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大麦黄矮病毒运动蛋白核定位信号对PVX病毒运动的影响
应用马铃薯X病毒(PVX)载体研究大麦黄矮病毒运动蛋白(BYDV-MP)核定位信号对PVX病毒运动的影响.我们将BYDV-MP克隆到PVX改造载体pGR107中,同时用GFP作为指示蛋白,研究BYDV-MP对异源病毒PVX系统运动的影响.侵染烟草发现BYDV-MP能够在PVX载体中表达并能加强病毒的系统侵染；将PVX编码系统运动蛋白25kD基因进行缺失突变,重复上述试验发现BYDV-MP能够补偿PVX系统运动；将BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸和第七位氨基酸进行替换突变,侵染烟草发现BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸突变不能完全抑制PVX系统运动,但是可以延迟并减弱PVX系统运动；BYDV-MP的N端的第七位氨基酸突变能够完全抑制PVX系统运动.
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马铃薯X病毒湖南分离物的鉴定与分组研究
从湖南石门采集表现重花叶症状的马铃薯叶片中分离纯化到一株线状病毒HN021.经双链RNA(ds-RNA)抽提、寄主反应测定、病毒粒子和内含体的形状观察, 初步确定该病毒为马铃薯X病毒 (Potato virus X).以ds-RNA作为模板,用相应引物对HN021分离物的ORF4-UTR-ORF5片段进行RT-PCR,得到1kb左右的双链cDNA片段.对该片段进行克隆和测序,并将测序所得的核苷酸序列与Genbank登录的11株不同分离物的相应片段的核苷酸序列进行同源性比较和分析.结果表明,HN021与分离自南美洲的三株分离物(COAT,KPA和HB)的同源性为78.4%~79.4%,与其它8株(分离自亚洲、欧洲、大洋州和北美洲)分离物的同源性为96.4%-97.8%.从氨基酸水平比较,HN021与COAT,KPA和HB三者CP和8kDa蛋白氨基酸序列同源性分别为86.5%~89.0%和74.3%~75.7%,相应地与其它8株分离物的同源性分别为97.1%-98.7% 和97.1%-100%.序列分析的结果证实了HN021分离物为马铃薯X病毒,同时表明PVX明显存在两个组(组Ⅰ和组Ⅱ),HN021和其它来自亚洲、欧洲、大洋州、北美洲分离物的组II,3个南美洲分离物属于组I.
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马铃薯X病毒分子生物学研究进展及其作为表达载体的应用
马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)又称马铃薯潜隐病毒(Potato latent virus)或马铃薯轻花叶病毒(Potato mild mosaic virus),是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的模式成员,遍布于全世界马铃薯种植区.受侵染叶片呈花叶症状,田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产.
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7种RNA沉默抑制子对植物病毒载体表达系统表达水平的影响
目的 探索不同植物病毒RNA沉默抑制子对植物病毒载体表达系统重组蛋白表达水平的作用,为合理高效地利用这一新型的外源基因表达平台奠定基础.方法 构建了7种不同的RNA沉默抑制子瞬时表达载体,以农杆菌渗滤法,与马铃薯X病毒表达载体PVXdt-GFP共侵染寄主植物本明烟,通过对报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的荧光观察,并以Western blotting、ELISA 和RT-qPCR等测定GFP在烟草中的表达情况,分析不同RNA沉默抑制子对植物中外源基因表达水平的作用和特点.结果 7种病毒RNA沉默抑制子对外源基因GFP在烟草中表达水平的作用效果和持续时间存在差异,其中,番茄丛矮病毒的P19蛋白的增效作用好,作用时间也长；非洲木薯花叶病毒的AC2蛋白和水稻黄斑驳病毒的P1蛋白无明显的增效作用.结论 RNA沉默抑制子可以通过抑制病毒诱导的RNA沉默来提高外源基因在植物中的表达水平和表达持续时间,但是不同的植物病毒载体表达系统需要通过筛选获得其佳的共表达沉默抑制子“伴侣”.
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口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析
目的:筛选出高抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)抗原表位组合体, 为能有效启动细胞免疫、高广谱性的口蹄疫植物疫苗的研究提供研究基础.方法:通过化学方法合成O、 A型口蹄疫病毒的5个T细胞表位基因和2个B细胞表位基因单链, 采用套叠PCR的方法将T或是B细胞表位基因分别融合成融合体T或B, 利用同尾酶的性质将融合体T和B连接成3种不同融合方式的串连体, 即5′-T-B-T-3′、 5′-T-T-B-3′和5′-B-T-T-3′; 利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)载体在烟草叶片中表达各串连体基因、融合体T基因、融合体B基因和O型口蹄疫病毒的VP1基因; RT-PCR检测各基因在烟草(N.benthamiana)叶片中的转录水平; 间接ELISA及Western Dotblot 检测表达产物的抗原性.结果:各抗原基因在烟草叶片中成功获得了表达, 表达产物的抗原性因不同的融合方式而呈现差异, 其中以5′-T-B-T-3′的融合方式为高, 5′-B-T-T-3′次之, 再是5′-T-T-B-3′, 但都高于VP1基因的表达产物, 更高于融合体T或B基因的表达产物.结论:通过融合口蹄疫病毒的多个表位基因有可能找到一种研制有效启动细胞免疫反应广谱抗口蹄疫病毒的基因工程疫苗的方法, 且T、 B细胞表位的不同组合方式对免疫活性很可能存在一定的影响.
