界不同国家和地区有较大的差异,表现出明显的地域性.RNA 干扰技术 ( RNA interference ,RNAi) 在哺乳动物细胞中是利用小干扰RNA(small interference RNA ,siRNA)诱导特异性基因表达抑制,具有基因抑制效果确切、抑制具有严格的序列特异性、作用迅速等特点 ,已被广泛用于胃癌相关基因功能、胃癌化疗的多药耐药、胃癌的治疗方面的研究和探索.随着对RNAi机制的深入研究,相信不久的将来RNAi 技术能在肿瘤的基因治疗方面发挥越来越重要的作用.
关键词： RNA干扰(RNAi) 胃癌 基因治疗 -
针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒的构建与鉴定
目的:构建针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒.方法:以mU6pro为载体,化学合成shRNA表达模板,并定向克隆到载体的U6启动子下游,琼脂糖凝胶电泳法筛选阳性克隆,基因测序法检测插入模板序列的正确性.结果:获得了正确的重组质粒,插入的转录模板序列完全正确.结论:成功构建了针对人蛋白激酶CK2α亚基的RNAi体系.
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靶向RNAi抑制survivin基因增强胰腺癌对厄洛替尼化疗敏感性的实验研究
目的:胰腺癌的化疗药物耐药是一个亟待解决的问题.存活素(survivin)基因是肿瘤化疗耐药的重要原因.运用RNAi载体抑制survivin的表达对增强胰腺癌对厄洛替尼敏感性的影响.为增强胰腺癌化疗敏感性奠定一定的实验基础.方法:培养胰腺癌细胞PANC-1,构建以U6为启动子的RNAi载体并转染PANC-1,运用FCM检测加入厄洛替尼前后胰腺癌细胞凋亡指数和Hoechest 33258检测凋亡形态,MTT检测转染前后IC50.结果:转染survivin的RNAi载体后48h,流式细胞仪检测的凋亡指数为15.24％±1.35％,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05);Hoechst33258染色显示,PANC-1细胞出现核皱缩、浓染和碎裂等典型的凋亡形态,MTT检测转染前及转染后48h厄洛替尼的IC50分别为(1.35±0.05) μg/mL,(0.46±0.08) μg/mL,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论:Survivin的RNAi载体,能有效地增强胰腺癌对厄洛替尼的化疗敏感性.
关键词： 胰腺癌 存活素(survivin) RNA干扰(RNAi) 厄洛替尼 化疗敏感性 -
HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.
