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麻疹病毒沪191株反向遗传系统的建立
建立麻疹病毒沪191株(MV-S191)反向遗传系统.提取MV-S191的RNA,RT-PCR分7段扩增出麻疹病毒反基因组cDNA,通过酶切、连接,拼接出MV-S191全长反基因组,并分别在其3'端和5'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)和锤头核酸酶序列(HamRZ),克隆到pT7-MCS载体,获得pT7MVs191.在MV-S191的P-M基因间区域插入绿色荧光蛋白(GFP),获得pT7MVs191-ATU-GFP,同时构建表达麻疹病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的3个辅助质粒.将pT7MVs191、pT7MVs191-ATU-GFP分别与辅助质粒通过脂质体介导共转染BSRT7细胞,热休克3h.转染3d后,取上清,感染Vero-SLAM细胞.经RT-PCR、显微镜检测绿色荧光蛋白表达及合胞体形成,在该系统中成功拯救到两种有感染活性的病毒.成功建立了MV-S191的反向遗传系统,为以麻疹病毒为载体进行新疫苗的研发奠定了基础.
关键词： MV-S191 反向遗传 T7 RNA聚合酶 绿色荧光蛋白(GFP) -
T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测人CEA
目的:建立检测人癌胚抗原(CEA)的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique,FACTT).方法:以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入T7RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时进行夹心酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测人CEA.结果:成功的建立了检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术,其检测CEA的灵敏度达2×10-3 mg/L,比夹心ELISA方法灵敏度(0.25 mg/L)高125倍.结论:T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较夹心ELISA方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的早期诊断.
关键词： T7 RNA聚合酶 荧光扩增技术 癌胚抗原 酶联接免疫吸附剂测定 -
T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测人CEA
目的 建立检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术.方法 以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入T7RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时进行夹心ELISA方法检测人CEA.结果 成功的建立了检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术,其检测CEA的灵敏度达2×10 -3 ng/ml,比夹心EL ISA 方法灵敏度高125倍.结论 T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较夹心ELISA方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的早期诊断.
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T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌细胞方法的建立及其意义
目的 探讨T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测循环血中结直肠癌细胞的可行性及其价值.方法 配制不同浓度的HT29细胞悬液并加入1×107个健康人外周血单核细胞,建立模拟结直肠癌循环肿瘤细胞的模型,从中分离出有核细胞后,加入生物素化抗CEA单克隆抗体(针对Gold抗原决定簇Ⅳ),孵育后加入亲和素-生物素-DNA分子,再加入T7 RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并用RT-PCR检测从模型中分离出的有核细胞中CEA mRNA的表达情况.结果 建立了检测结直肠癌细胞的T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术,低可从1×107个单核细胞中检出5个癌细胞,比RT-PCR低可从1×107个单核细胞中检出1×102个癌细胞更加敏感.结论 T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术可用于检测外周血中的循环肿瘤细胞,是一种敏感的检测结直肠癌细胞的方法.
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T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术检测结直肠癌患者外周血肿瘤细胞的临床意义
目的:探讨T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术检测结直肠癌患者术前外周血中循环肿瘤细胞的临床意义.方法:以CEA作为循环肿瘤细胞标志物,采用T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术,术前检测68例结直肠癌(结直肠癌组)及30例健康人(对照组)的外周血循环肿瘤细胞,并分析结直肠癌患者术前外周血中循环肿瘤细胞的检出率与临床病理特征的关系.结果:结直肠癌组总的循环肿瘤细胞检出率75.00%(51/68),57例无远处转移和11例有远处转移者检出率分别为70.20%(40/57)和100.00%(11/11).循环肿瘤细胞在结直肠癌组 Dukes A、B、C、D期检出率分别为36.36%(4/11)、68.42%(13/19)、85.19%(23/27)和100.00%(11/11),Dukes C+D期检出率明显高于Dukes A+B期(P<0.01).淋巴结转移者检出率为86.84%,而无转移者为60.00%,两者比较差异具有显著性统计学意义(P<0.05).对照组出现1例假阳性,此方法的特异性为97%.结论:采用T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞检出率较高,其术前检出率与肿瘤分期和淋巴结转移密切相关,对结直肠癌早期诊断及判断预后具有重要意义.
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T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌循环肿瘤细胞hTERT与临床病理的关系
目的 探讨T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(Cellular FACTT)检测人循环肿瘤细胞中hTERT表达与临床病理的关系.方法 Cellular FACTT法检测76例结直肠癌患者循环肿瘤细胞,与术后患者临床病理特征进行统计学分析.结果 76例结直肠癌患者CellularFACTT方法检测外周血循环肿瘤细胞阳性检出率与TNM分期、M分期相关及与肿瘤分化程度具有相关性.结论 T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术具有很高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的诊断,对判断结直肠癌预后、指导治疗具有一定临床意义.
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siRNA对Hela细胞表达VEGF的干涉作用
目的:研究体外转录合成的siRNA对Hela细胞中VEGF表达的干涉作用.方法:根据人VEGF 1～5外显子序列进行siRNA设计,应用T7 RNA聚合酶体外转录合成3条siRNA.并利用siPORT Lipid将siRNA转染入Hela细胞中,通过半定量RT-PCR和免疫荧光方法检测Hela细胞VEGF表达情况,评价不同序列siRNA对VEGF基因表达的干涉作用.结果:体外转录合成的3条siRNA均能高效地抑制Hela细胞中VEGF的表达,干涉效率分别为88.7%、94.2%和80.3%,而1个错配碱基的siRNA及ssRNA(+)未显现明显干涉作用.另外实验显示在5～10 pmol范围内,T7-siRNA对VEGF表达的抑制作用具有剂量依赖性.结论:利用T7 RNA聚合酶体外转录合成的siRNA可以高效干涉Hela细胞中VEGF的表达且具有良好的序列特异性,为肿瘤的基因治疗提供了新方法.
