首页 > 文献资料
-
小干扰RNA沉默脂肪酸合酶基因对人肝细胞株HepG2脂代谢的影响
目的：研究基因干扰技术沉默脂肪酸合酶（FAS）基因后对人肝细胞株HepG2细胞内外脂质含量及脂代谢相关基因表达的影响。方法：合成3对针对FAS mRNA不同位点序列的小干扰RNA（siRNA），分别转染至人肝细胞株HepG2，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测空白对照组（HepG2细胞不经过任何处理）、阴性对照组（转染没有任何基因干扰作用的阴性siRNA）、FAS-siRNA-1转染组、FAS-siRNA-2转染组和FAS-siRNA-3转染组的FAS mRNA的表达。蛋白免疫印迹（Western blot）法检测蛋白质的表达水平，筛选出沉默效果佳的一对siRNA。将有效siRNA转染至HepG2细胞，48 h后测定细胞内外甘油三酯及总胆固醇含量以及脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果：25 nmol/L siRNA和3μl/孔（24孔板）转染试剂的转染效率高。FAS-siRNA-3对HepG2的FAS基因的沉默效果好，FAS-siRNA-3转染组的FAS在mRNA水平和蛋白水平分别降低为空白对照组的（52.33±3.07）%和（51.57±3.14）%。FAS-siRNA-3沉默FAS基因后HepG2的细胞内和细胞外培养液中甘油三酯含量显著低于空白对照组，细胞外总胆固醇含量显著低于空白对照组。与空白对照组比较，FAS-siRNA-3转染组HepG2的肝脂酶基因mRNA表达水平显著升高（P<0.0001），微粒体甘油三酯转运蛋白基因mRNA表达水平显著降低（P<0.05），差异均有统计学意义。结论：FAS基因沉默可显著降低HepG2细胞内甘油三酯、细胞外培养液甘油三酯和总胆固醇的含量，需进一步的体内外实验加以验证。
关键词： 小干扰RNA 脂肪酸合酶 人肝细胞株HepG2 -
靶向Her2/neu基因小干扰RNA对肺腺癌Calu-3细胞株药物敏感性的影响
目的探讨转染靶向Her2/neu基因小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)对肺腺癌Calu-3细胞株药物敏感性的影响.方法实验分4组,未转染对照组、空载体组、非特异性siRNA组、Her2/neu siRNA组,实验重复5次.即用Her2/neu基因的特异性siRNA和非特异性siRNA通过阳离子脂质体LipofectAMINE 2000分别转染Calu-3细胞.采用流式细胞仪(FCM)检测各组Calu-3细胞Her2/neu蛋白和P糖蛋白(P-gp)的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测顺铂(DDP)对转染siRNA的癌细胞增殖水平的影响,应用膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)凋亡试剂盒检测各组Calu-3细胞的凋亡水平.结果 Her2/neu siRNA组Calu-3细胞Her2/neu蛋白表达的阳性率为(25.04±1.56)%、P-gp蛋白表达阳性率为(4.24±1.01)%,而未转染对照组、空载体组、非特异性siRNA组Her2/neu蛋白表达的阳性率分别为(98.24±2.23)%、(95.67±1.98)%、(94.79±0.87)%;P-gp蛋白表达阳性率分别为(5.11±2.98)%、(6.98±2.47)%、(5.59±3.66)%.Her2/neu siRNA组Calu-3细胞Her2/neu蛋白表达受到明显抑制(F=112,P<0.05);而P-gp的表达水平各组差异无统计学意义(F=2.45,P >0.05);Her2/neu siRNA联合DDP作用的细胞抑制率达(67.1±2.3)%,而未转染对照组、空载体组及非特异性siRNA组联合DDP细胞抑制率分别为(48.1±3.5)%、(46.3±5.9)%及(50.2±2.9)%,3组间抑制率差异无统计学意义(F=8.68,P>0.05),3组分别与Her2/neu siRNA组比较差异有统计学意义(P<0.01);FCM分析显示靶向Her2/neu基因特异性siRNA组Calu-3细胞的DDP诱导凋亡率为(35.6±3.4)%,明显高于未转染对照组的(8.8±0.5)%、空载体组的(9.6±1.7)%及非特异性siRNA组的(11.3±1.8)%,差异有统计学意义(F=10.68,P<0.01).结论靶向Her2/neu基因siRNA能增强肺腺癌Calu-3细胞株对顺铂的敏感性.
-
白细胞介素-1β小干扰RNA的设计、合成及筛选
目的 设计和合成针对白细胞介素-1β(IL-1β)的特异性小干扰RNA(siRNA),研究其对体外培养的薪西兰白兔膝关节滑膜成纤维细胞表达IL-1β mRNA的干扰作用,筛选出有干扰效果的IL-1β siRNA,为进一步构建IL-β特异性双链RNA(dsRNA)质粒载体创造条件.方法 参照siRNA的设计原则,采用Ambion公司提供的软件,利用Finder程序查找和设计针对IL-1βsiRNA的正义和反义寡核苷酸链.体外转录法合成4个IL-1β siRNA,将合成的IL-1β siRNA分别转染体外培养的新西兰白兔膝关节滑膜成纤维细胞,并以未转染细胞作为空白对照,采用RT-PCR技术检测所合成的IL-1β siRNA对体外培养的兔滑膜成纤维细胞IL-1βmRNA表达的影响.结果转染48小时后,4条IL-1βsiRNA链中有1条(L4)能够使兔滑膜成纤维细胞IL-1β mRNA的表达水平明显下调,其余3条IL-1β siRNAs链未见明显的干扰效果.结论 不同的IL-1βsiRNA对兔膝关节滑膜成纤维细胞IL-1βmRNA表达水平具有不同的干扰效能.成功筛选出1个有效的IL-1β siRNA,初步提示RNA干扰技术可用于抑制兔膝关节滑膜成纤维细胞IL-1β mRNA的表达.
-
小干扰RNA抑制胃癌细胞环氧合酶-2的表达
目的 观察瞬时转染环氧合酶-2特异性小干扰RNA(COX-2 siRNA)对胃癌细胞增殖与凋亡的影响,探讨COX-2在胃癌发生中的作用和RNA干扰方法 对肿瘤的治疗作用.方法 以胃癌细胞系SGC7901为研究对象,瞬时转染COX-2 siRNA,转染后72 h用RT-PCR方法 分别检测COX-2siRNA组、无意义siRNA组及空白对照组的COX-2 mRNA表达;免疫组化法与Western blot检测3组细胞的COX-2蛋白质的表达;流式细胞仪检测3组的细胞周期和凋亡情况.转染后1周内每天同一时间用噻唑蓝比色分析法(MTr)检测3组癌细胞的活力并计算癌细胞的相对生存率.结果 COX-2siRNA对胃癌细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达均有明显抑制作用,胃癌细胞增殖受到抑制,凋亡增加,但细胞周期分布无明显变化.结论 在胃癌细胞中,COX-2表达的抑制可降低胃癌细胞的增殖速度,促进肿瘤细胞凋亡,COX-2在胃癌的发生中可能具有重要作用.
-
转化生长因子-β早期反应基因小干扰RNA对糖尿病大鼠肾组织内Smad7蛋白及Ⅳ型胶原表达的影响
目的 构建慢病毒载体表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)以沉默转化生长因子-β(TGF-β)早期反应基因(TIEG),观察其对糖尿病大鼠肾组织中Smad信号蛋白通路负反馈调节因子Smad7及对细胞外基质主要成分Ⅳ型胶原的影响作用.方法 选取体莺200～230 g的SD雄性大鼠15只,分为3组,对照组5只,其余10只用链脲佐菌素(STZ)诱导制成糖尿病大鼠模型,随机分为TIEGsiRNA治疗组(5只)和空载体组(5只),治疗组和空载体组于成模后分别予TIEGsiRNA病毒液和空载体液尾静脉注射,治疗4周后实时PCR检测大鼠肾组织内TIEG的表达水平;Westernblot和免疫组化检测Smad7蛋白表达水平;免疫组化检测Ⅳ型胶原蛋白表达水平;MASSON染色检测胶原生成.单因素ANOVA方差分析,方差不齐用Kruskal-Wallis秩和检验.结果 免疫组化半定量结果示Smad7蛋白在TIEGsiRNA治疗组(3.2±0.2)%较空载体组(1.7±0.5)%表达明显增多,Western-blot也同样验证了免疫组化结果(F=7.934,P=0.006),IV型胶原蛋白在TIEGsiRNA治疗组[(3.7±0.4)%]较空载体组[(4.8±0.4)0%]表达明显减少,MASSON染色半定量结果示纤维化程度在TIEGsiRNA治疗组[(3.5±0.4)%]较空载体组[(4.4±0.4)%]减少,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 TIEGsiRNA可以通过上调糖尿病大鼠肾组织内Smad信号蛋白通路负反馈调节因子Smad7减少肾脏纤维化来延缓糖尿病进程.
-
小干扰RNA沉默信号转导和转录激活因子1对支气管哮喘小鼠气道炎症的调控作用研究
目的 研究信号转导和转录激活因子1(STAT1)在支气管哮喘(简称哮喘)小鼠肺组织的表达,探讨STAT1特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对哮喘小鼠气道炎症的调控作用.方法 构建STAT1特异性发夹样RNA干扰重组体质粒,用脂质体转染γ干扰素(IFN-γ)刺激后的人气道上皮细胞(16HBE),检测其干扰活性.24只BALB/c小鼠随机分为PBS组、PG-HK组和STAT1组.用新鲜配制的OVA混悬液(100 mg OVA和100 mg氢氧化铝干粉加入1 ml生理盐水制成)腹腔注射致敏和OVA溶液滴鼻,用已构建好的转染效率较高的STAT1 siRNA于第26天至第29天滴入实验组,另两组分别用等容量的生理盐水或随机构成的RNAi片段滴鼻,末次滴鼻后5 h处死取支气管肺泡灌洗液计数浸润的细胞数(特别是嗜酸粒细胞)及检测IFN-γ、白介素4(IL-4)的水平,肺组织做免疫组织化学染色及HE切片染色.结果 STAT1靶向RNA干扰重组体成功构建,并能够高效转染人气道上皮细胞.STAT1特异性siRNA真核表达载体可抑制人气道上皮16HBE细胞中STAT1的表达.STAT1 siRNA能减轻哮喘小鼠的气道中嗜酸粒细胞浸润并抑制IL-4的表达,肺组织中STAT1蛋白表达减少,而IFN-γ的水平较高.结论 STAT1特异性siRNA能抑制人气道上皮16HBE细胞中STAT1的表达,并能抑制哮喘小鼠的气道炎症反应.
关键词： 支气管哮喘 小干扰RNA 信号转导和转录激活因子1 -
小干扰RNA在肝病中的应用进展
近年来,RNA干扰(RNAi)技术已成为分子生物学研究领域的新热点,已广泛应用于许多研究领域,尤其是在肝病治疗方面,取得了一些突破性进展.它不仅能够发挥抗肝炎病毒作用,还能够调节细胞增殖、凋亡、抑制致病基因的表达、影响细胞的信号转导等方面的作用,可能成为肝病治疗有效的潜在手段.
-
小干扰RNA在肝癌治疗中的应用
小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是21～23 nt的短双链RNA,将哺乳动物细胞内特异基因的mRNA特异性降解而使基因失活,引起转录后沉默该基因的作用.siRNA技术在人类恶性肿瘤的基因治疗有特异而强烈的作用,具有非常广阔的情景,但其稳定性是有待解决的新问题.本文针对siRNA在肝癌治疗中的研究现状进行综述.
-
腺相关病毒和慢病毒作为小干扰RNA转运载体的比较
目的 观察以腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和慢病毒(Lenti virus)为载体、含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1、具有较强抑制作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)感染大鼠肝星状细胞系(hepatic stellate cell,HSC)-T6的感染效率和其对TIMP-1的表达抑制作用.方法 挑选针对大鼠TIMP-1基因具有较强抑制作用的siRNA序列,在体外构建为短发夹表达载体后,将其包装为重组AAV/siRNA-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP,同时包装阴性对照AAV/GFP和Lenti/GFP,并以MOI=10感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,感染后72 h,通过流式细胞仪及荧光显微镜观察病毒的感染效率.在感染后7 d,应用Western bloting方法检测TIMP-1蛋白表达情况.结果 感染HSC-T6后细胞形态、增生速度未发生明显变化.通过流式细胞仪及荧光显微镜证实感染效率分别为:空载体AAV/GFP和Lenti/GFP组分别为72.7%和70.0%,AAV/siRNA.TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP感染组分别为64.58%和61.86%.与正常细胞相比,感染后7 d,siRNA感染组TIMP-1蛋白表达均下降约40.0%,但两组siRNA感染组下降幅度无统计学意义.结论 构建的重组AAV/siRNA-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA.TIMP-1/GFP均可有效感染大鼠HSC-T6,感染效率相近,且均可在短期内有效抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6 TIMP-1蛋白的表达.
关键词： 腺相关病毒 慢病毒 小干扰RNA 金属蛋白酶组织抑制因子-1 肝星状细胞 -
RNA干扰沉默CTGF表达对人成骨样MG63细胞Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达的影响
目的 本研究将利用RNA干扰技术,阻断CTGF在人成骨样MG 63细胞中的表达,观察CTGF 降表达后对人成骨样MG 63细胞Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶mRNA表达的影响.方法 针对人CTGFmRNA 440、875、910位点设计、合成3对21核苷酸siRNA(siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3);在阳离子脂质体介导下转染人成骨样MG 63细胞,以空白及非特异性siRNA作为对照,转染48 h后收集细胞.采用Northern杂交研究CTGF mRNA表达水平的改变,半定量RT-PCR观察Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达的改变,Western blotting观察CTGF蛋白表达的变化.MTT法测定RNA干扰后人成骨样MG 63细胞活力的改变.结果 空白对照组相比,转染siRNA 1、mRNA 3的MG 63细胞CTGF mRNA和蛋白表达明显下调,转染siRNA 2及非特异性siRNA的MG 63细胞CTGF的表达无明显变化.转染siRNA 1、siRNA 3的MG63细胞Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达明显下调,细胞活力明显降低.结论 针对人CTGF mRNA设计、合成的siRNA可有效抑制人成骨样MG 63细胞CTGF的转录和表达;CTGF表达下调可抑制MG 63细胞表型标志物Ⅰ型胶原、ALP mRNA的表达,降低MG 63细胞活力,这说明CTGF可能在维持骨代谢平衡中具有重要的作用.
-
基于小干扰 RNA 构建的长发夹 RNA 表达载体对 HBV 基因复制和表达的抑制作用
目的：研究靶向HBV X（ HBx）基因的长发夹RNA （ lhRNA）表达载体对HBV基因复制和表达的影响。方法以HBx为靶点，合成四条小干扰RNA（ siRNA）寡核苷酸并构建lhRNA表达载体。 siRNA寡核苷酸序列（4个转染组）或长发夹 RNA （ lhRNA ）表达载体（2个转染组）转染HepG2．2．15细胞后，通过时间分辨免疫荧光法、荧光定量PCR及反转录PCR分别检测细胞培养上清液中的乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg）、HBV DNA及细胞内的HBx mRNA水平。以转染阴性序列或空载体为阴性对照组。采用独立样本t检验评估siRNA对HBV基因复制和表达的抑制效果。结果与阴性对照组相比， siRNA-1及 siRNA-4组以较高浓度（60 nmol／L 或90 nmol／L ）转染入HepG2．2．15细胞后，培养上清液中的HBsAg、HBV DNA及HBx mRNA水平均显著降低（P＜0．05），其中，siRNA-1组在转染后不同时间点（24，48，72 h）细胞培养上清液中的HBsAg和HBV DNA载量均较对照组显著降低（ P＜0．05或P＜0．01）。构建成功两个lhRNA表达载体：pMD-HBxlh1和pMD-HBxlh4，其转染入细胞后，培养上清液中的 HBsAg 及 HBV DNA 水平显著低于阴性对照组（ P ＜0.05）。结论新证实一个HBx基因的有效干扰靶点即 siRNA-1。靶向HBx的lhRNA 表达载体pMD-HBxlh1和pMD-HBxlh4可有效抑制HBV基因的复制和表达。
-
小干扰RNA对肾癌细胞Ki67基因表达及其增殖的抑制作用
目的 探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞增殖基因Ki67表达及其增殖、凋亡的影响.方法 将Ki67 siRNA(100 nmol/L)转染人肾癌786-0细胞.采用RT-PCR、免疫印迹、免疫组化技术检测Ki67 mRNA及蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡.结果 Ki67 siRNA处理组786-0细胞Ki67 mRNA表达(37.6±1.9)%、Ki67蛋白表达(46.4±0.9)%、免疫组化Ki67表达吸光度(A)值52.5±2.3,阴性siRNA对照组分别为(97.3±0.9)%、(95.3±0.9)%、114.5±4.9,2组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).Ki67 siRNA处理组细胞增殖抑制率(63.6±1.6)%、凋亡细胞阳性率(41.7±0.6)%,阴性siRNA对照组分别为(2.8±0.2)%、(10.3±1.4)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肿瘤增殖基因Ki67 siRNA能抑制人肾癌786-0细胞Ki67基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具.
-
性别决定区Y框蛋白18在前列腺癌中的表达及其对细胞功能的影响
目的 探讨性别决定区Y框蛋白18(sex determining region Y-box 18,SOX18)在前列腺癌中的表达及其对细胞功能的影响.方法 通过免疫组化染色法检测SOX18在98例前列腺癌及其对应的81例正常组织中的表达差异;利用实时荧光定量PCR及蛋白印迹法验证SOX18在前列腺癌细胞系中的表达.利用小干扰RNA对前列腺癌细胞进行转染,通过细胞增殖、迁移及侵袭实验评估SOX18对细胞功能的影响.结果 在98例癌组织中,SOX18高表达阳性率为73.5％(72/98),明显高于癌旁组织(43.2％,35/81) (P ＜0.01).SOX18高表达的患者在临床分期Ⅲ ～ Ⅳ期、病理分级G3 ～4及Gleason评分≥8分者中所占比例明显高于临床分期Ⅰ～Ⅱ期[83.7％(36/43)与65.5％(36/55),x2=4.131,P=0.042]、病理分级G1 ～2 [88.6％(39/44)与61.7％ (33/54),X2=9.424,P=0.002]及Gleason评分≤7分者[85.0％(34/40)与65.0％(38/58),x2=4.610,P=0.032],而不同年龄患者的SOX18高表达比例差异无统计学意义[77.3％(38/54)与70.4％(34/44),x2=0.539,P =0.441].干扰前列腺癌细胞系(PC3和DU145)中SOX18的表达后,细胞的增殖、迁移和侵袭等能力明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 SOX18在前列腺癌中高表达,且促进前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭等能力.
关键词： 前列腺癌 性别决定区Y框蛋白18 小干扰RNA 细胞增殖 细胞迁移 -
靶向沉默Notch1基因对肾透明细胞癌增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响
目的 探讨RNA靶向沉默Notch1基因对肾透明细胞癌的增殖、凋亡及蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(protein kinase B/mammalian target of rapamycin,Akt/mTOR)信号通路的影响.方法 设计针对Notch1基因小干扰RNA(siRNA)片段,经脂质体转染入786-0细胞,RT-PCR及蛋白印迹法检测其干扰效果;MTT法绘制细胞生长曲线,TUNEL法分析细胞凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3及Akt/mTOR信号途径相关蛋白Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(Phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的表达.结果 Notch1 siRNA转染786-O细胞后,Notch1基因的mRNA、蛋白表达均明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).经Notch1 siRNA 0、40、60、80、100、120 nmol/L作用24 h后,786-0细胞的增殖率分别为(98.51±1.33)％、(87.34±2.26)％、(64.72±3.24％)％、(57.68±3.32％)％、(31.91±1.85)％、(19.27 ±2.73)％,随Notch1 siRNA浓度的增加细胞增殖率下降,差异有统计学意义(F=47.65,P＜0.01).0、40、80、120 nmol/L Notch1 siRNA处理786-O细胞24 h后,凋亡率分别为(7.6±3.8)％、(21.5±4.8)％、(32.3±3.5)％、(46.3±4.7％)％,随着Notch1 siRNA浓度的增加细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P＜0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2、pro-caspase 3的表达下降;干扰Notch1基因后Akt总蛋白未见明显变化,而p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达下降.结论 靶向沉默Notch1基因后,可抑制786-O细胞增殖,诱导细胞凋亡;沉默Notch1基因可通过去磷酸化抑制该Akt/mTOR信号通路.
-
靶向OX40基因的siRNA抑制大鼠肝脏移植排斥反应的研究
目的 探讨RNA干扰阻断OX40-OX40L共刺激通路对大鼠移植肝存活时间的影响.方法 制作原位肝脏移植物大鼠模型,供体DA大鼠,受体Lewis大鼠.移植术毕时将5 ml含5×109pfu的pLVTHM-OX40-siRNA重组慢病毒经阴茎背静脉在10秒内注射受鼠体内,术后观察受鼠存活时间,移植肝脏进行组织病理学检查,采用ELISA法检测大鼠外周血IL-2、IFN-γ的水平,并进行受者大鼠脾细胞对供者大鼠脾细胞的混和淋巴细胞反应(MLR). 结果转染组大鼠肝脏移植物的存活时间为(74.0±9.3)d,明显长于对照组(7.3±0.5)d和未转染组(7.5±0.5)d;转染组移植肝组织炎细胞浸润、间质水肿、肝组织坏死程度较对照组和未转染组减轻;耐受组大鼠脾脏中T淋巴细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力较对照组降低(t=25.1,P＜0.01);移植术后第7 d,转染组血清IL-2浓度为(46±8.4)pg/ml,IFN-γ浓度为(202.7±14.6)pg/ml,均显著低于对照组和未转染组(分别t=176.4,45.5,P＜0.01).结论 转染靶向OX40的siRNA,可通过阻断OX40-OX40L共刺激通路,抑制大鼠肝脏移植后的排斥反应,延长大鼠移植肝的存活时间.
-
靶向沉默SPHK1基因诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡
目的 探讨用小干扰核酸 (Small interfering RNA,siRNA)靶向沉默神经鞘氨酸激酶1(sphingosine kinase1,SPHK1)基因敲除后对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响.方法 人工化学合成SPHK1 siRNA和对照siRNA,分别转染胃癌SGC-7901细胞.Western blot法检测SPHK1、Bcl-2和Bax蛋白的表达;流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡的变化.结果 SPHK1 siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,SPHK1蛋白表达明显下调;与对照组相比,SPHK1 siRNA转染组Bcl-2蛋白表达下调了55%(P < 0.01),Bax蛋白表达差异无统计学意义,Bcl-2/Bax比值下调54%(P < 0.05);SPHK1 siRNA转染组早期凋亡细胞明显增多(P < 0.01),晚期凋亡细胞无明显变化.结论 SPHK1特异性siRNA可阻断SGC-7901细胞SPHK1蛋白的表达,并通过影响Bcl-2通路诱导细胞凋亡.
-
抗血小板衍生生长因子小干扰RNA表达质粒构建及其对肝星状细胞的影响
目的 研究靶向PDGF-B链的小干扰RNA(siRNA)对肝星状细胞(HSCs)细胞外基质分泌的影响.方法 根据PDGF-B链序列设计合成siRNA序列,将siRNA序列插入pSilencer 3.1-H1hygro质粒,酶切后测序鉴定;PDGF-B链siRNA表达质粒转染HSCs,潮霉素筛选阳性细胞株,RT-PCR和Western blot分别检测PDGF Mrna和蛋白的表达;将各组筛选的阳性HSCs细胞株培养,MTT观察各组细胞增殖,放射免疫法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达. 结果 成功构建3种表达PDGF-B链siRNA表达质粒,RT-PCR和Western blot结果表明各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF Mrna和蛋白表达均有明显抑制.PDGF-B链siRNA表达质粒HSCs细胞组较对照组能明显降低HSCs增殖,下调透明质酸和Ⅲ型前胶原表达.结论 靶向PDGF-B链的siRNA能降低HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力,具有抗纤维化治疗的潜力.
-
siRNA磁性纳米颗粒协同外磁场对膀胱癌细胞存活素基因表达和凋亡的影响
目的 观察葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)在外磁场协同作用下转染存活素(survivin)小干扰RNA(siRNA)重组质粒对膀胱癌细胞survivin基因表达和凋亡的影响.方法 利用化学共沉淀法制备DMN并作为基因载体,通过多聚赖氨酸静电吸附siRNA-survivin重组质粒,并在外磁场的协同作用下体外转染人膀胱癌BIU-87细胞,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术法、逆转录聚合酶链反应和Western Blotting检测BIU-87细胞的生长抑制率(IR)、凋亡指数(AI)、survivin mRNA及其蛋白的相对表达水平.结果 构建的siRNA-DMN直径、有效粒径、比饱和磁化强度分别为10～12 nm、94.8 nm、0.19 emu/g.DMN在外磁场的作用下转染siRNA-survivin入BIU-87细胞后的IR(39.60%)、AI(28.72%)均分别显著高于对照组和无磁场作用的DMN组(1.99%、3.75%和20.96%、16.71%)(P＜0.05),survivin mRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于后两组.结论 DMN在外磁场的协同作用下转染siRNA-survivin质粒入BIU-87细胞后可有效抑制survivin基因表达并诱导细胞凋亡.
关键词： 膀胱肿瘤 脱噬作用 Survivin基因 纳米颗粒 小干扰RNA -
siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用
目的构建并筛选出有效的HPV16 E6基因特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,观察其对宫颈癌细胞中HPV16 E6基因表达的长期影响,探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制,为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新方法.方法构建Hairpin siRNA质粒,稳定转染宫颈癌SiHa细胞,鉴定转染细胞中的质粒DNA,通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达,采用Western-blot检测p53、p21等蛋白的变化.MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线.结果HPV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞,可以在细胞内长期表达siRNA,有效抑制细胞内HPV16 E6基因的表达.E6A siRNA能抑制细胞生长,作用持续达4个月以上.结论利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HPV E6病毒癌基因可能是治疗HPV感染和宫颈癌的一种新的理想方法.
-
基于基因数据库及平台分析SERPINA3在胶质母细胞瘤中的表达及意义
目的 研究SERPINA3基因在胶质母细胞瘤中的表达和意义.方法 检索Oncomine数据库中不同胶质母细胞瘤队列SERPINA3的表达情况,结合R2数据库分析SERPINA3的表达与胶质母细胞瘤生存状况的关系.设计并合成靶向SERPINA3的小干扰RNA,转染U87人胶质母细胞瘤细胞系;采用Western blot方法检测U87细胞中SERPINA3的表达;通过CCK-8增殖实验、克隆形成实验和Transwell体外侵袭实验检测SERPINA3基因表达下调对U87细胞增殖和侵袭能力的影响.结果 Oncomine数据库中符合筛选条件的4项研究中胶质母细胞瘤SERPINA3相比正常脑组织呈高表达,R2数据库检索发现胶质母细胞瘤SERPINA3高表达队列生存明显劣于低表达队列.U87细胞转染小干扰RNA可成功抑制SERPINA3的表达,且其增殖和体外侵袭能力显著下降.结论 SERPINA3在胶质母细胞瘤中表达水平增高且与预后不良有关.抑制SERPINA3的表达可降低胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力,可能成为新的分子治疗靶点.
关键词： 胶质母细胞瘤 SERPINA3 Oncomine数据库 小干扰RNA
