首页 > 文献资料
-
RNAi技术及其在胶质瘤治疗中的研究进展
目的:介绍RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术及其在胶质瘤治疗中的研究进展.方法:应用计算机检索CHKD期刊全文数据库及PubMed检索系统,以RNAi为
-
Vav3对Lewis细胞增殖与凋亡影响观察
目的:探讨Vav3调节Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的作用及机制.方法:小分子干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)下调Lewis肺癌细胞中Vav3蛋白的表达;蛋白质印迹法检测转染siRNA Vav3后Vav3及JNK蛋白表达的变化;MTT方法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:转染siRNA后,干扰组Vav3表达为0.154±0.024,较Lewis肺癌细胞组的0.4 1 7±0.073和对照组的0.383±0.049明显下调,F-22.052,P=0.002.下调Vav3表达后,干扰组JNK蛋白表达水平为0.619±0.008,与肺癌细胞组的1.251±0.117和对照组的1.192±0.092相比较明显下调,F—54.770,P＜0.001.与肺癌细胞组细胞生存率(100.00±0.00)％和对照组(95.33±3.14)％相比,干扰组(75.87±2.30)％明显下降,P值分别为0.0002和0.0003.与肺癌细胞组细胞凋亡率(3.55±0.03)％和对照组(4.18±0.17)％相比,干扰组(12.16±0.02)％明显上升,P值分别为0.000 l和0.0001.结论:下调Vav3表达,抑制Lewis肺癌细胞的增殖,并且促进肺癌细胞凋亡;Vav3发挥作用可能与JNK信号激活有关.
-
婆罗双树样基因2对A2780细胞生长及转移影响
目的 婆罗双树样基因2(sal-like gene 2,SALL2)作为肿瘤抑制基因,在多种肿瘤细胞的生长过程中发挥调控作用.本研究旨在探讨SALL2基因对卵巢癌(ovarian cancer,OC) A2780细胞生长和转移的影响.方法 采用小干扰RNA(small-interfering ribonucleic acid,siRNA)转染OC A2780细胞以沉默SALL2,设载体组及空白对照组.采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测SALL2的表达.采用CCK-8和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞增殖,采用FCM检测细胞凋亡.应用划痕实验检测细胞迁移,采用侵袭实验检测细胞侵袭.结果 A2780细胞高表达SALL2的mRNA及蛋白.RT-PCR结果显示,转染siRNA2和siRNA3 48 h后,空白对照组、载体组、siRNA2和siRNA3组平均2-△△Ct值分别为1.000±0.030、0.942±0.053、0.207±0.041和0.465±0.007,差异有统计学意义,F=8.213,P=0.024.转染siRNA2和siRNA3 48 h后,空白对照组、载体组及siRNA2和siRNA3组蛋白表达相对灰度比值分别为0.629±0.035、0.603±0.072、0.225±0.004和0.453±0.061,差异有统计学意义,F=11.629,P=0.018.siRNA2组转染72 h后的细胞增殖力(4.285±0.026)显著高于载体组(3.622±0.029)和空白对照组(3.614±0.016),差异有统计学意义,F=34.023,P=0.012.siRNA2组转染48 h后的细胞凋亡率为(49.17±2.03)％,显著低于载体组的(56.82±2.74)％和空白对照组的(58.39±2.45)％,差异有统计学意义,F=5.781,P=0.037.siRNA2组转染48 h后处于G0/G1期的细胞比例为(47.87±1.28)％,均显著低于载体组的(55.27±1.46)％与空白对照组的(56.60±1.57)％,差异有统计学意义,F=4.213,P=0.032.siRNA2组转染48 h后划痕愈合率为(78.925±6.133)％,明显高于载体组的(38.504±3.772)％和空白对照组的(42.169±4.103)％,差异有统计学意义,F=17.184,P=0.006.siRNA2组转染48 h后穿过基质胶的细胞数(147.169±7.208)显著高于载体组(92.169±11.052)和空白对照组(95.169±9.830),差异有统计学意义,F=12.698,P=0.014.结论 SALL2沉默促进A2780细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡.
-
SS-PEI/核酸纳米复合物的构建分析
目的:构建一种可生物降解的基因载体,并观察其体外转染DNA/siRNA的效率和细胞毒性.方法:采用低分子质量PEI与3,3'-二硫代二丙酸在催化剂作用下合成可降解的PEI衍生物SS-PEI,用红外波谱仪和核磁波谱仪分析其化学结构；动态光散射分析动态光散射(dynamic light scattering,DLS) SS-PEI/DNA和SS-PEI/siRNA的粒径；采用流式细胞技术(FCM)和荧光激活细胞分类术(FACS)分别分析SS-PEI对GFP-DNA和FAM-dsRNA的转染率；通过GFP表达水平分析SS-PEI对GFP质粒和GFP-siRNA的转染效率；采用考马斯蓝法分析SS-PEI/DNA和SS-PEI/siRNA的细胞毒性.结果:红外波谱和核磁波谱与SS-PEI理论波谱一致；DLS结果显示,SS-PEI/DNA复合物粒径为95～175 nm,SS-PEI/siRNA平均粒径约200 nm.FCM结果显示,SS-PEI对DNA的大转染率为(25.2±2.3)％,稍低于HWPEI组的(33.8±3.1)％；SS-PEI/GFP-DNA转染后GFP的表达水平与HWPEI转染组接近[(150±7)FI(A.U.)/mg蛋白vs(168±18) FI(A.U.)/ng蛋白],差异无统计学意义,t=1.62,P=0.18；细胞毒性分析显示,SS-PEI/DNA组细胞活力(89±5.2)％,显著高于HWPEI/DNA组的(70±4.9)％,差异有统计学意义,t=4.61,P=0.001.FACS结果显示,SS-PEI对FAM-dsRNA的转染率为(86.5±2.5)％；SS-PEI转染GFP-siRNA,靶基因GFP被显著敲除,相对表达水平为(42±3.5)FI(A.U.)/mg蛋白,与对照组的(79±10.8)FI(A.U.)/mg蛋白相比差异有统计学意义,t=5.64,P=0.004.结论:SS-PEI的合成可明显提高装载核酸的效率,具有低毒和高效等特点.
-
Vav3表达下调对Lewis肺癌细胞体外侵袭能力影响的研究
目的:通过下调Lewis肺癌细胞中Vav3的表达,观察其对肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响,探讨Vav3在肺癌转移过程中发挥的作用.方法:体外化学合成Vav3特异性siRNA(Vav3-163),并转染至Lewis肺癌细胞.蛋白质印迹法检测转染前后细胞中Vav3表达水平.Transwell小室实验观察下调Vav3对Lewis肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响.结果:蛋白质印迹检测结果显示,转染Vav3 163序列后,Lewis肺癌细胞中Vav3的表达明显下调.实验组Vav3表达(0.112±0.005)低于LLC组(0.408±0.004)和对照组(0.388±0.005),F=22.052,P=0.002.下调Vav3在Lewis肺癌细胞中的表达后,迁移实验中干扰组穿过膜细胞数(31.0±10.5)明显少于Lewis肺癌细胞组(56.0±5.4)和对照组(49.0±9.1),F=11.213,P=0.002;体外侵袭实验中干扰组穿过人工基底膜细胞数(21.0±6.6)明显少于Lewis肺癌细胞组(59.0±9.8)和对照组(43.0±18.0),F=11.692,P=0.002.结论:下调Lewis肺癌细胞中Vav3的表达,具有抑制肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的作用.
-
RNA干扰Hedgehog信号通路对胃癌细胞增殖和凋亡影响及其机制的探讨
目的:观察RNA干扰Hedgehog信号通路关键因子Glil对胃癌细胞的生物学行为的影响并分析相关机制.方法:人工合成靶向Hedgehog信号通路活化关键因子Glil的siRNA(Glil siRNA)和对照无关siRNA(Con siRNA),应用脂质体将其转入人胃癌细胞SGC-7901,48 h后收集细胞,分别应用MTT法和流式细胞仪检测对细胞增殖、周期和凋亡的影响,同时应用TaqMan探针实时定量PCR检测靶基因Glil、Hedgehog活化标志基因PTCH1、细胞周期负调控蛋白基因CDKN1A(p21)和抗凋亡基因Bel-2的表达变化.结果:以单纯转染剂对照组为参照,siRNA转染后48 h,Glil siRNA和Con siRNA的抑制率分别为(53.33±6.06)%和(13.33±6.11)%,两组差异有统计学意义,t=5.701,P=0.005,n=3;G0/G1期分别为(80.67±4.51)%和(66.00±3.10)%,两组差异有统计学意义,t=5.500,P=0.005,n=3;凋亡率分别为(15.97±1.76)%和(7.77±1.11)%,两组差异有统计学意义,t=4.671,P=0.01,n=3;GlilsiRNA转染细胞内Glil、PTCH1、Bcl-2和CDKN1A(p21)基因的相对(参照单纯转染剂)表达分别为对照的0.24±0.11、0.43±0.09、0.52±0.13和2.10±0.30.分别与Con siRNA相比4条基因表达均差异有统计学意义,t=9.759,P=0.001,n=3;t=8.645,P=0.001,n=3;t=4.940,P=0.008,n=3;t=5.962,P=0.004,n=3.结论:应用RNA干扰技术可以阻断Hedgehog信号通路关键因子Glil的表达,抑制Hedgehog信号通路活化,从而有效地抑制胃癌细胞的增长,诱导凋亡,可能成为治疗胃癌新的生物靶向治疗途径.
-
抑制CCDC12基因对结直肠癌细胞HCT116凋亡影响机制研究
目的 卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain containing,CCDC)结构基因家族与一部分肿瘤关系密切,但CCDC12与结直肠癌的关系还不明确.本研究探讨CCDC12基因对结直肠癌细胞HCT116凋亡的影响及其可能机制.方法 clone-67小干扰RNA(clone-67-siRNA)转染结肠癌细胞系HCT116抑制CCDC12表达;通过细胞计数法CCK-8检测细胞增殖情况;通过流式细胞术检测凋亡率;RT-qPCR和蛋白质印迹法检测对照组、con-siRNA组及转染组HCT116细胞CCDC12、PI3K、p-AKT和mTOR基因和蛋白表达.采用SPSS 17.0进行统计分析,分别采用t检验或单因素方差分析来比较各组间统计学差异.结果 clone-67-siRNA能有效沉默HCT116细胞CCDC12基因的表达,clone-67-siRNA沉默细胞中CCDC12基因后24 h检测到CCDC12基因表达为(35.68±2.97)％,48 h表达为(76.25±3·03)％,72 h表达为(54.33±1.51)％.抑制HCT116细胞中CCDC12表达后,转染组细胞活性(74.52±11.46)％明显低于对照组(100±14.33)％和con-siRNA组(95.97±13.53)％,F=10.825,P<0.001;凋亡率clone-67-siRNA组为(26.30±3.57)％,明显高于对照组的(13.10±2.15)％和con-siRNA组的(11.66±1.77)％,F=28.640,P<0.001.clone-67-siRNA转染HCT116后细胞中CCDC12、PI3K、p-AKT和mTOR的表达均降低,RT-qPCR结果(FCCDC12=38·796,PCCDC12<0.001;FPI3K=25.538,PPI3K=0.001;FPI3K=23.074,PPI3K=0.002;FPI3K=29.372,PPI3K=0.001)和蛋白质印迹结果(FPI3K=12.077,PPI3K=0.008;FPI3K=16.470,PPI3K=0.004;FPI3K=25.455,PPI3K=0.001)符合.结论 利用clone-67-siRNA抑制结直肠癌HCT116细胞CCDC12基因后可以显著抑制细胞活性,并增加细胞凋亡,其机制可能通过PI3K-AKT-mTOR信号通路途径影响.
-
靶向抑制Survivin基因对子宫内膜癌细胞增殖与凋亡影响
目的 肿瘤形成与细胞凋亡异常密切相关,Survivin基因是凋亡抑制蛋白家族中强细胞凋亡抑制因子之一.本研究利用特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术抑制人RL95-2子宫内膜癌细胞Survivin基因表达,探讨沉默Survivin基因对人子宫内膜癌细胞增殖和凋亡影响.方法 合成靶向Survivin基因siRNA特异性序列,脂质体转染人RL95-2子宫内膜癌细胞,转染6 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率.转染48 h后,应用qPCR检测Survivin mRNA水平的变化,蛋白质印迹法检测Survivin蛋白的表达.细胞转染72 h后,CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡变化.结果 脂质体介导siRNA转染效率达到61.3％(6130/10000).转染48 h后,qPCR检测结果显示,实验组Survivin mRNA表达量为0.240±0.023,对照组为0.998±0.030,空白组为1.006±0.022.转染48 h后,蛋白质印迹法检测结果显示,实验组Survivin蛋白相对表达量为0.371±0.089,对照组为0.639±0.127,空白组为0.619±0.094,各分组Survivin蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义,F=6.100,P=0.036.细胞转染72 h后,实验组吸光度值为0.558±0.088,对照组为1.047±0.128,空白组为1.116±0.159,各分组吸光度值比较,差异有统计学意义,F=17.075,P=0.003.转染72 h后,实验组细胞早期凋亡率为(18.9±3.44)％,对照组为(3.7±1.09)％,空白组为(3.1±1.22)％,各分组细胞早期凋亡率比较,差异有统计学意义,F=49.728,P=0.018.结论 应用 siRNA 技术沉默 Survivin 基因表达,可降低 RL95-2 子宫内膜癌细胞生长速度,抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡.Survivin 基因可作为抗子宫内膜癌治疗潜在靶点.
关键词： 子宫内膜癌 Survivin基因 小干扰RNA 细胞增殖 细胞凋亡 -
小干扰RNA沉默高迁移率族蛋白1对胃癌细胞生物学行为的影响
目的 靶向高迁移率族蛋白1 (high mobility group protein,HMGBl)的小干扰RNA(siRNA)转染胃癌HGC-27细胞株抑制HMGBl基因表达,探讨其对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响. 方法 将靶向HMGB1的siRNA在脂质体介导下转染胃癌HGC-27细胞,Western blot检测转染后细胞HMGB1蛋白表达变化,通过MTT实验检测转染后细胞的增殖活性,细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力. 结果 空白转染组、control-siRNA组和HMGB1干扰组HMGB1蛋白相对表达水平分别为(0.940±0.059)、(0.927±0.051)和(0.393±0.033),HMGB1干扰组蛋白表达水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).MTT和细胞划痕实验显示,与对照组相比,HMGB1干扰组细胞增殖缓慢,细胞迁移率明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 应用靶向siRNA沉默胃癌HGC-27细胞HMGB1基因表达可抑制其增殖、侵袭和迁移能力,具有抗肿瘤作用,HMGB1有望成为胃癌治疗的一个潜在靶点.
-
miR-193a-3p在食管癌细胞放射抵抗作用的初步研究
目的：探讨miR?193a?3p在食管鳞癌放射耐受性机制中的作用。方法通过6 MV X射线对4个食管癌细胞系进行照射，采用MTT法检测出相对敏感系及耐受系细胞；茎环引物实时定量PCR法检测miR?193a?3p、miR?155、miR?22?3p在2个细胞中的表达，miR?193a?3p作为表达差异较为明显的 microRNA 被挑选进行下一步研究。分别合成并转染 miR?193a?3p 的 mimic （3PM）或antagomiR （3PA）序列及小干扰RNA （si?LOXL4）以提高或抑制其在细胞中的表达水平，MTT法和流式细胞分析术检测miR?193a?3p及其下游基因LOXL4对于放射敏感性的影响。结果筛选出相对放射敏感细胞系（ KYSE510）及耐受细胞系（ KYSE410）；miR?193a?3p在两系细胞中的表达水平差异显著高于miR?155、miR?22?3p （1.00∶21.13）；KYSE510细胞中转染mimic提高其表达后，与对照组相比，其放射敏感性降低，细胞凋亡比例显著下降11.10％（P＜0.05），而 KYSE410细胞中转染 antagomiR后，其敏感性增加（ P＜0.05）。作为miR?193a?3p的下游基因，LOXL4的表达抑制也受到miR?193a?3p的调控，转染si?LOXL4降低其表达，与对照组相比放射敏感性也降低，细胞凋亡比例下降7.07％（ P＜0.05）。结论 miR?193a?3p可能通过调控基因LOXL4促进食管癌细胞放射耐受性。
关键词： miR-193a-3p 细胞系 食管癌 放射耐受 小干扰RNA -
DNA聚合酶θ表达对MCF-7乳腺癌细胞系体外增殖和早期凋亡的影响
目的 研究DNA聚合酶θ(POLQ)在MCF-7乳腺癌细胞系中的表达及其对该细胞系体外增殖和早期凋亡的影响.方法 经脂质体LipofectamineTM2000介导将POLQ-siRNA转染入MCF-7乳腺癌细胞系中,MCF-7细胞被分为POLQ-siRNA组、Control-siRNA组和空白对照组;用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(qRT-PCR)和Western blot分别从基因和蛋白水平检测POLQ表达率的变化;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化;用流式细胞术判断转染前后细胞周期和凋亡率的改变.数据采用单因素方差分析和重复测量数据的方差分析进行统计.结果 POLQ在MCF-7乳腺癌细胞系中高表达,其相对分子质量(Mr)＞250 000,同时在Mr约170 000和100 000处容易检测到明显的条带.POLQ-siRNA组细胞POLQ mRNA平均表达量是空白对照组的(0.12±0.01)倍(P=0.00),POLQ蛋白表达率为(32.0±0.7)%.POLQ-siRNA组细胞增殖能力显著低于空白对照组(P=0.00);POLQ-siRNA组细胞克隆形成率明显低于空白对照组(P=0.00).转染后48 h,POLQ-siRNA组G0/G1期细胞比例显著高于空白对照组(P=0.00),S期细胞比例显著低于空白对照组(P=0.00),细胞早期凋亡率高于空白对照组(P=0.00),阴性对照组与空白对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 POLQ在MCF-7乳腺癌细胞系中高表达,阻断该基因表达可以抑制细胞增殖,同时提高乳腺癌细胞的早期凋亡率.
-
siRNA 沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 应用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达,探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应.方法 体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列,在脂质体介导下转染MCF-7细胞,实时定量PCR检测hTERT mRNA表达水平,Western blot检测hTERT蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡状况,MTT法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验检测克隆形成率.结果 所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达,hTERT siRNA转染MCF-7细胞48 h后,siRNA1～siRNA3组hTERT mRNA表达分别为(35.3±4.2)%、(30.7±2.8)%、(31.3±3.6)%,与阴性对照组(96.4±2.8%)相比,差异有统计学意义.MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低,转染48 h后,siRNA1～siRNA4细胞抑制率分别为(57.6±3.6)%、(61.3±4.3)%、(65.6±6.3)%和(3.1±4.5)%,细胞克隆形成能力下降,凋亡率明显增加.结论 体外化学合成的hTERT siRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.
-
nm23-H1小干扰RNA增强紫杉醇脂质体对肺腺癌细胞化疗的敏感性
目的 探讨抑制nm23-H1基因的表达后,紫杉醇脂质体对人肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响.方法 以人肺腺癌A549细胞为研究对象,将其分为nm23-H1-小干扰RNA(siRNA)转染组和未转染组.采用Western blot法检测两组A549细胞中nm23-H1蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测紫杉醇脂质体对两组A549细胞的生长抑制率,以流式细胞仪检测A549细胞的凋亡和细胞周期的变化.结果 转染nm23-H1-siRNA后,A549细胞中nm23-H1蛋白的表达水平明显降低.紫杉醇脂质体作用48 h后,A549细胞的生长抑制率随药物浓度的升高而升高,且转染组细胞的抑制率更高.当紫杉醇脂质体浓度≥5 μg/ml时,转染组的抑制效率明显高于未转染组(均P＜0.05).转染nm23-H1-siRNA后,A549细胞的凋亡率[(65.62±4.36)%]较未转染组明显增加[(43.78±5.56)%,P＜0.05],S期和G2/M期细胞所占的比例则有所下降[S期:分别为(15.73±3.21)%和(25.56±4.01)%,P＜0.05;G2/M期:分别为(31.91±3.12)%和(39.41±4.21)%,P＜0.05].结论 nm23-H1基因与紫杉醇脂质体的化疗抵抗有关,抑制nm23-H1基因的表达可以增强紫杉醇脂质体的化疗敏感性.
-
Bim的异常调控在黑色素瘤细胞耐受内质网应激状态中的作用
目的 探讨Bim在黑色素瘤细胞内质网应激状态下可能存在的异常调控,及其在黑色素瘤细胞对内质网应激耐受中的作用.方法 用衣霉素诱导黑色素瘤细胞Mel-RM和MM200,产生内质网应激模型.采用流式细胞仪Annexin Ⅴ/PI双染法及Hoechst染色法检测细胞凋亡;Western blot检测caspase-3和caspase-9的活化,以及Bim、GRP78、CHOP及Foxo1等的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测Bim、CHOP及Foxo1的mRNA水平.以小干扰RNA(siRNA)特异性沉默人胚肾上皮细胞系HEK293的Bim基因,观察Bim的蛋白表达和细胞凋亡情况.结果 衣霉素作用后,黑色素瘤细胞对内质网应激诱导的凋亡表现为耐受,HEK293细胞中caspase-3和caspase-9明显活化,但在黑色素瘤细胞中却不明显.3 μmol/L衣霉素作用黑色素瘤Mel-RM和MM200细胞12、24、36 h后,Bim蛋白的水平均未上调,mRNA表达的变化倍率分别为0.37±0.05、0.13±0.02、0.02±0.01和0.41±0.06、0.16±0.04、0.21±0.03,与HEK293细胞相比,均发生下调(P＜0.01).在HEK293细胞中,特异性沉默Bim基因后,caspase-3的活化程度下降,Bim siRNA干扰组细胞凋亡率为(5.69±0.38)%,明显低于siRNA阴性对照组[(40.32±1.64)%,P<0.01]和空白对照组[(35.46±2.01)%,P＜0.01)].3 μmol/L衣霉素作用黑色素瘤细胞6、12、24、36 h后,转录因子CHOP mRNA和蛋白表达水平均发生上调,Foxo1 mRNA和蛋白表达水平均发生下调.结论 Bim的异常调控在黑色素瘤细胞对内质网应激诱导的凋亡耐受中发挥重要作用,这可能是导致黑色素瘤对治疗不敏感的重要原因之一.转录因子CHOP和Foxo1可能与Bim在内质网应激诱导的黑色素瘤细胞中的异常表达有关.
-
RNA干扰相关肿瘤治疗药物的研究进展
研发针对肿瘤细胞表面抗原的靶向药物和针对肿瘤细胞异常信号通路的抑制剂,是目前肿瘤治疗药物研发的主要目标.但由于药物研发周期长和治疗效果差等方面的原因,制约了肿瘤靶向药物的发展.RNA干扰(RNA interference,RNAi)的发现,为人们提供了相对快速且具有革命性的肿瘤药物设计途径.
-
血管内皮生长因子受体2小干扰RNA抑制内皮祖细胞血管新生
目的 探讨血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)在内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)血管新生中的作用.方法 通过VEGFR-2小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染EPCs,检测其转染效率与抑制效率,观察EPCs体外血管生成以及迁移能力,并分析其基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine threonine,Akt)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的蛋门表达.结果 VEGFR-2 siRNA能有效并特异地抑制EPCs VEGFR-2的表达;VEGFR-2 siRNA能抑制EPCs的体外血管生成与迁移能力;VEGFR-2 siRNA能抑制EPCs MMP-9的表达与活性,以及Akt与ERK的磷酸化水平.结论 VEGFR-2 siRNA可能通过下调MMP-9、Akt与ERK的表达来抑制EPCs血管新生.
关键词： 血管内皮生长因子受体2 小干扰RNA 内皮祖细胞 血管新生 -
敲低亮氨酰-tRNA合成酶抑制人胶质瘤细胞U251增殖和迁移的体外研究
目的 探究敲低亮氨酰-tRNA合成酶(LARS)表达对U251细胞增殖和迁移能力的影响.方法 采用脂质体转染LARS小干扰RNA(LARS siRNA)于U251.PCR、Western blot检测LARS表达;MTT法、平板克隆检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞周期及Transwell法检测细胞迁移能力.结果 较对照组和无义序列组,转染LARS siRNA后LARS mRNA和蛋白水平明显降低,自转染48 h后细胞增殖率明显下降(P＜0.05),且克隆形成率分别较对照组和无义序列组降低了51.69％和50.45％,G0/G1期比例分别增高了38.34％和31.93％,穿膜细胞数分别减少了81.78％和81.45％,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 敲低LARS表达可明显抑制U251生长增殖和迁移能力.LARS基因有望成为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.
关键词： 亮氨酰-tRNA合成酶 神经胶质瘤 细胞增殖 细胞迁移 小干扰RNA -
小鼠鼓室注射小干扰RNA导入内耳可行性研究
目的：探讨将小干扰RNA经鼓室注射导入小鼠内耳的可行性。方法选取三月龄健康小鼠，经鼓室注射荧光标记的小干扰RNA探针以及热休克蛋白70（HSP70）小干扰RNA，三日后经耳蜗冰冻切片及基底膜铺片，检测小干扰RNA进入内耳情况及外毛细胞中HSP70蛋白表达。结果鼓室注射荧光标记的小干扰RNA探针三日即可被成功导入耳蜗组织，鼓室注射HSP70 siRNA可抑制毛细胞内HSP70表达，与对照组相比有显著差异（p<0.01）。结论小鼠鼓室注射小干扰RNA是一种有效的将小干扰RNA导入内耳尤其是毛细胞的方法，在毛细胞损伤机制研究中有一定应用价值。
-
小干扰RNA保护大鼠视网膜神经节细胞的实验研究
目的 通过大鼠视神经夹伤模型,研究小干扰RNA(siRNA)对视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用.设计 实验研究.研究对象 SPF级SD大鼠54只.方法 54只SD大鼠随机分为A、B、C三组,每组18只.均选取右眼为实验眼,左眼为正常对照.在球后2mm处用40 g压力微型视神经夹夹持视神经60 s,做视神经夹伤模型.建立模型后当天,A、B、C三组分别给予玻璃体注射10,μg、20 μg siRNA和生理盐水.视神经夹伤后10天,每组取6只大鼠用荧光金做逆行标记,14天时取标记后的大鼠双眼眼球标本做视网膜铺片并拍摄照片,RGC计数.计算RGC存活率(右眼RGC数/左眼RGC数×100％).每组其余12只大鼠进一步用蛋白印迹法检测视网膜组织中caspase-3蛋白的表达水平.主要指标RGC存活率,caspase-3蛋白的表达水平.结果 A、B、C组RGC存活率分别为53.63％±7.35％、57.86％±6.00％、45.00％±4.37％(F=7.11,P=0.029),其中A组与C组(P=0.025),B组和C组(P=0.002)之间均有显著性差异;A组和B组之间无显著性差异(P=0.24).A、B、C三组视网膜组织中Caspase-3蛋白与内参灰度比值分别为0.20±0.02、0.19±0.02、0.24±0.03(F=9.73,P=0.02).其中A组与C组(P=0.005),B组和C组(P=0.001)之间均有显著性差异;A组和B组之间无显著性差异(P=0.418).结论 小干扰RNA能有效保护大鼠视神经夹伤模型的RGC,提高RGC的存活率.
-
siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白表达的影响
目的 利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人舌癌TcaS113细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,观察其对培养细胞和移植瘤基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)-2、-9及基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)-1、-2蛋白表达的影响.方法 以稳定转染携带VEGF-siRNA真核表达载体的Tca8113细胞(VEGF-siRNA1、VEGF-siRNA2)为实验组,以转染空载体的及未转染的Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组.将细胞分别接种于裸鼠皮下,用免疫组化法分别测定各组培养细胞和移植瘤VEGF、MMP-2、-9及TIMP-1、-2的蛋白表达.结果 各组培养细胞及移植瘤VEGF免疫组化染色:VEGF-siRNA1组、VEGF-siRNA2组与实验和空白对照组相比,平均阳性率降低,平均灰度值增高(P＜0.05);各组培养细胞均未检测出MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的阳性表达.各组移植瘤MMP-9、TIMP-1、-2可见阳性表达,但各组染色平均阳性率及平均灰度值之间的差异无统计学意义(P＞0.05),而MMP-2未见明显阳性表达.结论 以siRNA干扰沉默人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制细胞及移植瘤内YEGF蛋白表达,但是对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的表达无明显影响.
关键词： 小干扰RNA 舌癌 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂 血管内皮生长因子
