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PI3K/AKT信号通路在CTGF促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用
目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路是否介导结缔组织生长因子促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化.方法:体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,实验分3组:①空白对照组;②结缔组织生长因子(10ng/ml)刺激组;③磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002(10μmol/L)预处理后结缔组织生长因子刺激组.应用免疫印迹技术检测48h后a-平滑肌肌动蛋白的表达,应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率.结果:和空白对照组相比,结缔组织生长因子刺激组细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高;经磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002预处理后,再以结缔组织生长因子刺激,细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高水平下降,经统计学分析,差别具有显著性(P＜0.05).结论:结缔组织生长因子能够促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化,磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路介导该效应,磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002可抑制此效应.
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蛋白激酶B与乳腺癌的新研究进展
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶即蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)是细胞内重要的激酶之一,它能够通过接受整合多种细胞外信号产生多种生物学效应,包括对细胞增殖、迁徙、生长、周期、能量代谢、死亡等多方面的影响.Akt在乳腺癌发展过程中的作用成为研究热点.现就近两年来Akt与乳腺癌的重要研究成果予以综述.
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EGFR-AKT信号通路下调肺癌细胞miR-145的表达
目的:研究人肺癌细胞中EGFR的活化对miR-145表达的影响及其可能的分子机制.方法:选择人肺癌细胞株H1975,采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞中miR-145的表达水平和EGFR的活化水平.分别以EGF、特异性EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478、AKT小分子抑制剂LY294002和AKT siR-NA处理H1975细胞,观察细胞miR-145的表达情况.结果:肺癌细胞中活化的EGFR下调miR-145的表达,EGF可下调肺癌细胞内miR-145表达,AG1478可逆转EGFR活化所诱导miR-145的下调.EGFR活化后激活下游信号蛋白分子AKT,LY294002抑制AKT活化而恢复EGFR活化所诱导的miR-145下调.AKTsiRNA下调AKT蛋白表达,降低pAKT的表达,进而上调miR-145表达.结论:在肺癌细胞中,EGFR可通过AKT信号分子下调miR-145的表达.
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卵巢癌患者血清中 IGF1、IGF1R 及 AKT 表达、血清 CA125 半衰期与耐药的关系
目的:检测IGF信号通路关键蛋白IGF1、IGF1R及AKT在顺铂耐药卵巢癌患者血清中的表达,检测血清CA125的动态变化,探讨与卵巢癌耐药患者预后的关系.方法:利用ATP-TCA法对40例卵巢癌标本进行药敏试验,其中16例对顺铂耐药,24例对顺铂敏感,ELISA法分别检测顺铂耐药和敏感组患者血清中IGF1、IGF1R及AKT的表达.采用微粒子捕捉免疫发光技术(MEIA)测定40例卵巢上皮癌患者治疗前、手术前及手术后7-14天、每疗程化疗后血清中CA125浓度,计算CA125半衰期,探讨与预后的关系.结果:IGF1、IGF1R及AKT在卵巢癌顺铂耐药组的表达显著高于敏感组(P值均为0.0001),顺铂耐药患者CA125半衰期与敏感组患者相比有统计学意义.结论:IGF信号通路关键蛋白IGF1、IGF1R及AKT可能参与卵巢癌顺铂耐药,CA125半衰期联合IGF1、IGF1R及AKT检测可早期预测卵巢癌化疗耐药.
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ILK与PKB在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义
目的 探讨整合素连接激酶(ILK)和蛋白激酶B(PKB)在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达及临床病理意义.方法 采用免疫组织化学SP染色技术测定8例正常脑组织及51例脑胶质瘤组织中ILK和PKB的表达. 结果ILK和PKB蛋白在正常脑组织中均阴性表达,而在各级别胶质瘤组织中均有不同程度的表达,并随着胶质瘤恶性程度的增高,ILK和PKB表达的阳性细胞率逐渐增高,其在高级别胶质瘤中的表达明显高于低级别胶质瘤(P<0.05).在胶质瘤中ILK和PKB蛋白表达呈显著正相关(r=0.95, P<0.05).结论 ILK和PKB蛋白在脑胶质瘤中的表达与肿瘤的临床病理分级密切相关,可能参与胶质瘤的发生发展,联合检测有助于判断胶质瘤恶性程度及预后.
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表皮生长因子通过EGFR/AKT信号通路对视网膜色素上皮细胞增殖和迁徙的影响
目的:探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖和迁徙的影响.方法:体外培养人RPE细胞株(ARPE-19细胞),给予不同浓度 EGF 处理 ARPE-19细胞,通过噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 实验、5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)吸收实验和细胞划痕实验检测EGF对ARPE-19细胞活力、增殖和迁徙的影响;通过Western blot法检测EGF对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)蛋白表达的影响.结果:MTT 实验显示50、100ng/mL EGF 处理12h 诱导ARPE-19细胞活力增加;BrdU吸收实验显示100ng/mL EGF处理24h诱导BrdU染色阳性ARPE-19细胞数增加;细胞划痕实验显示100ng/mL EGF处理24h可以诱导ARPE-19细胞迁徙能力增加.Western blot检测显示使用10~100ng/mL EGF处理细胞12h或者100ng/mL EGF处理细胞15~180min均可以诱导磷酸化EGFR(pEGFR)表达升高和总EGFR表达降低,同时也可以诱导磷酸化AKT(pAKT)表达升高,但是对总AKT表达无显著影响.结论:EGF通过EGFR/AKT信号通路增加RPE细胞的活力、增殖和迁徙能力,可能对增殖性玻璃体视网膜病变中RPE细胞的异常增殖和迁徙起到重要作用.
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层黏连蛋白促进人晶状体上皮细胞蛋白激酶B的活性
目的:探讨层黏连蛋白(Ln)对传代培养的人晶状体上皮细胞(hLECs)的蛋白激酶B(PKB)活性的影响,以及Ln激活PKB的信号分子途径.方法:选取第5代hLECs,分为对照组和处理组,在处理组的培养液中加入层黏连蛋白,终浓度为5mg/L.分别在处理后0,10,20,40,60min取出细胞,[γ-32P]-ATP掺入法测定胞膜和胞质PKB比活性.以PI3K的特异性抑制剂Wortmannin(终浓度100nmol/L)预处理1h,再加入层黏连蛋白,0,10,20,40,60min测定胞膜和胞质PKB比活性.结果:hLECs胞膜和胞质PKB比活性在层黏连蛋白作用40min时达到高值,分别为空白对照的2.72和2.00倍.层黏连蛋白处理的各组胞膜和胞质PKB比活性显著高于对照组(P＜0.05).经Wortmannin预处理后,再加入层黏连蛋白,胞膜和胞质PKB比活性与未经预处理的各时间组相比均显著下降(P＜0.05).结论:层黏连蛋白通过PI3K途径激活人晶状体上皮细胞的PKB活性,比活性随时间变化而发生改变.
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余甘子对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PKB表达和GLUT4 mRNA表达的影响
目的:观察余甘子提取物对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PKB表达和GLUT4 mRNA表达的影响.方法:SD大鼠30只,随机分为正常对照组10只,给予基础饲料;模型组20只,给予高脂饲料.模型组大鼠给予高脂喂养6 wk后,随机分为2亚组:胰岛抵抗组,继续高脂饮食;余甘子组:给予高脂饲料同时进行2 mL剂量3.5g/kg余甘子提取物灌胃.干预6 wk后,分别检测3组大鼠骨骼肌PKB表达和GLUT4 mRNA表达的差异.结果:高脂饮食成功诱导了胰岛素抵抗,余甘子提取物显著改善了胰岛素抵抗,胰岛素抵抗组大鼠骨骼肌PKB表达和GLUT4 mRNA表达显著低于安静对照组和余甘子组,余甘子组与安静对照组相比无显著差异.结论:余甘子提取物明显改善胰岛素抵抗,可能与其提高大鼠骨骼肌PKB表达和GLUT4 mRNA表达有关.
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参芎化瘀胶囊通过PI3-K/Akt信号通路改善大鼠缺血性脑损伤
目的 探讨参芎化瘀胶囊对缺血性脑损伤的治疗作用及其机制.方法 SD大鼠分为假手术组、模型组及参芎化瘀胶囊高、低剂量组.改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作全脑缺血模型；HE染色观察海马区神经细胞的形态变化；免疫组织化学法检测海马区磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)的表达；原位缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞；八臂迷宫法测试动物学习记忆功能.结果 与假手术组比较,模型组大鼠海马区神经元结构损伤明显,PI3 K、Akt表达增高,凋亡神经细胞数量增加,大鼠的学习记忆功能下降；与模型组比较,参芎化瘀胶囊组海马神经元形态结构损伤减轻,PI3 K、Akt表达进一步增多,凋亡神经细胞数量减少,动物学习记忆功能改善,上述变化在高剂量参芎化瘀胶囊更为明显.结论 参芎化瘀胶囊对脑缺血损伤有很好的治疗作用,其机制可能与调控PI3-K/Akt信号途径有关.
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山核桃叶总黄酮诱导人多发性骨髓瘤U266细胞株凋亡作用研究
目的 研究山核桃叶总黄酮诱导人多发性骨髓瘤(U266)细胞株凋亡的作用及其作用机制.方法 体外培养U266细胞,CCK-8比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术定量分析细胞凋亡程度,Western Blot分析不同浓度总黄酮对U266细胞蛋白激酶B(Akt)和p-Akt蛋白表达的影响.结果 山核桃叶总黄酮以浓度依赖性方式显著诱导U266细胞株凋亡并抑制p-Akt蛋白的表达.结论 山核桃叶总黄酮诱导U266细胞凋亡的作用与其抑制Akt磷酸化相关.
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细胞外信号调节激酶及蛋白激酶B信号通路在微RNA-21促进胆管癌细胞侵袭转移中的作用
目的 观察细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及蛋白激酶B(Akt)信号通路在微RNA-21(miR-21)促进胆管癌细胞侵袭转移中的作用.方法 采用实验研究方法.体外培养胆管癌细胞QBC939细胞,通过构建合成无关序列、miR-21 mimics和miR-21 inhibitor并转染到细胞中,将细胞分为4组:cell组:自然生长细胞,21-NC组:转染无关序列,21-M组:转染miR-21 mimics,21-Ⅰ组:转染miR-21 inhibitor.另取21-M组细胞进一步分为2组,分别加入20 μmol/L LY294002和10 μmol/L U0126处理48 h,用于后续实验.检测指标:(1) RT-qPCR检测miR-21在各组胆管癌细胞中的表达.(2) Werstern blot检测各组胆管癌细胞第10号染色体缺失的张力同源性磷酸酶(PTEN)、ERK及Akt蛋白的相对表达量.(3)划痕实验检测各组胆管癌细胞迁移能力.(4) Transwell实验检测各组胆管癌细胞迁移与侵袭能力的影响.正态分布的计量资料以(x)±s表示,两组均数比较采用t检验,多组均数比较采用方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验,重复测量数据采用重复测量方差分析.结果 (1) miR-21在cell组、21-NC组、21-M组及21-Ⅰ组中的相对表达量分别为1.010±0.010、0.980±0.050、4.900±0.350、0.260±0.010,4组比较,差异有统计学意义(F=78.23,P＜0.05).21-NC组miR-21表达分别与cell组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).21-M组miR-21表达较cell组增加,21-Ⅰ组较cell组减少,21-M组和21-Ⅰ组分别与cell组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2) cell组、21-NC组、21-M组、21-Ⅰ组细胞PTEN蛋白相对表达量分别为0.360±0.020、0.400±0.030、0.140±0.010、0.680±0.110,ERK蛋白相对表达量分别为0.045±0.126、0.470±0.140、0.460±0.060、0.440±0.110,p-ERK蛋白相对表达量分别为0.310±0.020、0.380±0.040、0.590±0.060、0.160±0.010,Akt蛋白相对表达量分别为0.400±0.010、0.390±0.080、0.410±0.090、0.380±0.070,p-Akt蛋白相对表达量分别为0.440±0.110、0.510±0.120、0.980±0.150、0.190±0.010,4组细胞PTEN、p-ERK、p-Akt蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(F=10.23,12.78,18.11,P＜0.05),与cell组比较,21-NC组PTEN、ERK、p-ERK、Akt、p-Akt表达,差异均无统计学意义(P＞0.05);而21-M组与cell组比较,PTEN表达减少,p-ERK和p-Akt表达增加,差异有均有统计学意义(P＜0.05);21-Ⅰ组与cell组比较,PTEN表达增加,而p-ERK和p-Akt表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)cell组、21-M组、miR-21+ LY294002组、miR-21+U0126组细胞6～48 h迁移率变化范围为12.0％±3.0％～23.0％±5.0％,21.0％±4.0％～43.0％±7.0％,6.0％±1.0％～18.0％±4.0％,9.0％±2.0％～26.0％±6.0％.与cell组比较,21-M组细胞迁移能力各时间点迁移率更高,两组迁移率变化趋势比较,差异有统计学意义(F=16.23,P＜0.05).miR-21+ LY294002组、miR-21+ U0126组迁移率较21-M组下降,3组迁移率趋势比较,差异有统计学意义(F=25.21,P＜0.05),3组迁移率变化趋势与时间交互效应,具有统计学意义(F=35.31,P＜0.05).(4) cell组、21-M组、miR-21+ LY294002组、miR-21+U0126组迁移细胞数分别为(198±32)个、(248±39)个、(187±23)个、(174±28)个,4组比较,差异有统计学意义(F=8.48,P＜0.05);21-M组与cell组比较,差异有统计学意义(=4.13,P＜0.05);miR-21+LY294002组、miR-21+U0126组迁移细胞数较21-M组下降,3组比较,差异有统计学意义(F=21.98,P＜0.05).cell组、21-M组、miR-21+ LY294002组、miR-21+ U0126组侵袭细胞数分别为(102±22)个、(211±36)个、(55±9)个、(67±13)个,4组比较,差异有统计学意义(F=11.32,P＜0.05);21-M组与cell组比较,差异有统计学意义(t=6.67,P＜0.05);miR-21+ LY294002组、miR-21+ U0126组侵袭细胞数较21-M组下降,3组比较,差异有统计学意义(F=36.23,P＜0.05).结论 ERK及Akt信号通路参与了miR-21促进胆管癌细胞侵袭迁移,PTEN可能介导了miR-21通过ERK及Akt通路促进胆管癌侵袭转移的过程.
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养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠肾组织TGF-β1、PI3K和PKB的影响
目的 观察养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠肾组织转化生长因子-β1 (TGF-β1)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B (PKB)的影响,探讨养肝益水颗粒对原发性高血压早期肾损害的作用及机制.方法 取50只12周龄收缩压大于150 mmHg的自发性高血压大鼠,随机分为模型组,养肝益水颗粒高、中、低剂量组(10.8、5.4、2.7 g/kg)和阳性对照药厄贝沙坦组(0.015 g/kg),每组10只；另取10只Wistar雄性大鼠作为正常对照组,模型组和正常对照组ig给予等量蒸馏水,每天1次,共12周.给药前和给药12周后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠尿微量白蛋白(UMA)浓度；末次给药后,用免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织中TGF-β1和PI3K的表达；用ELISA法检测PKB的浓度.结果 养肝益水颗粒有效地降低了UMA浓度和肾脏组织TGF-β1;升高了肾脏组织PI3K和PKB水平.结论 养肝益水颗粒对高血压的早期肾损害有一定的抑制作用,其作用机制可能与影响TGF-β1、PI3K和PKB的含量有关.
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外源性重组人碱性成纤维细胞生长因子对大鼠压疮深部组织损伤后肌肉修复的作用
目的 探讨外源性重组人bEGF(rhbFGF)对大鼠压疮深部组织损伤(DTI)后肌肉修复的作用.方法 将48只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、损伤对照组、伤后4d组、伤后7d组、伤后14 d组、伤后21d组,每组8只.正常对照组大鼠不做任何处理,后5组大鼠在两侧后肢股薄肌处建立压疮DTI模型.损伤对照组大鼠伤后不做任何处理;另4组大鼠在伤后即刻分别于左侧后肢股薄肌处皮下注射100 μg/mL的rhbFGF 0.1 mL,右侧后肢股薄肌处注射等体积生理盐水(NS),隔天注射1次.损伤对照组大鼠于伤后即刻、正常对照组大鼠于相同时相点,另4组大鼠分别于伤后第4、7、14、21天切取两侧后肢股薄肌处肌肉组织.HE染色观察股薄肌组织形态,免疫荧光法检测成肌素表达,蛋白质印迹法检测肌肉结构蛋白肌球蛋白重链(MyHC)、磷酸化蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达.对数据行单因素方差分析、LSD检验.结果 (1)正常对照组大鼠股薄肌细胞胞核大小均匀、排列紧密、结构清晰,无明显的炎性细胞浸润;损伤对照组大鼠股薄肌出现肌细胞固缩、溶解断裂,结构紊乱的病理退化现象;伤后4d组、伤后7d组、伤后14d组、伤后21d组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌细胞肿胀、炎性浸润、结构紊乱等病理损伤现象均较组内经NS处理的股薄肌减轻,肌细胞增殖数目增多.(2)正常对照组、损伤对照组大鼠股薄肌成肌素表达阳性细胞数分别为(28±17)、(42±28)个;伤后4d组、伤后7d组、伤后14d组大鼠经NS处理的股薄肌成肌素表达阳性细胞数分别为(100±50)、(196±87)、(460±110)个,经rhbFGF处理的股薄肌成肌素表达阳性细胞数分别为(174±34)、(717±182)、(613±122)个,各组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌成肌素表达阳性细胞数明显多于组内经NS处理的股薄肌(P＜0.05或P＜0.01);伤后21d组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌成肌素表达阳性细胞数为(109 ±34)个,明显低于组内经NS处理的股薄肌[(218±71)个,P＜0.05].(3)正常对照组大鼠股薄肌MyHC表达较高,损伤对照组大鼠股薄肌MyHC表达较正常对照组大鼠有所降低;伤后4d组、伤后7d组、伤后14d组、伤后21 d组大鼠经NS处理的和经rhbFGF处理的股薄肌MyHC表达均呈逐渐增高趋势,各组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌MyHC表达明显高于组内经NS处理的股薄肌(P＜0.05或P＜0.01);伤后21 d组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌MyHC表达较高,与正常对照组大鼠相近(P＞0.05).正常对照组大鼠股薄肌磷酸化Akt、磷酸化mTOR表达较低,损伤对照组大鼠股薄肌磷酸化Akt表达较正常对照组大鼠有少量增高,磷酸化mTOR表达有少量降低;伤后4d组、伤后7d组、伤后14 d组、伤后21 d组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌磷酸化Akt、磷酸化mTOR表达呈先升高后降低的趋势;伤后4d组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌磷酸化Akt、磷酸化mTOR表达明显低于组内经NS处理的股薄肌(P＜0.05或P＜0.01);伤后7d组、伤后14 d组、伤后21 d组大鼠经rhbFGF处理的股薄肌磷酸化Akt、磷酸化mTOR表达明显高于组内经NS处理的股薄肌(P＜0.05或P＜0.01).结论 外源性rhbFGF能有效促进大鼠压疮DTI肌肉修复,其作用机制可能与提高成肌素表达,增强肌肉生长相关信号通路的蛋白表达有关.
关键词： 肌肉发育 成纤维细胞生长因子2 肌球蛋白重链 压疮 深部组织损伤 蛋白激酶B 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 -
烧伤血清作用下心肌细胞蛋白激酶B和p38丝裂原活化蛋白激酶通路的交叉对话研究
目的 了解在烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞内是否存在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK,以下简称p38)信号通路的交叉对话,探讨此二通路在烧伤后心肌细胞损伤中的作用. 方法建立烧伤血清刺激下的大鼠心肌细胞模型.(1)检测体积分数10%的烧伤血清刺激不同时间后,心肌细胞内磷酸化p38(p-p38)和磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平.(2)检测在不同体积分数(5%、10%、20%)的烧伤血清或体积分数10%烧伤血清+胰岛素(1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L)作用下,心肌细胞内p-p38和p-Akt的表达水平,并测定细胞培养上清液中肌酸激酶(CK)的含量.(3)采用p38MAPK通路抑制剂SB203580、PI3K/Akt通路抑制剂LY294002进行阻断实验,测定心肌细胞内p-p38和p-Akt的表达水平及细胞培养上清液中CK的含量. 结果 (1)体积分数10%烧伤血清作用1、3、6、12、24 h时,心肌细胞p-p38水平分别为4.0±0.8、3.6±0.8、5.1±1.6、2.4±0.5、3.0±0.6,较作用0 h时(加入血清后即刻)的水平(1.0)明显增高(P<0.01);而p-Akt表达水平分别为0.15±0.07、0.64±0.10、0.26±0.08、0.38±0.11、0.59±0.13,较作用0 h时水平(1.00)明显降低(P<0.01).(2)不同浓度烧伤血清或烧伤血清+胰岛素作用下,p-p38和p-Akt的表达水平呈相反变化趋势;心肌细胞CK的释放量随烧伤血清浓度升高而增高,胰岛素对此有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01).(3)LY294002能够升高烧伤血清导致的低P-p38水平,抵消胰岛素的保护作用(P<0.01);SB203580能使烧伤血清所致的低p-Akt水平得以回升(P<0.01),抑制烧伤血清引起的CK释放. 结论烧伤血清作用下的心肌细胞存在PI3K/Akt和p38信号通路的交叉对话,并可能对心肌细胞产生调控作用.
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整合素连接激酶信号通路在糖尿病大鼠皮肤病变及创面愈合中的作用
目的 探讨整合素连接激酶(ILK)信号通路在糖尿病大鼠皮肤病变及创面愈合中的作用. 方法 将36只SD大鼠按随机数字表法分为糖尿病组和非糖尿病组,每组18只.糖尿病组大鼠腹腔注射10 g/L链脲佐菌素(60 mg/kg),非糖尿病组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液.糖尿病组大鼠建模成功2周后,切除2组大鼠背部两侧2处2 cm×2 cm的全层皮肤致伤.伤后第1、3、7、10、14、21天,2组各取3只大鼠,对创面进行拍照观察并计算创面愈合率.2组剩余15只大鼠于伤后第3、7、10、14、21天各取3只,切取背部的未致伤皮肤组织和创面中心组织.HE染色观察未致伤皮肤组织形态,测量全层皮肤和表皮的厚度;实时荧光定量RT-PCR法检测未致伤皮肤组织ILK、蛋白激酶B(Akt)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的mRNA表达;蛋白质印迹法检测未致伤皮肤组织ILK、Akt、磷酸化Akt、GSK-3β、磷酸化GSK-3β和创面组织ILK、磷酸化Akt的蛋白表达.对数据行两独立样本t检验、单因素方差分析、SNK检验和析因设计方差分析. 结果 (1)伤后,非糖尿病组大鼠创面痂皮干燥,脱落后见鲜红色肉芽组织,无分泌物,创面愈合速度快;糖尿病组大鼠创面痂皮下有分泌物,易脱落,脱落后见粉红色肉芽组织,有较多分泌物,创面愈合缓慢.除伤后第3天外,伤后各时相点糖尿病组大鼠的创面愈合率明显低于非糖尿病组(t值为3.858～13.738,P＜0.05或P＜0.01).(2)伤后第3天,非糖尿病组大鼠的未致伤皮肤组织皮下毛囊和血管组织丰富,表皮由复层细胞如基底细胞和KC构成;糖尿病组大鼠的未致伤皮肤组织皮下毛囊和血管组织稀少,表皮几乎只有单层细胞.伤后3～21 d,非糖尿病组大鼠未致伤皮肤组织全层皮肤和表皮的厚度无明显变化,糖尿病组大鼠未致伤皮肤组织全层皮肤和表皮的厚度分别由伤后第3天的(1 074±66)、(15.1±3.8) μm逐渐变薄至伤后第21天的(785±122)、(9.7±2.1)μm.伤后各时相点,非糖尿病组大鼠的未致伤皮肤组织全层皮肤和表皮厚度均明显厚于糖尿病组(t值为4.620 ～23.549,P值均小于0.001).(3)伤后3～21 d,糖尿病组大鼠未致伤皮肤组织中ILK和Akt的mRNA表达量明显低于非糖尿病组(t值分别为4.779、3.440,P值均小于0.05);2组大鼠未致伤皮肤组织中GSK-3β mRNA表达量相近(t=0.363,P＞0.05).(4)伤后3～21 d,糖尿病组大鼠未致伤皮肤组织中ILK、Akt和磷酸化Akt蛋白的表达量均明显低于非糖尿病组(t值为2.630 ～6.209,P＜0.05或P＜0.01);2组大鼠未致伤皮肤组织中GSK-3β蛋白的表达量相近(t=0.652,P＞0.05);糖尿病组大鼠未致伤皮肤组织中磷酸化GSK-3β蛋白的表达量明显高于非糖尿病组(t=4.131,P＜0.001).2组大鼠伤后各时相点创面组织中ILK蛋白的表达量相近(t值为0.381 ～2.440,P值均大于0.05).除伤后第3天外,非糖尿病组大鼠伤后各时相点创面组织中磷酸化Akt蛋白的表达量均明显高于糖尿病组(t值为4.091 ～20.555,P＜0.05或P＜0.01).伤后3～21 d,非糖尿病组大鼠创面组织与未致伤皮肤组织中ILK蛋白表达量相近(F=2.522,P＞0.05),创面组织中磷酸化Akt蛋白表达量明显增高(F=117.329,P＜0.001);糖尿病组大鼠创面组织与未致伤皮肤组织中ILK蛋白表达量相近(F=1.337,P ＞0.05),创面组织中磷酸化Akt蛋白表达量明显增高(F=184.120,P＜0.001). 结论 糖尿病皮肤病变可能与ILK信号通路中ILK、Akt和磷酸化Akt的表达下降有关,糖尿病大鼠创面愈合缓慢可能与磷酸化Akt的表达下降有关.
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肌醇六磷酸对PI3K/Akt通路中Akt蛋白和基因表达影响
目的 探讨肌醇六磷酸(IP6)通过磷脂酰肌醇3(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路调控结肠癌细胞凋亡的机制.方法 以未经IP6作用的HT-29细胞作为对照组,以100、200及400 mg/L的IP6作用48 h的HT-29细胞为实验组.应用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,用实时荧光定量RT-PCR方法检测Akt的mRNA表达情况,Western blot法检测Akt和其活性形式pAkt蛋白的表达情况.结果 与对照组比较,HT-29细胞经浓度为100～400 mg/L的IP6处理48 h后,细胞早期凋亡率增加,Akt mRNA及蛋白表达下降,pAkt蛋白表达下调,并且呈剂量依赖性,差异有显著性(F=40.48～5 395.07,q=3.86～223.02,P＜0.05).结论 IP6能够通过下调PI3K/Akt信号通路中Akt mRNA的表达、降低Akt和pAkt的蛋白表达,发挥抗肿瘤作用.
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人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6-OHDA毒性作用的影响
目的 探讨人参皂苷Rg1对抗6-羟基多巴胺(6-OHDA)毒性作用的信号通路.方法 MES23.5细胞常规培养,免疫印迹法观察人参皂苷Rg1预处理对6-OHDA诱导的磷酸化蛋白激酶B (Akt) 表达的影响,MTT法观察细胞的存活率.结果 6-OHDA可时间依赖性地降低MES23.5细胞磷酸化Akt的表达(F=24.51,P<0.01),人参皂苷Rg1预处理可明显增强磷酸化Akt的表达(t=471.60,P<0.01);人参皂苷Rg1预处理可明显降低6-OHDA对MES23.5细胞的损伤作用,此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002所阻断(F=25.12,P<0.01).结论 人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt信号通路对抗6-OHDA对MES23.5神经细胞的毒性作用.
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rhGLP-1(7-36)对人肝HL-7702细胞系Akt、P70S6K蛋白的影响
目的 观察重组人胰高血糖素样肽-1(7-36)[recombinant human glucagon like peptide-1(7-36),rhGLP-1(7-36)]对人肝HL-7702细胞系蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,P70S6K)表达的影响,探讨其作用机制.方法 选用处于对数生长期的人肝HL-7702细胞系,实验组用含100 nM浓度rhGLP-1(7-36)的培养基分别处理0 min、10 min、60 min、90 min;对照组用不含100 nM浓度rhGLP-1(7-36)的培养基分别处理相同的时间.用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)分别检测各组Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平.结果 与对照组相比,实验组10 min、60 min、90 min时Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平无明显变化;10 min、60 min、90 min时p-AktThr308蛋白、p-AktSer473蛋白及磷酸化P70S6K蛋白表达水平均升高,其中,10 min、60 min时差异无统计学意义(P>0.05),90 min时差异有统计学意义(t=-5.596,P=0.011;t=-5.405,P=0.012;t=-5.597,P=0.011).结论 rhGLP-1(7-36)促进肝脏细胞中Akt蛋白和P70S6K蛋白的磷酸化与时间有关,该结果为研究GLP-1对肝细胞的直接作用提供依据.
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细丝蛋白A与蛋白激酶B在小肠腺癌中的表达与意义
目的：探讨细丝蛋白A( filamin A,FLNA)和蛋白激酶B( protein kinase B,PKB)在小肠腺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学法、逆转录-聚合酶链反应( reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法( Western印迹法),检测56例小肠腺癌组织及正常小肠组织(距腺癌组织边缘5 cm以上)中FLNA、PKB的表达情况。结果小肠腺癌组织中FLNA mRNA表达低于正常小肠组织,而PKB mRNA的表达水平高于正常小肠组织( P<0.05)。小肠腺癌组织中FLNA表达低于正常小肠组织,而PKB的表达水平高于正常小肠组织(P<0.05)。 FLNA、PKB的表达与患者性别、年龄、肿瘤组织学分级无关( P>0.05),而与肿瘤淋巴结转移、临床肿瘤分期和肿瘤浸润深度相关( P<0.05)；Spearman秩相关系数显示FLNA与PKB表达呈负相关( r＝－0.289,P＝0.008)。结论 FLNA、PKB参与小肠腺癌的发生、发展过程,磷脂酰肌醇3-激酶/PKB信号通路的活化可作为临床潜在治疗靶点。
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程序性死亡受体配体1和2及磷酸化蛋白激酶B在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其临床意义
目的 探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者程序性死亡受体配体1(PD-L1)、PD-L2及磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表达情况,并分析其与临床病理特征和预后的关系.方法 选取山西省肿瘤医院2010年1月至2012年12月有详细随访记录的68例DLBCL患者存档石蜡标本,应用免疫组织化学法检测PD-L1、PD-L2和p-AKT蛋白的表达情况.结果 DLBCL患者PD-L1蛋白阳性率为22.1％(15/68),与是否为生发中心B细胞(GCB)亚型(χ2=5.591,P=0.018)、临床分期(χ2=3.969,P=0.046)、国际预后指数(IPI)评分(χ2=4.178,P=0.041)和治疗缓解率(χ2=6.587,P=0.010)有关;PD-L2蛋白阳性率为14.7％(10/68),与是否结外转移有关(χ2=6.772,P=0.009);p-AKT蛋白阳性率为61.8％(42/68),与年龄是否≥60岁(χ2=6.227,P=0.013)、美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分(χ2=4.005,P=0.045)、B症状(χ2=10.187,P=0.001)和治疗缓解率(χ2=4.096,P=0.043)有关.单因素分析显示PD-L1蛋白阳性表达组总生存(OS)率及无进展生存(PFS)率低于阴性表达组(均P<0.05).非GCB亚型患者PD-L1蛋白阳性表达组的OS率及PFS率均低于阴性表达组(均P<0.05).p-AKT蛋白阳性表达组较阴性表达组有较差的OS率及PFS率(均P<0.05).相关性分析显示PD-L1蛋白表达与PD-L2、p-AKT蛋白表达相关(r=0.380,P=0.001;r=0.273,P=0.025),且PD-L1、p-AKT共表达提示预后更差(P<0.05).多因素分析显示PD-L1和p-AKT蛋白高表达均是DLBCL独立的预后危险因素(均P<0.05).结论 PD-L1和p-AKT蛋白表达可能参与了DLBCL的发生发展,阻断程序性死亡受体1(PD-1)及相关配体的通路或联合阻断可能为临床治疗带来更多希望.
关键词： 淋巴瘤 大B-细胞 弥漫性 程序性死亡受体配体1 程序性死亡受体配体2 蛋白激酶B 预后
