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葛根芩连汤对2型糖尿病模型大鼠胰岛细胞IRS-2/PI3K-Akt通路的影响
目的 探讨葛根芩连汤保护2型糖尿病大鼠胰岛细胞的可能作用机制. 方法 24只雄性ZDF(fa/fa)大鼠给予高脂饲料诱导2型糖尿病模型,造模成功后随机分为葛根芩连汤组、二甲双胍组、模型组,每组8只.8只雄性ZDF(fa/+)大鼠设为正常组.模型组、正常组给予生理盐水10 ml/kg灌胃,葛根芩连汤组给予葛根芩连汤13.8g/kg灌胃,二甲双胍组给予盐酸二甲双胍肠溶片300 mg/kg灌胃.给药8周后检测空腹血糖(FPG),采用蛋白免疫印迹法检测胰腺胰岛素受体底物2(IRS-2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) p85、蛋白激酶B(Akt2)、磷酸化胰岛素受体底物2(p-IRS2)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K) p85、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt2)的蛋白表达.实时荧光定量PCR法检测胰腺IRS-2、PI3K p85与Akt2 mRNA表达.ELISA法测定空腹胰岛素(FINS)含量,免疫抑制比浊法测定糖化血红蛋白(HbA1c)的百分含量. 结果 与模型组比较,葛根芩连汤组FPG、FINS水平及HbA1c下降,IRS-2、PI3K p85、Akt2、p-IRS2、p-PI3K p85、p-Akt2蛋白表达上升,IRS-2、PI3K p85和Akt2 mRNA表达上升(P＜0.05或P＜0.01). 结论 葛根芩连汤可能是通过提高IRS-2/PI3K-Akt信号转导通路的活性起到保护胰岛β细胞的作用.
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蛋白激酶B通过调控低氧诱导因子-1表达干预人肝癌细胞系SMMC-7721增殖
目的 研究与分析敲低蛋白激酶B(PKB/AKT)对低氧诱导因子-1( HIF-1)表达及肝癌细胞增殖的影响.方法 随机将人肝癌细胞系 SMMC-7721 分设5 组:空白对照( BC)组、阴性对照( siRNA-NC)组、HIF-1 siRNA 转染(HIF1-siRNA)组、AKT siRNA转染(AKT-siRNA)组和HIF-1 AKT siRNA转染(HIF1-AKT-siRNA)组.用倒置荧光显微镜观察转染效率;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Western blot检测HIF-1蛋白的表达.结果 转染效率均达到90%以上.与siRNA-NC组相比较,HIF1-siRNA组、AKT-siRNA组和 HIF1-AKT-siRNA组的细胞增殖抑制率均升高,HIF-1蛋白表达水平均下降(P<0. 05);与HIF1-AKT-siRNA组比较,HIF1-siRNA组和AKT-siRNA组的细胞增殖抑制率均下降,HIF-1蛋白表达水平均升高(P<0. 05);与HIF1-siRNA组比较, AKT-siRNA组的细胞增殖抑制率下降,HIF-1蛋白表达水平升高(P<0. 05).各组HIF-1蛋白表达水平与细胞增殖抑制率存在负相关关系( r=-0. 874, P<0. 05).结论 敲低HIF-1、AKT表达均可抑制人肝癌细胞系SMMC-7721增殖;HIF-1可能是肝癌细胞增殖的主要决定因子, HIF-1表达水平下调可抑制肝癌细胞增殖;敲低AKT表达可降低HIF-1表达水平,并协同HIF-1低表达的抑肝癌细胞增殖作用.
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miR-145抑制人肝内胆管细胞癌细胞增殖
目的 研究miR-145调节人肝内胆管细胞癌(ICC)细胞增殖的机制.方法 收集标本ICC癌组织和癌旁胆管组织,共38对;2种ICC细胞系:HuCCT-1和RBE;对其进行miR-145及NUAK1的表达调控.通过RT-qPCR检测miR-145和新式激酶家族1(NUAK1)的表达及两者相关性;检测细胞周期观察细胞增殖变化;荧光素酶报告基因实验确认miR-145的靶基因;Western blot观察AKT通路蛋白水平变化.结果 miR-145在癌组织的表达明显低于癌旁组织(P<0.05),NUAK1在癌组织的表达明显高于癌旁组织(P<0.05),两者具有相关性(P<0.05).miR-145过表达组和NUAK1干扰组细胞计数均明显少于对照组(P<0.05);HuCCT-1细胞系转染miR-145 mimics后,G1期的细胞数明显增加(P<0.05);野生型的荧光信号明显被抑制(P<0.05);过表达miR-145或抑制NUAK1后,pAKT和pFOXO1表达明显下降(P<0.05).结论 miR-145可能通过抑制NUAK1及其下游通路抑制ICC细胞增殖,它有可能为ICC临床诊治提供新的靶点和思路.
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MiR-139-5 p通过靶向CXCR4/PI3 K/Akt信号通路增强鼻咽癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性
目的 探讨miR-139-5p对鼻咽癌顺铂(DDP)耐药细胞DDP敏感性的影响及其相关作用机制.方法 培养鼻咽癌DDP耐药细胞株HNE1/DDP,分为miR-139-5p组、阴性对照组、DDP组和空白对照组,miR-139-5p组转染miR-139-5p类似物,阴性对照组转染阴性对照序列,DDP组和空白对照组不做转染处理.转染后miR-139-5p组、阴性对照组和DDP组均加入20μmol/L DDP,空白对照组加入培养基,溴化吡啶(PI)单染后流式细胞术检测各组HNE1/DDP细胞凋亡率.采用Western blot检测HNE1/DDP细胞miR-139-5p组、阴性对照组和空白对照组磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt及趋化因子受体4(CXCR4)蛋白的相对表达水平.采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-139-5p组、阴性对照组和空白对照组CXCR4 mRNA的表达水平.结果 空白对照组、DDP组、阴性对照组和miR-139-5p组HNE1/DDP细胞凋亡率分别是6.26％ ±1.19％、22.43％ ±3.88％、23.87％ ±3.21％和40.87％ ±4.04％,DDP组、阴性对照组和miR-139-5p组细胞凋亡率均高于空白对照组,miR-139-5p组细胞凋亡率高于DDP组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.05).Western blot检测显示,miR-139-5p组p-Akt、p-PI3K、PI3K及CXCR4蛋白的相对表达量均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.01).实时荧光定量PCR检测结果显示,miR-139-5p组中HNE1/DDP细胞CXCR4的mRNA相对表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.01).结论 转染miR-139-5p可提高鼻咽癌耐药细胞株HNE1/DDP对DDP的敏感性,其作用机制可能与抑制CXCR4的表达进而调控其下游PI3K/Akt信号通路的活化有关.
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蛋白激酶B在佛波酯诱导人胃癌细胞系凋亡中的作用
目的 讨佛波酯(TPA)诱导胃癌细胞系凋亡过程中蛋白激酶B(PKB)的作用.方法 通过BrdU处理,流式细胞术检测以及DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌BGC-823细胞的影响;免疫印迹法检测TPA对PKB蛋白表达水平、磷酸化的影响;核浆分离获得核浆蛋白,用于免疫印迹法检测TPA对胃癌细胞内PKB和其Ser 473位点磷酸化的核浆表达影响,以及激光扫描共焦显微镜观察TPA是否改变胃癌细胞内PKB的分布. 结果TPA诱导BGC-823细胞凋亡;TPA下调BGC-823细胞内PKB蛋白表达,并且与TPA作用时间和TPA浓度呈正相关,与PP2A降解作用无关;TPA抑制PKB的Ser 473位点磷酸化,而对其Thr 308位点磷酸化没有明显影响;TPA下调细胞核内PKB的表达以及Ser 473位点的磷酸化;TPA并不改变PKB在胃癌细胞内的分布. 结论 PKB的抑制作用可能参与TPA诱导胃癌细胞凋亡过程;由TPA诱导的胃癌细胞凋亡可能部分是由于细胞核内PKB蛋白表达和Ser 473位点磷酸化下降所致.
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碱性成纤维细胞生长因子对人胚肾HEK293细胞蛋白激酶B活性的影响
目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人胚肾HEK293细胞蛋白激酶B(PKB)活性的影响.方法以[γ-32P]ATP掺入法观察不同作用时间bFGF对HEK293细胞膜、胞浆PKB活性的影响. 结果75μg/LbFGF刺激HEK293细胞10 min,使胞液和膜性PKB酶活性达高峰.Wortmannin预处理后,HEK293细胞膜和胞浆PKB活性在各时间点均明显降低. 结论bFGF能通过PI3K途径迅速激活HEK293细胞的PKB活性.
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羧基末端调节蛋白与肿瘤、缺血性损伤及代谢综合征
羧基末端调节蛋白(carboxyl-terminal modulator protein,CTMP)是一核编码的线粒体蛋白,表达于神经、胰腺、肾脏等多种组织.病理条件下羧基末端调节蛋白转位于胞浆,结合并抑制蛋白激酶B活性、与热休克蛋白-70相结合并解除该分子对凋亡因子的限制作用,进而参与细胞凋亡、代谢的调控.研究还发现,羧基末端调节蛋白参与线粒体动力学调节;其羧基端具有硫酯酶活性,又被称为硫酯酶超家族成员4.本文旨在阐述羧基末端调节蛋白的分子结构及其在肿瘤、缺血性损伤和代谢综合征中作用之研究进展.
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蛋白激酶B及其在磷脂酰肌醇3-激酶介导的信号转导中的作用
蛋白激酶 B(PKB)是原癌基因 c-akt 的表达产物,它参与由生长因子激活的经磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介导的信号转导过程.与许多蛋白激酶相似,PKB 分子具有一特殊的AH/PH 结构域(AH/PH domain),后者能介导信号分子间的相互作用.PKB是PI3K直接的靶蛋白.PI3K 产生的脂类第二信使PI-3,4,-P2和PI-3,4,5-P3等均能与PKB和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)的AH/PH 结构域结合,使二者转位于质膜上并活化.PDK 也能使PKB 磷酸化而激活,激活的 PKB 又进一步激活抗细胞凋亡机制、葡萄糖代谢(糖原合成、糖酵解及葡萄糖的摄取)及蛋白质合成等过程,从而促进细胞的生长和增殖.
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整合素蛋白连接激酶和蛋白激酶B在急性白血病中的表达及意义
本研究探讨整合素蛋白连接激酶(ILK)和蛋白激酶B(PKB/Akt)在不同类型和疾病阶段的急性白血病(AL)患者中的表达,研究ILK/Akt通路在AL发病中的可能作用.应用RT-PCR法检测不同类型初治、复发及完全缓解AL患者和正常对照者骨髓单个核细胞中ILK mRNA和Akt mRNA的表达.结果表明,ILK和Akt在初治AL患者中的表达高于完全缓解组和正常对照组(P＜0.05),在初治组与复发组中的表达差异无统计学意义(P＞0.05).ILK和Akt的表达在AL中呈正相关性.结论:ILK和Akt在AL中异常高表达,而ILK/Akt信号通路可能参与了AL的发生发展,有可能成为AL治疗的新靶点.
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雷帕霉素对氧化低密度脂蛋白刺激血管平滑肌细胞信号转导的抑制作用
目的探讨氧化低密度脂蛋白(oxLDL)促血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及分泌功能改变的细胞内信号转导机制及雷帕霉素(rapamycin)干预作用. 方法培养兔血管平滑肌细胞分为7组处理.以直接细胞计数及噻唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖能力;酶联免疫法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)水平;Western免疫印迹法定量蛋白激酶B(PKB)表达水平;免疫沉淀、特异底物组蛋白H2B γ32P掺入量测定PKB活性. 结果 oxLDL使细胞增殖指标增加1.62～3.2倍,细胞因子分泌增加3～5倍,PKB活性增加11.8倍.而相同浓度的低密度脂蛋白对细胞增殖及细胞因子分泌无明显影响.磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)特异性抑制剂沃漫青霉素(Wortmannin, WT)及雷帕霉素均可显著抑制VSMC增殖、细胞因子分泌及PKB活性,并完全逆转oxLDL的上述作用. 结论 PI3K/PKB是oxLDL促VSMC增殖及分泌功能的信号通路之一.雷帕霉素可能通过抑制PI3K/PKB对VSMC生物学功能发挥较全面调控效用.
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心肺复苏大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B和磷酸化cAMP应答元件结合蛋白表达的变化及APP17肽的影响
目的 探讨心肺复苏后大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)、磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(phosphorylation of cAMP respouse element binding protein,p-CREB)表达的变化,以及APP17肽对它们的影响.方法 实验地点在宣武医院神经变性病学重点实验室.雄性Wistar大鼠21只,随机分3组,每组7只:假手术对照组(A组)、心肺复苏组(B组)、心肺复苏+APP17肽组(C组).自主呼吸循环恢复(return of spontaneous circulation,ROSC)标准为心电图出现正常的QRS波群,心室内压≥60 mmHg,持续10 min以上;夹闭气管制作大鼠心跳呼吸停止模型,行心肺复苏.当大鼠出现ROSC时,复苏组静脉注射生理盐水;APP17肽组静脉注射APP17肽10μg·(300 g)~(-1).对照组行假手术,静脉注射生理盐水.维持生命体征至2 h,断头取脑,行冰冻切片.应用免疫组化法观察3组大鼠复苏2 h后海马神经元PI3K,PKB,p-CREB表达情况;三组中各取1只大鼠于ROSC后2 h,分离海马;应用Western-blot方法测定海马神经元PKB,p-CREB蛋白含量.数据以均数±标准差((x)±s)表示,组间数据用方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 免疫组化法显示:B组PI3K阳性细胞表达为(2.75±1.80),略高于A组(2.53±1.53),差异没有统计学意义;而C组为(5.85±2.83),较B组增加,差异具有统计学意义(P<0.01).B组PKB和p-CREB阳性细胞分别较A组明显减少[(2.45±1.36)vs.(5.22±2.50),(P<0.05);(2.41±1.11)vs.(8.31±3.02),P<0.01];C组PKB和p-CREB阳性细胞分别较B组增高[(9.66±4.32)vs.(2.45±1.36),P<0.01;(14.18±3.96)vs.(2.41±1.11),P<0.01].Western-blot法测定PKB,p-CREB蛋白含量B组较A组明显减少;C组较B组明显增加.结论 心肺复苏大鼠ROSC 2 h海马神经元PKB,p-CREB表达降低,APP17肽能恢复神经元PI3K,PKB,p-CREB的表达,对心肺复苏后海马神经元损伤有保护作用.
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CD151对心肌梗死血流动力学的影响及其信号机制
目的 探讨CD151对大鼠心肌梗死模型血流动力学的影响及其分子学机制.方法 制作大鼠心肌梗死模型,将携带人CD151基因的重组腺病毒相关病毒(rAAV)载体注入缺血心肌.4周后,心导管测定心脏功能,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测外源性CD151 mRNA的表达,Western blot检测CD151、PI3K、Akt的表达.结果 心肌梗死后左室功能明显下降,CD151高表达能够明显改善左室功能,并可上调磷脂酰肌醇3-激酶和磷酸化的蛋白激酶B的表达.结论 CD151基因的导入能够改善心室功能,其分子机制与PI3K/Akt信号通路的激活有关.
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有氧运动对胰岛素抵抗大鼠脂肪组织蛋白激酶B表达的影响
目的在高脂饮食诱导胰岛素抵抗的基础上,观察有氧运动对胰岛素抵抗大鼠脂肪组织中蛋白激酶B(PKB)表达的影响.方法选取雄性Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组10只,给予基础饲料;模型组20只,给予高脂饲料喂养4周后,再随机分为胰岛素抵抗组(继续高脂饮食)和运动处理组(高脂饮食+游泳运动).干预6周后,采用蛋白印迹法检测大鼠脂肪组织中胰岛素刺激PKB表达的含量.结果在胰岛素抵抗状态时,大鼠脂肪组织PKB表达明显减少,较对照组下降23.5%( P＜0.01);6周游泳运动后,运动组大鼠PKB表达明显增加,较胰岛素抵抗组增加19.2%( P＜0.01).结论运动能改善胰岛素抵抗,可能与增加脂肪组织中PKB表达有关.
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磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达
目的 观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达及变化情况.方法 96只健康Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组、PI3K抑制剂LY294002组及p-mTOR抑制剂雷帕霉素组,每组又分为模型制备成功后4 d和8 d两个亚组,每个亚组12只.后三组颈背部皮下注射鱼藤酮制作帕金森病大鼠模型,相应时间点免疫组化及Western blotting检测大鼠黑质区PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达.结果 与假手术组比较,模型组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P<0.05),8 d亚组高于4 d亚组(P<0.05).与模型组比较,LY294002组各时间点p-Akt、p-mTOR蛋白表达减少(P<0.05),PI3K蛋白表达无明显变化(P>0.05);雷帕霉素组各时间点p-mTOR蛋白表达下降(P<0.05),PI3K、p-Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05).结论 黑质PI3K/Akt/mTOR信号通路激活可能是帕金森病发生、发展的重要机制之一.
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槲皮素对高糖培养海马神经元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
目的 探讨槲皮素对高糖培养海马神经元凋亡影响的可能作用机制.方法 新生24 h Sprague-Dawley大鼠,取海马神经元原代培养,分为正常对照组、高糖组、槲皮素组、槲皮素+Akt抑制剂组和Akt激动剂组.各组在不同条件培养基中培养72 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blotting检测各组神经元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 与正常对照组相比,高糖组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显减少(P<0.01);与高糖组比较,槲皮素组、Akt激动剂组细胞凋亡率明显下降(P<0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显升高(P<0.01).与槲皮素+Akt抑制剂组比较,槲皮素组细胞凋亡率明显下降(P<0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显升高(P<0.01).结论 槲皮素能够减少高糖培养下海马神经元的凋亡,其作用机制与增加Akt信号通路中Akt蛋白磷酸化的程度,进而增加Bcl-2蛋白的表达、抑制Bax蛋白的表达有关.
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运动干预对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌蛋白激酶B活性和蛋白与基因表达的影响
目的:探讨一次性游泳运动对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌蛋白激酶B(protein kinaes,PKB)mRMA表达、蛋白总量(t- PKB)及磷酸化PKB(p-PKB)的影响.方法:SD大鼠随机分为正常饮食组、高脂饮食组、高脂饮食+运动组.分别对高脂饮食组与高脂饮食+运动组饲以高脂饲料,4周后对高脂饮食+运动组大鼠运动干预2h.测血液葡萄糖和胰岛素浓度:Western blot法检测骨骼肌t-PKB蛋白表达、p-PKB磷酸化水平;RT-PCR法分析PKB mRNA表达.结果:高脂饮食组血糖和胰岛素浓度明显高于对照组;高脂饮食+运动组血糖和胰岛素浓度低于高脂饮食组;高脂饮食组PKB mRNA表达下降:高脂饮食+运动组PKB磷酸化水平和蛋白总量高于高脂饮食组.结论:运动干预改善高脂饮食诱发胰岛素抵抗大鼠对胰岛素的敏感性,增加PKB磷酸化水平和蛋白与基因的表达.
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运动对大鼠骨骼肌胰岛素信号转导蛋白表达和活性的影响
目的:观察运动对大鼠骨骼肌中胰岛素信号转导蛋白表达和活性的影响,探讨运动调节骨骼肌葡萄糖转运的细胞内机制.方法:将20只SD大鼠随机分为运动组和对照组,运动组按Ploug方法进行8w的游泳训练.结果:运动组大鼠游泳8w后骨骼肌中蛋白激酶B蛋白表达和磷酸化程度均增加,细胞外信号调节激酶蛋白表达有上升趋势,磷酸化程度显著增加.结论:运动可激活正常骨骼肌中胰岛素信号传递两大途径中的关键蛋白,这可能是运动增强骨骼肌的胰岛素敏感性,促进葡萄糖转运的机制之一.
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Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶、蛋白激酶B在食管鳞癌组织中表达的临床意义及其相关性
目的 探讨Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶(INPP4B)及蛋白激酶B(Akt)在食管鳞癌组织中表达的临床意义及其相关性.方法 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测32例食管癌患者的癌组织及相应的癌旁组织中(距癌组织>5 cm)中INPP4B mRNA的表达情况,并分析其与食管癌临床病理特征之间的关系.采用免疫组织化学SP法检测70例食管癌组织及20例正常食管上皮组织中INPP4B、Akt蛋白的表达情况,并分析与食管癌临床病理特征的关系及其之间的相关性.结果 与癌旁组织相比,32例食管癌组织中INPP4B mRNA表达水平上调的比例为65.5％(P<0.05).INPP4B mRNA的表达水平与食管癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、有无淋巴结转移及TNM分期均无相关性(P>0.05).在70例食管癌组织中及20例正常食管上皮组织中,INPP4B蛋白的阳性表达率显著高于正常食管组织(67.1％vs 40.0％,P<0.05),Akt蛋白的阳性表达率显著高于正常食管组织(72.8％vs 25.0％,P<0.05).INPP4B蛋白的表达水平与食管癌患者的年龄、性别及临床病理特征无明显相关(均P>0.05);Akt蛋白的表达水平与肿瘤直径、分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期均有关(均P<0.05).INPP4B与Akt蛋白表达呈正相关(r=0.531,P=0.000).结论 INPP4B在食管鳞癌组织中的表达上调,INPP4B可能通过激活Akt的活化从而在食管癌中起着癌基因的作用,其可能成为食管癌靶向治疗的一个新的靶点.
关键词： 食管鳞癌 Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶 实时荧光定量PCR 免疫组织化学 蛋白激酶B -
辛伐他汀对大鼠心肌细胞肥大及蛋白激酶B表达的影响
目的观察辛伐他汀对血清诱导培养大鼠心肌细胞肥大的影响,探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB)途径在辛伐他汀调控心肌细胞肥大中的信号转导作用.方法以培养的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌细胞为实验模型,应用图像分析系统测定心肌细胞表面积,[3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测心钠素(ANP)mRNA表达,RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PKB的mRNA和蛋白表达水平.结果(1)15%血清组干预24 h后心肌细胞表面积(1611.16±160.75)μm2显著高于无血清对照组(538.04±118.60)μm2,并有统计学意义(P＜0.01);给予辛伐他汀和血清共同干预后,随着辛伐他汀浓度的增加,心肌细胞表面积呈递减趋势,其中10-5mol/L和10-6mol/L组分别为(799.84±167.70)μm2和(1076.88±199.28)μm2,均显著低于血清组(P＜0.01).(2)在15%血清刺激后,心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率为(2360±106)计数/min·孔,明显高于无血清对照组(1305±92)计数/min·孔,并有统计学意义(P＜0.01);10-5和10-6mol/L辛伐他汀组[3H]-亮氨酸掺入率分别为(1707±101)计数/min·孔和(1962±125)计数/min·孔,均较血清组明显降低(P＜0.01).(3)随着辛伐他汀浓度的增加,心肌细胞ANP的mRNA表达水平逐渐降低,其中10-5和10-6mol/L辛伐他汀组分别为0.29±0.03和0.40±0.03,与单纯血清干预组(0.60±0.03)比较明显降低,差异非常显著(P＜0.01).(4)心肌细胞PKB的mRNA和蛋白表达水平均随辛伐他汀浓度的增加而呈递减趋势,其中10-5、10-6mol/L辛伐他汀组PKB mRNA表达水平为0.28±0.02和0.36±0.03,明显低于血清干预组(0.51±0.03),并有统计学意义(P＜0.01).上述两组PKB蛋白表达水平分别为42.41±2.83和45.68±3.43,也较血清组(60.80±3.49)显著降低(P＜0.01).结论辛伐他汀能够抑制血清诱导的心肌细胞肥大,PKB表达水平下调可能是其分子生物学机制之一.
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多巴胺D4受体对糖尿病血管内皮损伤的保护作用
目的 研究多巴胺D4受体对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用及相关机制.方法 构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,Western blot法检测内皮组织D4受体表达的变化.以体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为靶细胞,测定在高糖(33 mmol/L)刺激下细胞的活力,同时检测D4受体表达变化;用高糖刺激HUVEC后,在D4受体激动剂PD168077(10-7 mol/L)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002(5×10-5 mol/L)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(l-NAME) (10-4 mol/L)分别作用的情况下,检测HUVEC细胞活力水平的变化,并检测细胞中蛋白激酶B(Akt)和eNOS的磷酸化水平以及总的Akt和eNOS表达水平.结果 D4受体在糖尿病大鼠胸主动脉内皮组织和HUVEC的表达下降(均P＜0.05).高糖条件下,HUVEC的细胞活力下降(P＜0.05);与高糖组比较,加入PD168077后HUVEC的细胞活力增加(P＜0.05).在LY294002和l-NAME的作用下,HUVEC的细胞活力下降(P＜0.05);同时,p-Akt[高糖+LY294002+ PD168077组(0.59±0.09),高糖+l-NAME+ PD168077组(0.62±0.07),高糖+PD168077组(1.44±0.07),P＜0.05]和p-eNOS[高糖+LY294002+ PD168077组(0.62±0.05),高糖+l-NAME+PD168077组(0.66土0.08),高糖+PD168077组(1.44±0.08),P＜0.05]的蛋白表达水平也降低.结论 多巴胺D4受体可以改善高糖诱导的HUVEC的损伤,该作用可能与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关.
