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大麦黄矮病毒运动蛋白核定位信号对PVX病毒运动的影响
应用马铃薯X病毒(PVX)载体研究大麦黄矮病毒运动蛋白(BYDV-MP)核定位信号对PVX病毒运动的影响.我们将BYDV-MP克隆到PVX改造载体pGR107中,同时用GFP作为指示蛋白,研究BYDV-MP对异源病毒PVX系统运动的影响.侵染烟草发现BYDV-MP能够在PVX载体中表达并能加强病毒的系统侵染；将PVX编码系统运动蛋白25kD基因进行缺失突变,重复上述试验发现BYDV-MP能够补偿PVX系统运动；将BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸和第七位氨基酸进行替换突变,侵染烟草发现BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸突变不能完全抑制PVX系统运动,但是可以延迟并减弱PVX系统运动；BYDV-MP的N端的第七位氨基酸突变能够完全抑制PVX系统运动.
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麻疹病毒沪191株反向遗传系统的建立
建立麻疹病毒沪191株(MV-S191)反向遗传系统.提取MV-S191的RNA,RT-PCR分7段扩增出麻疹病毒反基因组cDNA,通过酶切、连接,拼接出MV-S191全长反基因组,并分别在其3'端和5'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)和锤头核酸酶序列(HamRZ),克隆到pT7-MCS载体,获得pT7MVs191.在MV-S191的P-M基因间区域插入绿色荧光蛋白(GFP),获得pT7MVs191-ATU-GFP,同时构建表达麻疹病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的3个辅助质粒.将pT7MVs191、pT7MVs191-ATU-GFP分别与辅助质粒通过脂质体介导共转染BSRT7细胞,热休克3h.转染3d后,取上清,感染Vero-SLAM细胞.经RT-PCR、显微镜检测绿色荧光蛋白表达及合胞体形成,在该系统中成功拯救到两种有感染活性的病毒.成功建立了MV-S191的反向遗传系统,为以麻疹病毒为载体进行新疫苗的研发奠定了基础.
关键词： MV-S191 反向遗传 T7 RNA聚合酶 绿色荧光蛋白(GFP) -
内源性PS1在活体HEK293和HeLa细胞膜上的定位
目的 检测内源性PS1在活体细胞膜上的定位及其表达.方法 为防止细胞固定及通透使胞膜被破坏,在未经固定和通透的活体细胞上利用PS1抗体,通过间接免疫荧光法观察了内源性PS1在活细胞膜外表面的定位和表达；利用分子标签技术,构建GFP-PS1融合蛋白,瞬时转染细胞,检测到外源性PS1在细胞核膜的定位及在胞质中的少量分布；同时利用PS1抗体,将细胞固定及通透,用间接免疫荧光技术,检测到内源性PS1在细胞核膜中的定位及在细胞质中的少量不均匀分布.结果 内源性PS1在定位于亚细胞结构的膜同时,也定位于细胞外膜.结论 成功地在活体细胞外膜上检测到内源性PS1.
关键词： 早老素1基因 绿色荧光蛋白(GFP) 活体细胞 定位 -
5-HT_(1A)受体蛋白在PC12细胞膜转运的动态变化
目的 在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制.方法 运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT_(1A)基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中.采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293细胞中,通过G418筛选出稳定表达5-HT_(1A)-EGFP的PC12细胞系.运用激光共聚焦成像系统观察活细胞中5-HT_(1A)-EGFP的表达情况,利用光漂白荧光恢复(FRAP)技术在PC12细胞膜局部漂白后观察5-HT_(1A)-EGFP荧光蛋门在细胞膜上转运的情况.结果 克降所获得的小鼠5-HT_(1A)基因是准确的.5-HT_(1A)-EGFP蛋白清晰的分布于PC12和HKF293细胞膜上.通过FRAP技术观察到漂白区域的细胞膜在100 s内有部分恢复,说明受体在细胞膜上发生转运.结论 建立了稳定表达5-HT_(1A)-EGFP融合蛋白的PC12细胞系,并利用活细胞成像和FRAP技术观察分析并证实了5-HT_(1A)受体在PC12细胞的膜表面的表达和转运的动态变化.
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分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达
目的分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达.方法采用PCR方法在抗肝癌sFv的5端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌,在其下游连接人TNF-α基因,构建分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因,并将该基因克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体,用磷酸钙共沉淀法转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行瞬时表达.结果DNA序列分析证实在sFv的5端引入正确的60bp引导肽序列,酶切鉴定证明成功构建了分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体,并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白.结论成功构建并表达了分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP基因,为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
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绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体
目的利用基因工程技术,构建携带绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)标记的HIV(ENV-6C)基因的表达载体,并在E.coli BL21中高效表达.方法经核酸内切酶酶切、连接,构建重组表达载体pRSETB-HIV(ENV-6C)-GFP,通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹杂交技术(Western blot)分析重组结果,转化到E.coli BL21中,荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况.结果成功构建重组原核表达载体pRSETB-HIV(ENV-6C)-GFP,并在E.coli BL21中实现高效表达,检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV(ENV-6C).结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒(HIV)外壳蛋白的抗原活性,可用绿色荧光蛋白标记抗原,对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值.
关键词： 绿色荧光蛋白(GFP) 人类免疫缺陷病毒(HIV) 融和基因 高效表达 -
环境镉离子生物检测工程菌株的构建及应用
目的以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,和重金属镉特异性启动子PcadA构建成基因工程重组体,用于重金属镉的特异性检测.方法采用聚合酶链(PCR)方法从质粒pPcadA上扩增得到重金属镉离子特异性诱导启动子PcadA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,以大肠埃希菌-枯草杆菌穿梭载体pNW33N构建了绿色荧光蛋白镉离子诱导表达载体.以枯草芽孢杆菌1A751为宿主菌,采用感受态转化法将表达载体导入1A751,成功构建镉离子检测菌株.结果通过酶切鉴定、PCR和DNA序列分析,重组载体构建成功,并在有镉离子存在的环境中得到表达.结论该工程菌株能够以绿色荧光蛋白基因为报告基因检测培养体系中低浓度达0.1 μmol/L的镉离子;利用该菌株有望建立起一种方便快捷的重金属镉的检测方法,有较高的应用价值.
关键词： 镉 生物检测 绿色荧光蛋白(GFP) -
绿色荧光蛋白裸小鼠的培育及应用进展
绿色荧光蛋白(GFP)裸小鼠初是为肿瘤研究而培育,是同时具有T淋巴细胞缺陷和系统表达GFP基因的裸小鼠.近20年来,学者们对其生物学特性进行了广泛而深入的研究,为该小鼠模型的应用奠定了基础.
关键词： 绿色荧光蛋白(GFP) 裸小鼠 免疫学特性 肿瘤模型 -
瘦素与绿色荧光蛋白融合基因的合成及其高效表达
目的: 为了便于追踪瘦素(Leptin)在体内的去向,对其进行体内定位,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针.方法:用PCR技术将Leptin cDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中,构建成原核表达工程菌BL21(DE3)/pET3c-LG.用Western-blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用荧光显微镜观察融合蛋白及其诱导菌休的发光活性.结果:DNA测序结果证实设计合成的融合基因与预期一致;构建的工程菌BL21(DE3)/pET3c-LG获得了表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%以上;Western-blot杂交检测表明重组蛋白具有Leptin的免疫原性;经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到其能发射出强烈的绿色荧光.结论:融合基因在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的融合蛋白具Leptin的免疫原性和GFP的发光特性.为利用绿色荧光蛋白标记Leptin在动物体内的药物治疗的研究提供了一种新的途径.
关键词： 瘦素 绿色荧光蛋白(GFP) 融合基因 高效表达 -
抗肝癌单链免疫毒素在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达
目的构建分泌型抗肝癌单链免疫毒素真核表达载体并在人肝癌细胞系SMMC-7721中表达.方法采用PCR方法在抗肝癌sFv 的5′端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌,在其下游连接人TNF-α基因,构建分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因,并将该基因克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体,用磷酸钙共沉淀法转染人肝癌细胞系SMMC-7721进行瞬时表达.结果 DNA序列分析证实在sFv 的5′端引入正确的60 bp引导肽序列, 酶切鉴定证明成功构建了分泌型抗肝癌单链免疫毒素融合GFP真核表达载体,并在SMMC-7721细胞中成功地表达了融合荧光蛋白.结论成功构建并表达了分泌型抗肝癌单链免疫毒素融合GFP基因,为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
关键词： 肝细胞肝癌 免疫毒素 绿色荧光蛋白(GFP) 基因表达 -
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP),是一种极具应用潜力的标记物,有着极其广泛的应用前景.我们就GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述.
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p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达
目的构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体.方法将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体DEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察.结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中.结论成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具.
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HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.
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真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo的构建及其表达
目的:构建真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 并在HepG2细胞中进行表达.方法:PCR法扩增TK启动子克隆到pEGFP-N1上, 构建表达载体pTK-GFP/Neo.人工合成4个ARE序列, 经退火和磷酸化后插入pTK-GFP/Neo载体的TK启动子上游, 构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE调控的真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 将其转染入HepG2细胞株并筛选, 进行稳定表达.结果:成功构建了真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 并建立HepG2细胞稳定表达株.结论:成功地构建了由TK启动子启动以及上游有4个抗氧化反应元件(ARE)重复序列调控的真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 并在HepG2细胞中稳定表达, 为下一步研究ARE的调控作用奠定了基础.
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淋巴细胞特有重组激活基因蛋白载体构建及功能鉴定
目的:淋巴细胞特异性重组激活基因(RAG)蛋白1和2共同组成的RAG重组酶是造成淋巴细胞发育及产生抗体多样性的关键性蛋白.本研究构建并优化同时表达RAG1和RAG2的慢病毒载体,为研究RAG1和RAG2的结构和功能奠定基础.方法:构建同时表达RAG1、RAG2和绿色荧光蛋白(GFP)的载体;Western Blotting验证该载体RAG1和RAG2蛋白表达;体外重组实验证实该载体表达的RAG蛋白具有催化断裂DNA的功能.结果:构建了表达RAG重组酶的载体pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP;Western Blotting验证了该载体表达RAG1和RAG2蛋白,并显示该载体RAG1和RAG2蛋白的表达量具有较高的一致性.体外重组实验证实该载体表达的RAG1和RAG2组成的重组酶具有更好的催化断裂DNA的活性.结论:优化后的pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP载体可以保证RAG1和RAG2同时有效表达,GFP可作为荧光标记,为后续细胞以及动物实验奠定基础.
关键词： 载体优化 重组激活基因蛋白 P2A序列 绿色荧光蛋白(GFP) -
慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠卵巢的实验研究
目的:探讨慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因体外转染卵巢颗粒细胞的有效性及在体转染大鼠卵巢组织的佳剂量及时效性.方法:原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因(lenti-GFP)(MOI=20)体外转染颗粒细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.通过显微注射方法将不同转染剂量低剂量(2× 106 TU病毒颗粒,A组;高剂量:10× 106 TU病毒颗粒,B组;空白病毒载体,C组;空白对照组,D组)的lenti-GFP在体转染大鼠卵巢组织.于转染第5日观察各剂量组卵巢组织切片的GFP表达情况,确定佳转染剂量后,分别于转染第5日、第15日、第30日、第45日、第60日、第75日观察大鼠卵巢组织和全身其他组织器官GFP的表达.结果:体外转染实验中,在转染第5日可以观察到颗粒细胞内有GFP表达,并随着转染时间延长其表达量增多.体内转染大鼠卵巢第5日,不同剂量组大鼠卵巢均有明显GFP表达;A组与B组卵巢组织切片荧光强度分别为0.231±0.020及0.231±0.020;组间差异无统计学意义(P=0.976).以佳转染剂量(2× 106 TU病毒颗粒)转染,随转染时间的延长,GFP的表达量增加,于转染第30日时表达量达到峰值,并可持续高效表达至第75日(转染第5日、第15日、第30日、第45日、第60日、第75日卵巢组织荧光强度值分别为0.231±0.020、0.312±0.021、0.346±0.020、0.357±0.013、0.350±0.013及0.351±0.017).同时,大鼠全身其它组织器官均有GFP的高效持续表达.结论:lenti-GFP不仅可以在体外有效转染颗粒细胞,并且可以通过活体转柒大鼠卵巢后,在卵巢及其他组织器官均高效持续地表达.
