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用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞
制备单克隆抗体一个必不可少的步骤就是使融合后的细胞进行单克隆培养.融合细胞的克隆化方法主要采用有限稀释法[见:徐新来.细胞培养在杂交瘤技术中的应用.见:鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1995:207~214].由于需要反复克隆再克隆,细胞培养的工作量大,操作繁琐,克隆效率低.我们采用甲基纤维素制成半固体培养基可以克服以往方法上的局限性,直接进行克隆化的培养,提高了工作效率.
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天然属性抗LDL及oxLDL IgM亚类抗体的制备与鉴定
目的:制备天然属性抗低密度脂蛋白(LDL)及抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)IgM亚类抗体.方法:给予BabFl/c小鼠高胆固醇饮食,4周后取脾细胞直接与SP2/0细胞融合,以纯化的LDL及oxLDL为抗原,对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA筛选.鉴定杂交瘤上清的免疫球蛋白亚类,进而采用免疫沉淀和免疫印迹法对获得的抗体进行免疫学反应性鉴定.结果:杂交瘤细胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗体通过ELISA法被筛选出来.可以与LDL或oxLDL发生高亲和力结合,经过4次克隆化.终获得2株稳定分泌天然抗LDL的抗体,命名为5G8和2H7,及1株稳定抗oxLDL的抗体,命名为3A6,3株抗体均属于lgM亚类,无交叉反应,可以满足免疫印迹、免疫沉淀等实验要求.结论:成功制备了抗LDL及抗oxLDLtgM亚类抗体.为研究天然抗体在体内脂质代谢和相关心脑血管疾病如动脉粥样硬化等发生发展中的作用提供了重要的研究工具.
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全人源单克隆抗体现状及发展趋势(续)
4 技术平台全人源单抗是抗体工程技术发展的重要趋势.目前全人源单抗的研发技术主要有:B细胞永生化技术、噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术以及人源杂交瘤技术等.其中以噬菌体展示技术和转基因小鼠技术实际应用广泛、成功.
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抗独特型抗体在抗传染免疫中的应用
Levy等首先应用杂交瘤技术抗独特型抗体(Anti-1diotyype)治疗了数例急性淋巴细胞白血病[1];
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肿瘤放射免疫靶向治疗研究的现状与进展 (文献综述)
随着杂交瘤技术的发展,肿瘤放射免疫导向治疗作为一种系统的特异靶向性的肿瘤治疗手段,具有优于放疗和化疗对肿瘤细胞选择性杀伤的特点,正受到人们的重视.目前,放射免疫治疗(Radioimmunotherapy,RIT)对霍奇金和非霍奇金淋巴瘤已取得完全缓解的疗效,在这种放射敏感的肿瘤中很低的放射剂量就有效[1].但在实体瘤中所取得的疗效较为有限,这主要是由于放射免疫治疗所释放至肿瘤的放射剂量通常太低,即核素浓集在肿瘤部位的量很低.近年来,随着高亲和力单克隆抗体(McAb)的制备,核素标记技术的改进,肿瘤微环境的改善,肿瘤放射免疫靶向治疗的研究已经取得了令人瞩目的成绩,但目前仍有许多问题亟待解决.本文就放射免疫治疗的基本原理,核素的选择,抗体载体的类型,临床应用现况及进展进行综述.
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小鼠Metrnl单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备抗小鼠Metrnl单克隆抗体,并进行初步筛选鉴定.方法 分别制备小鼠Metrnl多肽片段和全长蛋白作为免疫小鼠抗原,取免疫后小鼠脾细胞与S P2/0骨髓瘤细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,并亚克隆获得稳定细胞株,制备腹水.用ELISA方法 检测腹水抗体效价;用Western blot方法 鉴定抗体.结果 由14种多肽抗原制备的56株单克隆抗体中,未筛选出可用于Western blot识别Metrnl的抗体;由全长蛋白制备的25株抗体中,有12株可识别Metrnl蛋白.结论 本实验成功制备了12株单抗,可用于识别检测小鼠Metrnl蛋白.
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人血管生成素相关蛋白2单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备人血管生成素相关蛋白2(angiopoietin-related protein 2,ARP2)的单克隆抗体.方法:用RT-PCR方法获取人脾脏组织ARP2基因序列,构建pET32a-ARP2,经电穿孔导入大肠杆菌诱导表达,获得可溶蛋白样品和包涵体蛋白样品,回收、纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立产生ARP2抗杂交瘤细胞株,Western印迹鉴定.结果:获得融合蛋白的相对分子质量为570 000,与理论计算值相符,纯化后蛋白浓度>90%,杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:104,腹水抗体效价为1:107~1:108,抗体亚型为IgG2a类,Western印迹示目的蛋白相对分子质量为570 000,免疫组化显示该抗体能特异结合人ARP2.结论:制备的抗ARP2单克隆抗体可用于ARP2蛋白鉴定.
关键词: 血管生成素相关蛋白2 抗体 单克隆 杂交瘤技术 -
实体瘤的单克隆抗体治疗
抗体的概念来源于20世纪以前Paul Ehrlich 提出的"魔术子弹(magic bullet)"的假说,当时他就认为这种"魔术子弹"将来可能用于癌症、感染等疾病的治疗,可以说这是抗体概念的雏形[1].但直到1975年Kohler和Milsten发明了杂交瘤技术,人们才能大量制备高亲和力和高特异性的单克隆抗体,使抗体治疗能在肿瘤治疗领域中占有一席之地.
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不同载体蛋白偶联制备促红细胞生成素二聚体单克隆抗体的选择优化
目的 将EPO dimer分别连接牛血清蛋白(bovine serum alumin,BSA)、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)几个不同的载体蛋白构成抗原,免疫BALB/c小鼠,并结合特定的ELISA检测系统,来优化选择抗EPO dimer单克隆抗体.方法 采用单克隆抗体制备技术筛选获得杂交瘤细胞;EHSA法鉴定杂交瘤细胞的特性;分析比较不同载体蛋白构建单克隆抗体的差异与效果.结果 共筛选获得了5株杂交瘤细胞,5株杂交瘤细胞均能分泌EPO dimer抗体.经过进一步的特异性鉴定、亚型鉴定以及效价鉴定后,有4株杂交瘤细胞被挑选进行大量抗体制备,为后期临床基础实验提供材料.4株杂交瘤分别为克隆S-18-2,其亚型为IgG2b,κ;克隆S-369-7,其亚型为IgG1,κ;克隆S-410-3,其亚型为IgG1,κ;克隆S-514-7,其亚型为IgG2b,κ;其中克隆S-18-2、S-514-7分泌抗体EPO dimer的能力稳定,其抗体对载体蛋白OVA、KLH、BSA均无效价,且它们抗原抗体反应只针对EPO dimer;克隆S-369-7、S-410-3分泌抗体EPO dimer的能力也很稳定,对载体蛋白OVA、KLH、BSA也均无效价,尤其其抗原抗体反应可以同时针对EPO dimer以及EPO dimer-PEG,即本实验获得的这2株杂交瘤细胞分泌的抗体既可检测EPO dimer又可检测EPO dimer-PEG.比较连接BSA、OVA、KLH这几个不同载体蛋白构建单克隆抗体的差异与效果,发现以EPO dimer连接载体蛋白OVA获得的单克隆抗体效果佳.结论 本实验用偶联载体的方法增强了小分子EPO dimer的免疫原性,得到了稳定分泌EPOdimer抗体的杂交瘤细胞.
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双特异性单克隆抗体结合物在治疗中的应用
自20世纪70年代,开始了杂交瘤技术 [1],从而单抗应用于治疗领域中取得的成绩越来越大.由于重组DNA技术的进步,单抗现在处于高速发展时期.这项技术可以允许在组建人造单抗或者片段的时候,其大小、形态、效价和效应细胞的功能有一定的改变.
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单克隆抗体在变态反应性疾病中的应用
1975年Koehler和Milstein[1]成功采用细胞融合技术,将绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经过筛选、克隆化培养后形成杂交瘤细胞,后者既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.单克隆抗体是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的,所以与多克隆抗体相比,单克隆抗体具有性质纯、效价高、特异性高、少或无血清交叉反应等特点,常用于特异性结构决定簇与功能特性之间关系的研究,以及作为确定药物靶点的重要工具.
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生物芯片及其在实验诊断中的应用
被誉为21世纪生命科学的支撑平台的生物芯片(Biochip)、又被称之为DNA芯片(DNA Chip),又称做寡核苷酸微芯片(Oligonucleofide Microchip)或基因芯片(Genechip)或DNA阵列(DNA Array),将给本世纪生命科学和医学研究带来一场革命.生物芯片的发明并应用,好像杂交瘤技术(单克隆抗体)、多聚酶链反应(PCR)技术一样,将使检验医学的发展出现新的里程碑.
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抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定
目的制备抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)全菌的单克隆抗体并对其特异性进行初步鉴定.方法用培养的幽门螺杆菌超声破菌后的上清和沉淀为抗原分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体并测定抗体免疫球蛋白亚类、效价及亲和力,用重组表达的Hp Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白鉴定抗体.结果共获得34株抗Hp的单克隆抗体,其中抗上清31株和抗沉淀3株,34株抗体中针对Lpp20、HspA、urease A、CagA、ureaseB、catalase蛋白的抗体分别为3、2、4、1、5、2株,目前已鉴定的部分单克隆抗体的亚类均为IgG1,细胞培养上清的效价为1:16~1:32,腹水效价为1:32000~1:64000,抗体亲和常数介于1×10-10 mol/L~5.2×10-12mol/L.结论获得特异性针对幽门螺杆菌的单克隆抗体,为幽门螺杆菌的诊断和疫苗研究奠定基础.
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抗人脑源性神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的制备抗人脑源性神经营养因子(BDNF)单克隆抗体.方法利用BDNF纯品与酸处理后的沙门氏菌菌体(抗原:菌体为1:5)混合免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb.结果获得3株抗BDNF的单克隆抗体,分别命名为B1、B2和4D1,mAb的Ig亚类均为IgG1.ELISA间接法测定腹水mAb效价为1×10-6~1×10-5,各单抗相对亲和力结果为B2>B1>4D1.结论成功研制出抗人BDNF单克隆抗体,为进一步研究BDNF在体内组织的表达及分布提供了一种工具,并为基因工程制备BDNF提供了检测方法.
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单链抗体及其应用
自从Kohler,Milstein首先创立杂交瘤技术以来,人们对抗体在理论和实践应用上都取得了极大的进展.抗体是四链结构的,由二条220个氨基酸残基的轻链和二条约440个氨基酸残基的重链构成,这些链中,每110个氨基酸折叠成一个三维构象上保守的结构域,这些结构域缔合成为不连续的结构域串.
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单克隆抗体在血液系统疾病中的应用价值
1引言早在1953年,就有人提出利用抗体特异性杀伤肿瘤细胞用于肿瘤的临床治疗,但直至1975年Kohler和Milstein发明了杂交瘤技术使大规模生产针对特异性抗原的单克隆抗体(单抗)成为可能后,才使其成为现实.
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单克隆抗体的临床用途及不良反应
单克隆抗体(mAb)是B细胞单次克隆产生的抗体。与多克隆 抗体相比,mAb的专一性与同质性使其成为治疗和诊断的有效 工具。1975年,当Kohler和Milstein的杂交瘤技术被引入后,mAb潜在 的临床用途立刻显示出来。但人们几乎用了10年的时间,第一 个治疗用mAb才光顾临床。获取mAb的方便途径是免疫小鼠,当B 细胞与骨髓瘤细胞混合时,形成了杂交瘤,并可传代。因此, 选择特异性mAb的克隆体,可用实验动物生产大量的mAb。不过 ,现已有体外替代方法,不再需要动物生产mAb。虽然已有体外 生产mAb的多种系统,但治疗用mAb的大规模生产,则需要使用 中空纤维组织系统,成功与否依赖于杂交瘤的内在特性,如细 胞生长性和mAb生产活性[1]。过去几年中,噬菌体基因库表达 技术和异种重组抗体表达技术的发展,打开了全新的筛选和生 产mAb的前景,许多新抗体被筛选和大量生产。近,重组工 程技术允许mAb结构作必要改造,使其大小、构型、效价和效能 的改变成为可能。这种灵活设计可开发出嵌合体、人源化和 完全人源化mAb。
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具有抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备并鉴定具有抗凝血活性的抗人组织因子(hTF)单克隆抗体(mAb).方法 以截短型重组hTF243蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,采用间接ELISA联合血浆凝血酶原时间(PT)测定方法,筛选具有抗凝血活性的抗hTF mAb的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定.结果 成功建立1株可稳定分泌具有抗凝血活性的抗hTF mAb的杂交瘤细胞株,该mAb属于IgG1亚型.间接ELISA测定腹水效价为1∶200 000,Western blot、PT测定结果表明,该mAb可特异性结合重组hTF243,同时与SW620结肠癌细胞表面天然TF作用,显著延长血浆凝血酶原时间,具有良好的抗凝血活性.结论 成功制备了具有抗凝血活性的抗hTF mAb.
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抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及特性鉴定
目的:制备高效、特异的抗创伤弧菌的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:用创伤弧菌菌体蛋白抗原免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备抗创伤弧菌的杂交瘤细胞株.用ELISA法及Western blot等筛选、鉴定其与创伤弧菌溶血素蛋白(vvhA)及其他重要海洋细菌的交叉反应性和效价.结果:共获得5株抗创伤弧菌的mAb,鉴定结果表明,5株mAb均具有良好的特异性和免疫反应性.结论:获得5株抗创伤弧菌的特异性mAb,为建立创伤弧菌快速检测试剂盒提供了重要制剂.
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抗ICAM-1单克隆抗体的制备与特性鉴定
目的:制备有生物学活性的抗人细胞间黏附分子-1( ICAM-1)单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:以纯品ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠4次.采用杂交瘤技术,经3次亚克隆筛选稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株.采用动物体内诱生的方法大量制备mAb.以protein G对其进行纯化后,用间接ELISA法测定mAb的效价并鉴定其Ig亚类.用Western blot鉴定mAb的特异性.结果:筛选出4株可稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为B9株、F1株、C11株和D6株.4株mAb的Ig亚类均为IgG1.4株mAb培养上清的效价均为1∶1 000;腹水的效价B9株与D6株为1∶2×105,F1株与C11株为1∶4×105.纯化后mAb的蛋白浓度为1.2 g/L,均可与ICAM-1特异性结合.结论:成功制备出效价高、特异性良好的4株抗ICAM-1 mAb,为进一步研究ICAM-1的生物学功能和临床应用奠定了基础.