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库欣病的分子机制及靶向药物
由垂体瘤分泌过多的促肾上腺皮质激素导致的库欣综合征,又称为库欣病,首选治疗为手术治疗,放射治疗和药物治疗为其辅助治疗,但疗效均有限.近年来关于库欣病发病机制的研究集中于调控细胞增殖的异常蛋白表达和调控激素分泌的异常信号转导,靶点主要为表皮生长因子受体(EGFR)、细胞周期蛋白E(CDK2/Cyclin E)和热休克蛋白90(HSP90),相应的靶向药物吉非替尼、roscovitine和水飞蓟素均能有效减小肿瘤体积,降低促肾上腺皮质激素水平.
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滋养细胞疾病中Cyclin E及其相关蛋白的表达
目的：探讨细胞周期蛋白E（Cyclin E）、细胞周期蛋白依赖激酶2（CDK-2）、P27KIP1和P21WAF1/CIP1在正常胎盘组织、葡萄胎和滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN）组织中的表达，研究上述指标表达水平的相关性以及与妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblastic disease，GTD）的关系。方法：采用链霉素-过氧化物酶免疫组化方法检测30例正常胎盘组织、38例葡萄胎组织和9例GTN组织（侵蚀性葡萄胎8例，绒癌1例）中Cyclin E、CDK-2、P27KIP1和P21WAF1/CIP1的表达，分析其与GTD发生发展及预后的关系。结果：①Cyclin E、CDK-2在葡萄胎和GTN组织中的表达高于正常胎盘组织（P＜0.01）；P27KIP1和P21WAF1/CIP1在GTN组织中的表达低于葡萄胎和正常胎盘组织（P＜0.05）， P27KIP1和P21WAF1/CIP1在发生恶性转变的葡萄胎组织中的表达低于未发生恶变者（P＜0.05）。②Cyclin E与P27KIP1、P21WAF1/CIP1的表达呈负相关（P＜0.05）；Cyclin E与CDK-2的表达呈正相关（P＜0.05）；P27KIP1与P21WAF1/CIP1的表达呈正相关（P＜0.05）。CDK-2表达随P27KIP1和P21WAF1/CIP1的表达降低呈增高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：Cyclin E/CDK-2复合物及其抑制蛋白P27KIP1和P21WAF1/CIP1的异常表达参与了GTN的发生发展；P27KIP1和P21WAF1/CIP1可能成为预测葡萄胎恶变的有效标记物。
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CD44抗体对卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞增殖的抑制作用
目的:观察抗CD44单克隆抗体A3D8对卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞增殖的作用,并初步探讨其作用机制.方法:用MTS法检测A3D8及顺铂(DDP)对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪法观察A3D8对卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞细胞周期的影响;彗星电泳法检DNA损伤;通过westem blot法,进一步探讨A3D8作用于卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞后cDK2、cyclinA蛋白表达水平的变化.结果:A3D8作用于卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞后,细胞抑制作用明显增强(P<0.05),而且随着A3D8质量浓度的增加和时间的延长,抑制作用明显增强,与DDP联用,抑制率较单独用DDP增高;A3D8可将细胞周期阻滞于S期;A3D8作用于卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞24 h后可引起DNA损伤;A3D8组CDK2、cyclinA蛋白表达水平明显降低.结论:A3D8可能通过阻滞细胞周期发挥抑制卵巢癌实体瘤源球形体形成细胞增殖的作用.
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CDK2基因沉默联合达卡巴嗪对B16-F1黑素瘤的生长抑制作用
目的 探讨CDK2基因沉默后对达卡巴嗪(DTIC)治疗B16-F1黑素瘤抑瘤效应的影响.方法 实验设对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组,MTT法检测各组细胞生长抑制情况,计算药物相互作用指数(CDI值),AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况.建立C57 BL/6小鼠B16-F1细胞移植瘤模型,分组实验,持续观察18d,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组在72h的细胞相对存活率分别为(40.6±2.8)％、(45.2±3.7)％、(28.7±2.1)％,细胞凋亡率分别为(25.1±3.3)％、(15.6±2.2)％和(45.6±3.5)％,细胞相对存活率显著降低(F=458.04,P＜ 0.05)而细胞凋亡率显著升高(F=115.46,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组比DTIC组的细胞相对存活率显著降低(P＜0.01),而细胞凋亡率显著升高(P＜0.01);两药相互作用指数(CDI值)＜0.7.治疗第6天,对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤体积分别为(185.44±68.97) mm3、(83.91±14.33)mm3、(123.70±20.85) mm3、(34.54±10.72) mm3.从治疗的第6天开始,与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显降低(F=11.819,P＜0.05),而CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组(P=0.04);与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长抑制率分别为52.2％、41.2％、86.4％,组织细胞凋亡指数分别为(32.93±3.72)％、(21.62±3.54)％、(63.29±4.74)％,组织细胞凋亡指数显著升高(F=222.25,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组的组织细胞凋亡指数显著高于DTIC组(P＜0.01).结论 沉默CDK2基因的表达可以增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用,二者体外有协同效应,通过增加肿瘤细胞的凋亡是其机制之一.
关键词： 黑色素瘤 达卡巴嗪 细胞周期蛋白依赖激酶2 基因沉默 细胞凋亡 -
沉默Cdk7导致pRb和Cdk2磷酸化水平下降并诱导HepG2细胞凋亡
目的研究转染反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)对Cdk7特异性的沉默作用及其对体外培养人肝细胞癌HepG2细胞pRb和Cdk2磷酸化水平以及细胞周期进展的影响,确定Cdk7作为抗肿瘤药物研发靶点的可行性.方法以免疫印迹检测转染ASODN对Cdk7 的特异性沉默作用及其对pRb和Cdk2磷酸化水平的影响;以流式细胞术测定转染ASODN后细胞DNA含量,确定细胞周期进展和凋亡情况,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态.结果转染ASODN 72 h后,Cdk7蛋白水平显著下降,有明显剂量-效应关系,高可降至对照组的0.12±0.05;在ASODN浓度>100 nmol.L-1时,pRb和Cdk2磷酸化水平显著下降,两种蛋白的磷酸化水平与给药剂量有明显依赖关系.随转染ASODN浓度上升及转染时间的延长,G0/G1期细胞、凋亡细胞比例迅速升高,与对照组比较,出现明显的G0/G1期阻滞(P<0.01)和细胞程序性死亡(P<0.01) ;透射电子显微镜观察显示>50 nmol·L-1各组细胞具特征性凋亡形态.结论用ASODN沉默Cdk7可降低pRb以及Cdk2的磷酸化水平,使其生物活性下降,对体外培养HepG2细胞可产生显著的G0/G1期阻滞,引起细胞周期延长和细胞凋亡,产生抗增殖作用,可以Cdk7作为抗肿瘤药物研发的新靶点.
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细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A基因拷贝数变异及其与胰腺癌患者预后的关系
目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A)基因在胰腺癌中的拷贝数变异(CNV)情况及其与胰腺癌患者预后的关系.方法:利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库CNV与RNA Seq V2数据分析CDKN2A基因CNV与其mRNA表达水平的相关性,以及CDKN2A基因CNV对其他基因表达的影响.通过比对TCGA数据库及GTEx数据库比较CDKN2A基因在正常人与胰腺癌患者的表达差异,并分析CDKN2A基因CNV与胰腺癌患者预后的关系.应用DIVAD中基因本体分析(GO分析)联合KEGG对CDKN2A和其相关共表达基因进行功能基因富集分析.结果:通过对TCGA数据库挖掘发现,CDKN2A基因CNV与其mRNA表达呈正相关(Pearson:r=0.102,Spearman:r=0.257).CDKN2A基因CNV胰腺癌中HOXC6、SLC2A1 mRNA表达水平明显升高,GGA2、MTAP mRNA表达水平明显降低(均P<0.05).相关性研究发现,CDKN2A基因与MTAP mRNA呈明显正相关(Pearson:r=0.42,Spearman:r=0.55).通过对GTEx数据库分析,发现CDKN2A基因在胰腺癌组织中表达明显高于正常胰腺组织(P<0.05).携带CDKN2A基因CNV的胰腺癌患者总生存率与无瘤生存率均明显低于不携带该基因CNV的胰腺癌患者(均P<0.05).通过对包括CDKN2A相关共表达基因功能富集分析发现,这些共表达基因的功能主要集中于细胞周期的信号通路.结论:CDKN2A基因CNV在胰腺癌中是一种不良预后因素,可作为预测胰腺癌预后的指标.
关键词： 胰腺肿瘤 细胞周期蛋白依赖激酶2 DNA拷贝数变异 预后 -
pPICZαA-CDK2重组质粒的构建及表达
目的:构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的胞外分泌型pPICZαA-CDK2重组质粒,利用毕赤酵母表达体系表达CDK2蛋白.方法:从人白细胞中提取总RNA,逆转录后采用聚合酶链反应扩增出CDK2基因,并将其插入pPICZαA质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌JM109进行克隆.重组质粒pPICZαA-CDK2转化毕赤酵母菌株GS115,甲醇诱导酵母细胞进行蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况及抗原性.结果:PCR电泳及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到表达载体中;重组质粒转入酵母菌GS115,酵母经甲醇诱导表达后经SDS-PAGE检测发现在34 000左右有条带,Western-Blot检测发现有与CDK2单抗结合蛋白.结论:成功构建重组质粒,初步判断CDK2全长蛋白在毕赤酵母中表达成功且抗原性良好.
关键词： 细胞周期蛋白依赖激酶2 重组质粒 毕赤酵母
