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幽门螺杆菌适应性球形变异相关蛋白的筛选及鉴定
目的 对幽门螺杆菌(Hp)在有氧胁迫条件下由螺旋体转变成球形体的适应性调节蛋白进行筛选及鉴定. 方法 运用双向电泳技术比较Hp螺旋体与球形体的全菌蛋白表达谱,差异蛋白进行胶内酶切,肽混合物使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索. 结果 获得7个与Hp球形变异相关的适应性调节蛋白,即翻译延长因子Tu(EF-Tu)、丙酮酸-黄素蛋白氧化还原酶( POR )、黄素氧化还原蛋白( FldA )、尿素酶G( UreG )、热休克蛋白10(Hsp10)烷基化氢化氧化酶( Ahp )、超氧化物歧化酶( SOD ). 结论 共筛选出7个与Hp球形变异相关的适应性调节蛋白,对有氧胁迫下Hp球形体的形成机制研究和抗Hp药物靶位和疫苗候选靶位的筛选具有参考价值.
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幽门螺杆菌球形休眠体形成的比较蛋白质组学研究
目的研究幽门螺杆菌由螺杆状转变成球形休眠体的相关蛋白. 方法运用双向电泳技术比较螺杆状幽门螺杆菌及其球形休眠体全菌蛋白表达谱,差异蛋白进行胶内酶切,肽混合物使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索. 结果获得9个与幽门螺杆菌球形休眠体形成相关蛋白,即相对分子质量(Mr)为26×103的过氧化物酶、硫氧还蛋白、烯醇酶、黄素氧化还原蛋白、单链DNA结合蛋白、翻译起始因子1、延长因子P、中性粒细胞激活蛋白和Mr为10×103的热休克蛋白. 结论上述蛋白的鉴定为深入研究幽门螺杆菌球形休眠体形成机制,筛选具有潜在价值的抗幽门螺杆菌药物靶位和疫苗候选靶位具有参考价值.
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胰腺癌多细胞团簇的化疗药物敏感试验
目的 探讨应用胰腺癌多细胞团簇做化疗药物敏感试验的可行性.方法 应用胶原凝胶微滴三维培养胰腺癌细胞株SW1990、PCT-3和ASPC-1细胞.在形成多细胞团簇后,采用CD-DST法和CCK-8法测定其对不同浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)、健择(GEM)及奥沙利铂(OXA)3种化疗药物的敏感性,并与分散细胞模型进行比较.结果 形成多细胞团簇的3种胰腺癌细胞对不同浓度5-FU、GEM及OXA三种药物的敏感性均较分散细胞的敏感性显著下降(P<0.05).50μg/ml 5-FU对SW1990、PCT-3、ASPC-1多细胞团簇的抑制率分别为(53.96±4.32)%、(58.49±5.98)%、(49.57±4.36)%;25 μg/ml GEM对SW1990、PCT-3、ASPC-1细胞团簇的抑制率为(53.02±4.06)%、(61.90±4.89)%、(38.09±4.88)%,10 μg/ml OXA对3种细胞团簇的抑制率为(57.33±6.27)%、(50.90±4.90)%、(47.26±4.29)%,均显著低于对分散细胞的抑制率(P<0.05).结论 肿瘤细胞形成细胞团簇后对抗肿瘤药物的敏感性明显降低,耐药性增加,更符合体内状态.
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蛋白酶体抑制剂MG132逆转子宫颈癌细胞HCE1多细胞球体对顺铂耐药的研究
目的 构建宫颈鳞癌细胞系HCE1的多细胞球体模型,研究蛋白酶体抑制剂MG132对其顺铂天然耐药的影响,探讨MG132是否可以逆转HCE1多细胞球体的天然耐药及其可能的机制.方法 (1)采用液体重叠法和旋转法建立HCE1多细胞球体模型;(2)用MG132、顺铂分别干预HCE1单层细胞及多细胞球体,分为MG132组、顺铂组、MG132+顺铂组、对照组,锥虫蓝拒染法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率;(3)用蛋白印迹法和免疫组化方法分别检测HCE1单层细胞及药物干预前后多细胞球体中核因子kB(NF-kB)和B细胞淋巴瘤/白血病2蛋白(bcl-2)的表达.结果 (1)成功建立了HCE1多细胞球体模型.(2)HCE1单层细胞和多细胞球体的细胞抑制率:MG132组分别为(11.67±2.34)%和(10.78±1.17)%,两者比较,差异无统计学意义(P>0.05);MG132+顺铂组分别为(92.67±2.52)%和(91.33±2.18)%,两者比较,差异也无统计学意义(P>0.05);顺铂组分别为(45.01±7.44)%和(9.45±5.98)%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)HCE1单层细胞和多细胞球体的凋亡率:MG132组两者凋亡率分别为8.14%和5.97%,MG132+顺铂组两者凋亡率分别为99.01%和95.22%;顺铂组两者凋亡率分别为33.61%和0.88%.(4)NF-kB的相对表达量和bcl-2的高表达率:HCE1多细胞球体对照组分别为0.67、60%,顺铂组分别为0.85、83%,MG132组分别为0.39、20%,MG132+顺铂组分别为0.47、33%.结论 (1)HCE1多细胞球体模型对顺铂可产生天然耐药,是体外研究宫颈癌对顺铂耐药的良好模型.(2)MG132对HCE1多细胞球体有抑制增殖、诱导凋亡的作用,可部分逆转HCE1多细胞球体对顺铂的天然耐药性,其机制可能与NF-kB、bcl-2表达下调有关.
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原代胃癌干细胞CD44表达意义探讨
目的 肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用,且是肿瘤耐药及复发的根源.本研究探讨CSCs表面标记蛋白CD44在分离及鉴定胃癌干细胞中的重要作用.方法 收集2015-11-06-2015-12 01华中科技大学同济医学院附属同济医院3例胃癌患者手术标本.首先采用胶原酶消化法获取胃癌细胞,部分细胞分别贴壁及悬浮培养,并采用免疫荧光及流式分析的方法检测胃癌球形体中CD44的表达情况.部分细胞采用流式细胞仪分选得到CD44+及CD44胃癌细胞,并通过无血清悬浮培养法比较两群细胞的球形体形成能力.结果 免疫荧光显示,CD44蛋白在球形体中高表达;流式分析发现,贴壁的原代胃癌细胞中CD44+细胞的比例为(30.73±7.6)％,而球形体中CD44+细胞的比例高达(56.4±5.58)％,差异有统计学意义,P=0.009.球形体形成实验结果表明,与CD44-细胞相比,CD44+胃癌细胞具有更强的球形体形成能力,1 000个CD44+及CD44-胃癌细胞分别形成(14.33±2.52)和(1.67±0.58)个球形体,差异有统计学意义,P=0.001.通过比较发现,球形体培养对胃癌干细胞的富集效率为0.3％,而CD44对胃癌干细胞的富集效率为1.4％.结论 CD44是胃癌干细胞的表面标记蛋白,其可能成为胃癌靶向治疗的可靠靶标.
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αv整合素沉默对结肠癌多细胞球药物敏感性的影响
目的 应用反转录病毒介导的shRNA沉默αv整合素,探讨后者在结肠癌多细胞球(MCSs)对奥沙利铂耐药中的作用.方法 构建针对αv整合素的反转录病毒质粒,脂质体转染质粒至结肠癌细胞株HT29.采用改良liquid overlay技术培养MCSs;Western blotting检测MCSs中αv整合素蛋白的表达;Cell Counting Kit-8检测梯度浓度(0、5、50、500、5 000μg/L)的奥沙利铂处理后MCSs的存活率.结果测序证实质粒构建成功.Western blotting结果 显示反转录病毒质粒介导的shRNA能有效、特异、稳定地沉默αv整合素基因.沉默αv整合素基因后,MCSs对奥沙利铂的药物敏感性显著增加.奥沙利铂50、500μg/L处理48h后,MCSs的存活率为0.86%±0.05%和0.43%±0.04%,转染反转录病毒的MCSs则下降为0.77%±0.06%和0.30%±0.04%(P<0.05).结论 反转录病毒介导的shRNA能有效沉默αv整合素基因.沉默αv整合素能有效提高结肠癌MCSs对化疗药物奥沙利铂的敏感性.
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短发夹RNA干扰黏着斑激酶对结肠癌多细胞球氟尿嘧啶敏感性的影响
目的 探讨抑制黏着斑激酶(FAK)在结肠癌HT29细胞中的表达能否提高HT29多细胞球对氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性.方法 构建带有短发夹RNA(shRNA)靶向干扰FAK的重组体pGenesil-1-FAK,抑制FAK在HT29中的表达,采用实时定量PCR和Western blotting检测其在单层细胞和多细胞球中的干扰效率.采用血球计数板计数法检测多细胞球在各时间点的增殖速度,流式细胞术检测干扰对5-FU诱导的多细胞球凋亡的影响,CCK-8法检测单层细胞和多细胞球对5-FU的敏感性的变化.结果 用重组体pGenesil-1-FAK靶向干扰FAK能显著抑制单层细胞FAK mRNA,并能抑制单层细胞和多细胞球FAK蛋白的表达.多细胞球的增殖速度并不受FAK shRNA干扰的影响,各组间在各时间点均无显著性差异(P>0.05).流式细胞术结果显示,FAK shR-NA干扰能够使多细胞球的自发凋亡率(16.48%±1.18%)和5-FU诱导的凋亡率(21.50%±2.62%)显著增加(P=0.000、P=0.001),且两者之间差异显著(P=0.003).CCK-8法检测结果显示,FAK shRNA干扰提高了单层细胞和多细胞球对5-FU的敏感性,且两者无显著差异(P>0.05),从而逆转了因三维球体结构产生的多细胞耐药性.结论 FAK靶向RNA干扰虽不影响多细胞球的增殖,但能促进多细胞球凋亡,并增加多细胞球对5-FU的敏感性;FAK可能介导了结肠癌的多细胞耐药.
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有氧胁迫幽门螺杆菌球形变异的实验研究
目的对有氧胁迫下幽门螺杆菌(Hp)的球形变异特征进行研究.方法采用细菌学、酶学、遗传学、动物实验等方法对有氧胁迫作用下形成的Hp球形体进行实验研究.结果随着有氧胁迫时间的延长,Hp螺旋体逐渐转化为球形体,代谢及酶活性逐渐下降并趋于稳定,与Hp定居相关的毒力基因表达有所减弱,但SodB和Kat在基因表达和酶活检测中均保持较高水平;部分Hp球形体可在小鼠体内回复定植.结论有氧胁迫下形成的Hp球形体代谢活性及毒力均有所减弱,但部分球形体仍具有活性.SodB和Kat可能在Hp活性氧代谢中发挥着重要作用.
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大鼠肝细胞球形体低温保存条件的初步探索
目的 探索有效的肝细胞球形体低温保存方法,促进生物人工肝及其他研究的应用.方法 采用两步法分离大鼠肝细胞,经无血清培养基(SFM)摇摆培养48h形成肝细胞球形体.将球形体继续培养(对照组),或置于4℃SFM,SFM+1mmol/L去铁胺(Def),SFM+ 1μmol/L环孢霉素A(CsA),SFM+1mmol/L Def+1μmol/L CsA保存液中24h或48h,继续培养4d或5d后观察低温保存后肝细胞球形体的存活率、超微结构变化,以及白蛋白和尿素合成情况.结果 Def和CsA能很好地保护球形体肝细胞,在4℃SFM+Def+CsA保存液中保存24h,肝细胞球形体功能、结构等变化及尿素合成水平与对照组比较差异无统计学意义,而单独放在SFM中进行低温保存后,细胞活性明显下降.在4℃保存48h后,球形体肝细胞超微结构发生明显变化,死亡细胞增多,但SFM+Def+CsA组和SFM+Def组细胞结构优于SFM组和SFM+CsA组,细胞存活率及尿素合成水平明显高于后两组(P＜0.05),但合成白蛋白量均处于较低水平,各组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 低温状态下肝细胞球形体可保持良好的存活率和功能24h,低温保存能为细胞治疗提供良好的细胞材料.
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黏着斑激酶表达下调对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
结论 FAK shRNA抑制FAK表达能抑制裸鼠移植瘤的生长,增强瘤体对5-FU的敏感性,有效逆转其多细胞耐药.FAK介导结肠癌多细胞耐药的机制可能与FAK-Akt-NF-κB信号通路的激活有关.
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阿莫西林胶囊的质量分析
阿莫西林为广谱半合成青霉素,具有毒性极低、杀菌力强的特点.对敏感的革兰氏阳性球菌和杆菌均有明显的抑制作用,能抑制细菌细胞壁的合成,使之迅速成为球形体而破裂溶解,临床应用广泛.但近来我们在药品质量检查中同时检验了三批阿莫西林胶囊,其中有两批为假药.现报道如下:
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幽门螺杆菌球形体回复原形的实验研究
目的 对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)球形体进行体内、外回复原形的比较研究,揭示其潜在的传播途径.方法 在布氏肉汤的基础上设计了4种Hp再生培养基,对Hp螺旋体、原生质体及球形体进行体外培养;同时采用30只蒙古沙土鼠(Mongolian gerbil)进行体内感染定植实验,对感染小鼠胃粘膜进行Hp定量培养和组织学检测.结果 Hp球形体在4种再生培养基中均未能回复生长;而在感染小鼠的体内却观察到了Hp球形体的回复定植.Hp螺旋体感染组在小鼠胃内的定植密度较高,且胃粘膜下可见大量炎症细胞浸润;而球形体感染组并未见到小鼠胃粘膜组织的明显炎症损伤,且仅有少量回复的螺旋体定植.结论 Hp球形体作为一种低水平代谢休眠体,代谢活性及毒力均有所减弱,但仍具有潜在的致病性.本研究支持部分Hp球形体具有活力但体外不能培养成活这一假说,提示"粪-口"传播应引起更多的关注.
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幽门螺杆菌感染胃黏膜上皮细胞对CD44v6表达的影响
目的 评估螺杆状幽门螺杆菌(Hp)及其球形体感染胃黏膜上皮细胞对CD44v6表达的影响.方法 幽门螺杆菌及其球形体与胃黏膜上皮细胞共生培养,免疫组化、RT-PCR检测CD44v6蛋白表达.结果 免疫组化及RT-PCR检测,螺杆状Hp及其球形体感染人胃黏膜上皮细胞GES1,诱导CD44v6的表达与上调,且螺杆状Hp与球形体诱导CD44v6存在差异有统计学意义(P＜0.05).结论 螺杆状Hp及其球形体感染导致胃黏膜CD44v6表达增加,提示CD44v6在Hp相关性胃炎、胃癌的发生过程中起作用,Hp球形体在Hp治疗复发的流行病学具有重要的意义.
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CD44抗体对卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞增殖的抑制作用
目的:观察抗CD44单克隆抗体A3D8对卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞增殖的作用,并初步探讨其作用机制.方法:用MTS法检测A3D8及顺铂(DDP)对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪法观察A3D8对卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞细胞周期的影响;彗星电泳法检DNA损伤;通过westem blot法,进一步探讨A3D8作用于卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞后cDK2、cyclinA蛋白表达水平的变化.结果:A3D8作用于卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞后,细胞抑制作用明显增强(P<0.05),而且随着A3D8质量浓度的增加和时间的延长,抑制作用明显增强,与DDP联用,抑制率较单独用DDP增高;A3D8可将细胞周期阻滞于S期;A3D8作用于卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞24 h后可引起DNA损伤;A3D8组CDK2、cyclinA蛋白表达水平明显降低.结论:A3D8可能通过阻滞细胞周期发挥抑制卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞增殖的作用.
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卵巢癌腹水中肿瘤干/祖细胞的筛选及鉴定
目的:从人卵巢癌腹水细胞中分离肿瘤干,祖细胞并进行鉴定.方法:采用无血清培养法从腹水中分离培养球形体细胞(ASC);用流式细胞仪检测腹水ASC和腹水细胞(AC)中SP(side population)亚群含量;采用PCR和Western blot方法测定两种细胞干/祖细胞相关标志物ABCG2、Oct-4、Nanog基因和蛋白的表达;NOD/SCID小鼠检测其体内致瘤性.结果:腹水球形体细胞和腹水细胞中SP亚群分别为0.9%,0.2%;腹水球形体细胞较腹水细胞高表达干,祖细胞相关标志物0ct-4、ABCG2、Nanog;1×10~4个球形体细胞就能在NOD/SCID鼠中成瘤,而1×10~6个腹水细胞也不能成瘤.结论:无血清培养法可以从卵巢癌患者腹水中筛选出肿瘤干,祖细胞.该结果可为今后研究卵巢癌的发生、复发机制及筛选其化疗药物提供简便实用的体外模型.
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肿瘤相关成纤维细胞对肝癌干细胞的影响
背景:肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境中一类特殊的间质细胞,研究显示CAF在一些恶性肿瘤中可调节肿瘤干细胞(CSC)的干细胞特性和致瘤性.然而在肝细胞癌(HCC)中,CAF对CSC的调控作用尚不清楚.目的:探讨CAF对肝癌干细胞的影响.方法:分别采用免疫组化和免疫荧光技术标记CD44阳性CSC和α-SMA阳性CAF,观察两者在人HCC标本中的位置关系.从HCC手术标本中分离、纯化CAF和癌旁成纤维细胞(PTF),收集相应条件培养基和干细胞条件培养基.以real-time PCR检测CAF或PTF条件培养基培养的人肝癌细胞株HuH-7中的肝癌干细胞相关基因表达.采用流式细胞术分选肝癌干细胞表面标记物EpCAM阳性HuH-7细胞,以CAF或PTF干细胞条件培养基培养细胞,行干细胞成球实验.结果:在HCC标本中,CAF与CSC位置紧邻.与PTF组和对照组HuH-7细胞相比,CAF条件培养基处理组HuH-7细胞肝癌干细胞表面标记物基因和自我更新相关基因表达显著上调(P均＜0.05).CAF干细胞条件培养基处理组未经分选的HuH-7细胞和EpCAM阳性HuH-7细胞,成球率分别显著高于相应PTF组和对照组细胞(19.15％、32.13％对10.89％、19.57％和12.57％、19.77％,P均＜0.001).结论:CAF在肝癌干细胞自我更新能力的维持和促进中起重要作用.
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CAV1基因沉默增强MCF-7多细胞球对多柔比星的敏感性
背景与目的:肿瘤细胞形成多细胞球后,对许多化疗药物的耐受性明显增强,这种现象被称为“多细胞耐药”.其发生机制可能与细胞黏附引起的信号通路活性的改变有关.细胞质膜微囊蛋白-1 (caveolin-1,CAV1)是一个细胞膜蛋白,在细胞膜信号通路的调节中发挥重要作用.本研究旨在探讨CAV1基因沉默是否能增强MCF-7多细胞球对多柔比星的敏感性,并初步探讨其机制.方法:用liquid overlay技术培养获得MCF-7多细胞球,用脂质体转染法把特异针对CAV1基因的双链小RNA干扰片段导入MCF-7细胞中,采用台盼蓝拒染法检测多柔比星对MCF-7的细胞抑制率,分别用RT-PCR和免疫印迹法检测CAV1 mRNA水平及蛋白水平,用免疫印迹法检测细胞总黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)及磷酸化FAK (p-FAK)蛋白水平.结果:与单层细胞相比,多细胞球组的多柔比星细胞抑制率明显降低,FAK相对磷酸化水平增加2.64倍(t=7.32,P＜0.01)；CAV1基因沉默后,MCF-7多细胞球生长缓慢,球体较松散,与未转染组相比,干扰组多细胞球多柔比星(1 μ mol/L)的细胞抑制率增加了1.07倍(t=5.77,P＜0.01),FAK相对磷酸化水平下降68.7％(t=6.57,P＜0.01).结论:多细胞球的形成可以增强MCF-7细胞对多柔比星的耐受性；CAV1基因沉默能逆转MCF-7多细胞球对多柔比星的耐药现象,FAK相对磷酸化水平的下调可能是其重要机制.
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A549肺癌细胞球抗凋亡能力及耐药蛋白表达分析
目的:探讨肺腺癌A549细胞来源的肿瘤细胞球对化疗药物的抗凋亡能力及耐药蛋白谷胱苷肽-S-转移酶-π(glutathione-S-transferase-π,GST-π)的表达情况.方法:利用无血清培养法获得A549细胞球,将A549细胞球细胞和原代A549细胞株经顺铂处理后,采用Annexin V -FITC+碘化丙啶(propidium iodie,PI)双染和JC-1染色的免疫荧光法检测2组细胞的凋亡情况.通过Western印迹法及荧光免疫组织化学法测定2组细胞及2组细胞成瘤组织中GST-π蛋自的表达水平.结果:经免疫荧光检测发现,A549细胞的凋亡率明显高于A549细胞球细胞.而A549细胞球细胞及其成瘤组织中GST-π蛋白的表达水平较A549细胞及其成瘤组织的高.结论:采用无血清培养法培养获得A549细胞球细胞的耐药性比A549细胞株高,这可能与细胞球细胞中耐药相关蛋白的高表达有关.
关键词： 肺肿瘤 球形体 细胞 谷胱苷肽-S-转移酶π 细胞凋亡 多药耐药相关蛋白质类 顺铂 -
人结直肠癌细胞株来源的HCT116肿瘤细胞球的转移相关特性
目的:无血清悬浮培养生成HCT116肿瘤细胞球,检测球中CD133表面标志分子的细胞定位,以及CD133+细胞所占的比例,并探索肿瘤细胞球发生上皮-间质转化与其转移能力之间的可能联系.方法:HCT116细胞在添加了细胞生长因子的无血清培养液(serum-free medium,SFM)中悬浮培养生成细胞球,应用激光共聚焦和流式细胞仪检测CD133表面标志分子的细胞定位及细胞球中CD133+细胞的含量.Transwell小室实验、免疫荧光及反转录PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)法分别检测细胞球的体外转移能力以及上皮-间质转化关键分子的表达情况.结果:HCT116细胞球中CD133表面标志分子定位于各个球层面的细胞膜,并且CD133+细胞比例显著增多.细胞球高表达间质化分子N-cadherin及Vimentin,而上皮化分子E-cadherin表达水平下降,并具有更强的转移能力.结论:HCT116细胞球中富含CD133+细胞,CD133表面标志分子定位于细胞膜,细胞球可能通过上皮-间质转化而获得更强的转移能力.
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癌组织中幽门螺杆菌球形体的超微结构研究
目的:揭示癌组织中幽门螺杆菌(Hp)球形体的超微结构特征.方法:通过透射电镜观察Hp球形体感染阳性的4例胃癌、2例食管癌组织中Hp球形体的超微结构.结果:Hp球形体多散在性分布于癌巢、癌间质以及进入癌细胞、巨噬细胞等细胞胞质.Hp球形体与其他细菌的L型样,形态不规则,呈多形性,且大小不等、胞质电子密度不等、胞壁缺失等.Hp球形体有A、B两种类型,A种体积较小,胞浆致密,细胞膜上带有鞭毛,此种活性较强;B种体积较大,胞浆疏松,细胞膜上不带鞭毛,此种可能已蜕变结论:Hp球形体仍具有活性,在Hp的传播、相关疾病的治疗复发和相关肿瘤的发生过程中起重要的作用.
