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针对人c-Met基因的RNA干扰对晶状体上皮细胞增殖的影响
目的 探讨针对肝细胞生长因子(HGF)受体c-Met的RNA干扰对人晶状体上皮细胞增殖的影响.方法 构建针对人c-Met基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的人晶状体上皮细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测细胞中c-Met mRNA的表达变化,应用MTT法检测HGF诱导后人晶状体上皮细胞增殖.结果 与对照组相比,转染后的人晶状体上皮细胞中c-Met mRNA表达水平明显下降(P《0.01);与单纯HGF诱导组相比,转染后HGF诱导的人晶状体上皮细胞生长明显减慢,增殖能力明显下降(P《0.01).结论 针对人c-Met基因的RNA干扰可以有效阻断人晶状体上皮细胞中c-Met mRNA的表达,并能抑制HGF诱导的人晶状体上皮细胞的增殖.
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核酸药物的研究进展
从基因组的双链DNA (dsDNA),到编码和非编码RNA(mRNA、lncRNA和miRNA等),只要与疾病发生相关,都可能作为基因治疗的靶标.这些靶标可被替换、修复、补充、抑制或消除,取决于所采取的具体基因治疗方法.基因编辑技术是将致病基因裁剪缝补为正常的基因,而化学合成的和体内表达的核酸药物则主要靶向致病性RNA.与此同时,转运核酸药物的方法也在大力研发中,包括病毒或质粒表达载体和各种聚合物材料.核酸药物的成药性、转运载体的安全性和效率是基因治疗方法面临的挑战性问题.本文简要综述近年来基因治疗药物,特别是反义核酸、核酶、脱氧核酶、小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)等化学合成的核酸药物,以及化学修饰在提高核酸药物的效价、抗酶解稳定性和有效转运等关键技术方面的进展.随着对基因调控在疾病发生过程中认识的逐步深入和核酸药物优化技术的进步,核酸药物的研发步伐将会越来越快,期待包括siRNA药物在内的更多核酸药物在不久的将来应用于临床治疗.
关键词： 反义核酸 核酶 脱氧核酶 小干扰RNA(siRNA) 微小RNA(miRNA) 核酸药物 化学修饰 -
LHRH-MPG△NLS/siRNA纳米复合物的制备及稳定性观察
目的 设计并合成新型小干扰RNA(siRNA)载体促黄体激素释放激素-MPGΔNIS(LHRH-MPGΔNIS),考察不同N/P情况下LHRH- MPG△ΔNIS与siRNA结合情况并探索稳定的LHRH-MPGΔNIS/siRNA复合物的制备方法.方法 将LHRH-MPGΔNIS与针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的siRNA按N/P比为4∶1、6∶1、10∶1、12∶1的比例通过静电作用结合,制备多肽/siRNA复合物,并用琼脂糖凝胶电泳检测多肽与siRNA的结合情况.分别在pH值为7.0、75、8.0、8.5的溶液中制备N/P为20∶1的多肤/siRNA复合物,另在pH为7.0时按N/P为10∶1、15∶1、20:1制备多肽/siRNA复合物,BI-9000AT激光光散射仪分别检测其16d和20d内粒径大小变化情况,考察其稳定性.结果 LHRH-MPGΔNIS与siRNA在N/P大于10∶1时形成完全结合的复合物,即siRNA被多肽完全包裹.不同pH值溶液中形成的多肽/siRNA复合物稳定性没有明显的差别,且粒径均在100～280 nm,16d内未发生明显聚集.在pH为7.0时按N/P比为10∶1、15∶1、20∶1制备的LHRH-MPGΔNIS/siRNA复合物在20 d内粒径在150～450 nm分布,且未发生明显聚集,较为稳定.结论 实验研究设计了一种新型siRNA载体LHRH-MPGΔNIS,当N/P大于10∶1时其可将siRNA完全包裹；pH为7.0时N/P为10∶1、15∶1、20∶1时该载体与siRNA均可形成稳定的纳米级复合物,其中N/P为15∶1和20∶1的复合物粒径稳定性优于N/P为10∶1的复合物；在pH 7.0～8.5的溶液中形成的LHRH-MPGΔNIS/siRNA复合物均较稳定,没有明显差异.
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RNA干扰技术抑制宫颈癌细胞低氧诱导因子-1表达的研究
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,使用特异的靶向作用HIF-1基因的小干扰RNA(siRNA)作用于宫颈癌细胞株SiHa,以了解siRNA对HIF-1基因的特异性抑制作用.方法:设计合成针对HIF-1的四个siRNA,鉴定无误后均借助脂质体转染宫颈癌细胞株SiHa.检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中mRNA和蛋白的表达变化.筛选出抑制率高的siRNA.用筛选出的siRNA转染SiHa细胞,检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中不同时间点mRNA和蛋白的表达变化,验证RNAi作用的特异性及时效性.结果:H2siRNA引起常氧和低氧培养的SiHa细胞中HIF-1基因表达水平的下降显著(P<0.05);将H2siRNA转染常氧和低氧培养的SiHa细胞,转染后24、48、72及96h均可观察到HIF-1基因的显著降低,均以48h时靶基因表达水平的下降显著(P<0.05),对应的非靶基因无明显抑制作用.结论:针对HIF-1构建的四个siRNA对HIF-1基因的干扰效率不同.本实验中,常氧及低氧培养SiHa细胞均以H2siRNA对HIF-1表达水平的降低作用明显.将H2siRNA作用于SiHa细胞,可引起靶基因特异、高效性抑制,常氧及低氧条件下至少维持到转染后96h,且均以48h时基因表达水平的下降显著.在SiHa细胞株,HIF-1 siRNA通过下调HIF-1发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用,RNAi技术可望为宫颈癌提供一种新的特异性基因治疗方法.
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针对PAI基因的小干扰RNA特异性调节PAI及tPA表达的实验研究
目的 设计针对纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI)基因的小干扰RNA(PAI siRNA),研究其对PAI和组织型纤溶酶原激活物(tPA)表达的影响.方法体外化学合成PAI siRNA,电转染法转染人主动脉平滑肌细胞(HASMC),采用RT-PCR及Western印迹法分别从mRNA和蛋白水平上检测转染细胞PAI及tPA蛋白的表达情况.结果转染细胞PAI mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显下降(P＜0.01),tPA蛋白表达较对照组明显升高(P＜0.01).结论 PAI siRNA可快速特异性封闭PAI基因表达,并调节tPA蛋白表达,使其升高,为进一步研究PAI在血栓性疾病中作用机制以及探讨PAI与tPA之间关系提供了实验基础.
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下调PAI对HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物和尿激酶纤溶酶原激活物的影响
目的 探讨纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)的发卡样小干扰RNA(siRNA)真核表达载体对人肝癌HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶PA(uPA)表达的影响.方法 设计短发夹状PAI siRNA的寡核苷酸链,将其插入到真核细胞表达载体pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中构建重组载体后,采用脂质体转染方法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白对tPA和uPA表达的影响.结果 转染后细胞中PAI含量降低,tPA和uPA的表达减少(均P＜0.01).结论 测序结果表明发卡样的PAI siRNA真核表达载体转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,PAI siRNA能有效阻断PAI的蛋白合成,同时抑制细胞中tPA和uPA的表达.
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CTLA4对慢性乙型肝炎患者淋巴细胞增殖的影响
目的:探讨CTLA4对乙型肝炎的免疫调节作用.方法:根据已公布的CTLA4核酸序列,设计并合成CTLA4 siRNA,转染乙肝患者外周血淋巴细胞并观察淋巴细胞增殖反应指数的变化.结果:用CTLA4特异siRNA转染后,慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞增殖反应指数增加,与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:抑制CTLA4有助于慢性乙型肝炎患者细胞免疫的增强.
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siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究
目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.
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RNA干扰技术的研究进展
RNA干扰(RNAi)指由dsRNA或siRNA诱发的转录后基因沉默现象，其机制是通过与靶序列特定位点互补配对，通过阻碍靶基因的翻译或者诱导mRNA降解来抑制基因表达，是一项高效率、强特异性的基因沉默技术。 RNAi技术不仅在基础研究方面成为基因功能和蛋白功能研究的工具，也广泛的应用于临床研究，在肿瘤、病毒性疾病以及其他疾病的治疗方面显示了广阔的前景。
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MDRI的siRNA干扰口腔Tca8ll3/DDP细胞表达的研究
目的 探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对口腔鳞癌多药耐药基因mdr1(MDRI)及其表达产物P-糖蛋白(permeability-glyco-protein,P-gp)的干扰作用. 方法 体外构建针对MDR1的小干扰RNA,将其转染至人舌癌耐药细胞系Tca8113/DDP, 采用RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA的表达; 采用免疫细胞化学技术比较转染前后P-gp的表达; 采用MTT法检测转染前后肿瘤耐药细胞对顺铂的敏感性. 结果 Tca8113/DDP细胞经MDR1-siRNA转染后48 h的转染率达高,为71.3%;转染后mdr1 mRNA表达较对照组显著降低,降低率为68.32%, 转染48 h后P-gp的表达较对照组明显降低;siRNA可显著提高Tca8113/DDP细胞对DDP的敏感性,逆转其耐药性,耐药倍数为2.05. 结论 siRNA可以明显干扰口腔鳞癌MDR1及相应蛋白P-gp的表达.
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针对P基因的siRNA对乙肝病毒S表达稳定性的影响
目的 以乙型肝炎病毒(HBV)P基因为靶点,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体psRNA1、psRNA2、psRNA3、psRNA4及对照psiRNA0,体外观察针对P基因的siRNA对HBs表达的影响.方法 设计并合成针对HBV-P基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入psiRNA-H1neo质粒中,通过鉴定将构建成功的5个psiRNAs真核表达质粒瞬时转染HepG2.2.15细胞,用半定量RT-PCR对筛选到的位点进行了试验观测抑制效果.结果 表明针对P基因的siRNA能下调HBs 的表达,其中psiRNA1、psiRNA2的抑制HBs基因表达的效果强.结论 针对P基因的siRNA可以有效的抑制HBs的表达,抑制的效果和siRNA的靶位点有关.
关键词： RNA干扰 小干扰RNA(siRNA) HBV聚合酶 -
利用siRNA抑制食管癌VEGF-C的表达
目的 利用siRNA抑制人食管癌EC9706细胞中VEGF-C基因的表达. 方法 针对VFA3F-CmRNA设计了3条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染食管癌EC9706细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR和原位杂交技术分析siRNA对细胞中VEGF-C mRNA的降解作用;免疫组织化学法分析细胞中VEGF-C蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,免疫组织化学法检测瘤组织中VEGF-C的表达. 结果 siRNA能明显降低食管癌DC9706细胞中VEGF-C mRNA和蛋白的表达,稳定转染的3个siRNA组细胞仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和无阳性条带,与无关序列组和正常EC9706细胞组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);裸鼠体内的成瘤实验,3个siRNA转染组瘤组织中VEGF-C蛋白的表达也明显减少,与正常EC9706组无关序列组相比,差异均有统计学意义(P<0.01). 结论 靶向VEGF-C mRNA的siRNA能在体内外有效抑制VEGF-C的表达,可用于食管癌的基因治疗.
关键词： VEGF-C 小干扰RNA(siRNA) RT-PCR 裸鼠 食管癌 -
RNA干扰在治疗脑胶质瘤中的研究
脑胶质瘤是颅内肿瘤中一类高发病率、高致残率、高死亡率的肿瘤,但目前,其临床治疗效果难以令人满意.如何提高疗效、改善预后是神经外科工作者研究的重点.RNA干扰(RNAi)技术作为一项新的基因治疗技术,因其独特的作用机制和优越性,正越来越受到研究者的重视.近几年,RNAi在治疗脑胶质瘤研究方面不断深入,对多种干扰策略中多个基因靶点的研究都取得了进展,并朝着联合干扰的方向发展,同时在载体和给药途径等技术环节上也有了很大改进.RNAi技术的发展将为脑胶质瘤的治疗带来新的希望.
关键词： RNA干扰(RNAi) 胶质瘤 小干扰RNA(siRNA) -
RNA的靶向干扰在肝纤维化中应用研究
肝纤维化是肝脏慢性受损的结果,目前还没有更好的方法用于治疗肝纤维化. RNA干扰(RNAi)被称为是一个功能强大的工具后转录基因沉默,可作为肝纤维化基因治疗的新途径.但是它在体内是缺乏特异性的,妨碍了其在肝纤维化治疗中的应用.为了克服此缺点,国内外专家进行了大量实验研究,如流体力学为基础的研究,局部注射,细胞膜表面选择性配体和特异性启动子或增强子等,本文对RNA靶向干扰在肝纤维化应用进行综述.
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RNAi—一种关闭基因的新方法
RNA干扰(RNA interference,RNAi)在哺乳类细胞中是利用同源双链小型干扰RNA(small interference RNA,siRNA)诱导特异性基因表达抑制,它主要发生于转录后基因水平,所以又称为转录后基因沉默(post transcription gene silencing,PTGS),它的发生机制目前虽不十分清楚,但一些实验证实了其发生过程.双链RNA(double strand RNA,dsRNA)首先被切割为siRNA,siRNA与一些蛋白形成RNA引导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC),介导基因表达沉默.由于RNAi的特异性、高效性、方便性,已成为研究基因功能、肿瘤基因治疗、病毒感染基因治疗的新方法.
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敲低高尔基体α甘露糖苷酶2(GM2)增强BGC-823人胃癌细胞的黏附及机制
目的 通过敲低高尔基体α甘露糖苷酶2(GM2)基因的表达,探讨其对BGC-823人胃癌细胞黏附能力的影响.方法 设计并构建3个针对GM2基因的短发卡RNA(shRNA)质粒表达载体,同时合成阴性对照载体,并将其转染至BGC-823细胞,实时定量PCR和Western blot法检测转染后BGC-823细胞GM2mRNA及蛋白表达水平,筛选出敲低效果佳的质粒;再分别运用同质细胞黏附试验、细胞-基质黏附实验、内皮细胞黏附实验观察GM2基因敲低后对BGC-823细胞黏附能力的影响;同时采用Western blot法检测GM2基因敲低后上皮钙黏素(E-cadherin)、CD44v6、细胞间黏附分子1(ICAM-1)及P选择素(P-selectin)等黏附分子的蛋白水平.结果 与空白对照组及转染GM2-shRNA-NC组相比较,GM2-shRNA-2质粒可有效敲低GM2基因的表达;敲低GM2表达水平后,BGC-823细胞同质细胞之间黏附数目明显增加,而与基质和血管内皮细胞之间的黏附数目明显减少.敲低GM2基因表达后E-cadherin蛋白表达明显增加,P-selectin蛋白表达明显降低,而CD44v6和ICAM-1表达水平未见明显变化.结论 敲低GM2基因表达水平后,胃癌BGC-823细胞间的黏附能力增强,而与细胞外基质和血管内皮细胞之间的黏附能力减弱,可能与敲低GM2后E-cadherin表达上调,而P-selectin的表达下调有关.
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敲低趋化因子受体7(CCR7)抑制MG63骨肉瘤细胞的增殖和侵袭并诱导其凋亡
目的 研究小干扰RNA(siRNA)靶向抑制趋化因子受体7(CCR7)表达对MG63人骨肉瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响.方法 设计并合成靶向抑制CCR7表达的siRNA,转入MG63细胞后,采用Western blot法检测CCR7蛋白水平,异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexinV-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖,TranswellTM侵袭和迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力.结果 MG63细胞转染CCR7-siRNA后,细胞CCR7表达明显下调;同时细胞增殖明显减弱,侵袭和迁移能力明显下降,且细胞凋亡率升高.结论 下调MG63骨肉瘤细胞的CCR7,可明显抑制细胞增殖、侵袭和迁移,并能诱导细胞凋亡.
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下调含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1(UHRF1)的水平可抑制肾癌769-P细胞增殖并促进其凋亡
目的 利用针对含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1(UHRF1)的小干扰RNA(siRNA)在肾癌769-P细胞中下调UHRF1的表达,探讨其对769-P细胞增殖和凋亡的影响.方法 根据人UHRF1的mRNA序列设计并合成2对针对UHRF1的siRNA,用脂质体将其瞬时转染入769-P细胞.利用实时定量PCR检测UHRF1 mRNA的水平,Western blot法检测UHRF1的蛋白水平;利用MTT法检测细胞增殖,异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)染色结合流式细胞术检测细胞凋亡.结果 UHRF1 siRNA可显著抑制UHRF1的mRNA和蛋白水平,下调769-P细胞UHRF1水平后,细胞增殖显著减弱,细胞凋亡显著增加.结论 下调UHRF1的表达可抑制肾癌细胞的增殖并促进其凋亡.
