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siRNA在治疗学中的应用
小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是外源性双链RNA(double strand RNA,dsRNA)的加工产物,在细胞内能介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)效应,识别特异性mRNA,沉默同源基因表达.其特异性和高效性显示出很高的实用价值,siRNA已成为许多疾病潜在的治疗手段.对于siRNA的应用,尽管还需要在减少非特异反应,发掘高效递药载体,应对新的基因变异等方面进行深入研究,但其可望在抗病毒、神经系统疾病和肿瘤治疗等许多领域发挥治疗作用.
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RNA干扰对人肺泡上皮A549细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达抑制作用
目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)干扰对人肺泡上皮A549细胞株MIF基因表达的影响.方法将MIF siRNA用转染剂Interferin介导转染体外培养的A549细胞,通过RT-PCR方法观察不同浓度MIF siRNA转染后,对MIF mRNA表达的影响;采用细胞免疫荧光方法分析MIF蛋白表达的强弱;应用MTT方法测定MIF siRNA转染对细胞的毒性,及脂多糖(LPS)刺激对A549细胞生存率的影响.结果 (1)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,可下调细胞中MIF mRNA的表达,只有当MIF siRNA转染浓度大于50 nmol/L时,才能明显下调MIF mRNA的表达;(2)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,A549细胞MIF的荧光蛋白表达也明显降低,在此基础上再加入MIF刺激,MIF的蛋白表达又明显增加;(3)MIF siRNA转染对A549细胞几乎没有毒性,且对LPS刺激A549细胞导致细胞死亡及细胞的生存率下降有一定的保护作用.结论 MIF siRNA能在A549细胞特异沉默目的基因MIF和抑制MIF蛋白的表达,且对LPS刺激导致细胞死亡有一定的保护作用.
关键词： 巨噬细胞移动抑制因子 小干扰RNA 人肺泡上皮A549细胞 脂多糖 -
RNA干扰及在刚地弓形虫研究中的应用
刚地弓形虫病严重危害人类健康,是非常严重的公共卫生问题,弓形虫病的防治刻不容缓,寻找安全有效的防治措施是控制弓形虫病的重点和难点.RNA干扰技术可以抑制特定基因的表达,具有普遍性、高效性、特异性等优点,是研究弓形虫基因组功能、筛选新的疫苗和药物靶点的强有力的工具.本文综述了近几年来RNA干扰的研究进展及其在刚地弓形虫研究中的应用.
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C-MYC siRNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的诱导作用
本研究探讨C-MYC siRNA对急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的增殖、凋亡的影响.采取化学合成法合成针对C-MYC rnRNA的第1545-1565靶位点设计的siRNA,经转染剂(HiPerFect transfection reagent)转染入Jurkat细胞,观察细胞形态学变化;应用四唑氮化合物(MTS)法绘制细胞生长曲线;用细胞集落培养观察C-MYC siRNA对Jurkat细胞增殖的影响;应用流式细胞术和TdT酶介导的末端缺失原位标记(TUNEL)法分析细胞的凋亡.结果表明,不同浓度C-MYC siRNA作用于Jurkat细胞后,细胞的生长受到不同程度的抑制,抑制率随C-MYC siRNA浓度的增高而增高.C-MYC siRNA对集落形成也有明显的抑制作用.TUNEL法、流式细胞仪均检测出细胞凋亡,且随着作用时间的延长,其凋亡率也逐渐上升.结论:化学合成法合成的C-MYC siRNA能明显抑制Jurkat细胞的增殖与集落形成,并可诱导 Jurkat细胞发生凋亡.
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c-myc小干扰RNA诱导人髓系白血病细胞系HL-60细胞凋亡
本研究探讨c-myc小干扰RNA对白血病细胞系HL-60诱导凋亡的作用.将体外合成的siRNA转染HL-60细胞,观察形态学变化,应用MTT法绘制细胞生长曲线,用细胞集落培养观察c-myc siRNA对HL-60细胞增殖的影响;应用DNA片段化分析细胞的凋亡,RT-PCR及Western blot检测c-myc siRNA作用前后c-myc基因mRNA及蛋白表达水平的变化.结果表明:c-myc siRNA能明显抑制HL-60细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)约为150nmol/L;DNA片段化的检出证实c-myc siRNA能有效诱导HL-60细胞调亡,凋亡率与药物作用时间呈正相关.c-myc siRNA与HL-60细胞作用后c-myc基因和蛋白的表达水平与作用时间呈负相关.结论:c-myc siRNA能有效抑制HL-60细胞增殖,降低c-myc基因和蛋白的表达,诱导其凋亡.
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TLR4介导氧化型低密度脂蛋白致动脉粥样硬化作用的研究
目的 探讨氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,OX-LDL)的致动脉粥样硬化作用与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)表达的相关性.方法 构建针对TLR4的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)表达载体,转染人单核细胞株U937,于转染前后用不同浓度的ox-LDL刺激,用流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测TLR4蛋白和mRNA表达变化,同时用ELISA测定NF-κB活性改变以及细胞上清液中动脉粥样硬化相关细胞因子MCP-1和IL-8的浓度变化.结果 ox-LDL刺激可导致单核细胞TLR4表达上调,同时NF-κB p65活性增强,MCP-1和IL-8在细胞上清液中的浓度显著高于对照组(P＜0.05),并且呈剂量依赖性;利用siRNA表达载体使TLR4表达抑制后,相同剂量的ox-LDL刺激,NF-κB p65相对活性以及MCP-1和IL-8的分泌显著低于TLR4未抑制组(P＜0.05).结论 ox-LDL的致动脉粥样硬化作用至少部分是由TLR4介导的;调节TLR4的表达,可以减弱ox-LDL刺激引起的包括NF-kB活化以及MCP-1和IL-8分泌等致动脉粥样硬化效应.
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Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证
目的 构建小干扰唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,Siglec-1)的慢病毒载体,并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体.方法 利用软件设计3条Siglec-1 siRNA片段,并克隆到慢病毒pGCSIL-GFP质粒载体,再与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,培养48 h后,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液.逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞(BMM),流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体.结果 成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体,并经测序验证序列正确.包装的慢病毒滴度介于1×108 ～ 1×109 TU/ml之间,适合体外转导及体内试验.体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达.结论 成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体,为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础.
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小干扰RNA对人乳头状瘤病毒6bE7基因表达的沉默作用
目的 研究靶向人乳头状瘤病毒HPV-6b型E7基因的二聚体小干扰RNA(siRNA-HPV-6bE7)对靶基因表达的沉默作用.方法 建立并筛选稳定表达HPV-6bE7基因的B16和293T转染细胞株,用脂质体转染法将体外合成的siRNA-HPV-6bE7转染上述细胞株,采用实时荧光定量PCR分析靶基因HPV-6bE7的mRNA表达情况.结果 用不同浓度的siRNA-HPV-6bE7转染细胞48 h,50nmol/L浓度对B16细胞中靶基因表达的抑制作用强(抑制率87.05%),1 nmol/L抑制作用较低(9.14%);而在293T细胞,10 nmol/L的siRNA对靶基因表达的抑制效应大(78.87%),1 nmol/L仍有一定抑制作用(46.92%).50 nmol/L siRNA-HPV-6bE7转染B16细胞后,靶基因的mRNA表达在24 h内开始受抑制(32.47%),48 h作用强(74.72%),96 h作用很低(8.91%);25 nmol/L和10 nmol/L的siRNA转染293T细胞后,均在24 h内起效(26.66%、20.31%),抑制作用至少能维持72 h(65.93%、35.23%).结论 siRNA-HPV-6bE7对B16和293T细胞外源性靶基因表达均有较强的特异性沉默作用,在不同细胞株达到大抑制效应的siRNA浓度不同,但时效曲线的变化趋势基本一致,siRNA均在24 h内起效,48～72 h达到高峰,抑制作用至少能维持72 h.本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据.
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小干扰RNA在心肌细胞中对柯萨奇病毒B3复制的抑制作用研究
目的 通过在原代心肌细胞培养上研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的基因干扰对病毒增殖的抑制和细胞内免疫清除作用,评价siRNA在治疗病毒性感染中的可能性.方法 体外制备BALB/c乳鼠心肌细胞,利用脂质体和电穿孔转染方法转染siRNA后感染病毒,流式细胞术、中性红染色和病毒致细胞病变作用(CPE)保护实验评价转染效率和细胞生长状态,空斑形成减少实验、RT-PCR等方法检测抑制病毒程度.结果 通过在HeLa细胞上的筛选,针对病毒不同区域的siRNA呈现出不同的抗病毒作用,靶序列位于2B区的siRNA-3753能显著抑制柯萨奇病毒B3(CVB3)感染.在原代培养的心肌细胞中,转染siRNA-3753后同样显示出很好的抗病毒效果,心肌的搏动、心肌细胞的生长状况保持着较好的状态.而病毒对照和非特异性siRNA-non感染24 h后,细胞停止搏动,逐步变圆,皱缩死亡.测定培养上清和细胞内的病毒滴度,电转siRNA-3753对病毒抑制率可以达到98.1%,脂质体转染siRNA-3753对病毒抑制率为78.2%.电穿孔转染效率可以达到56.03%,脂质体为9.0%.结论 针对CVB3基因组2B区的siRNA在保护心肌细胞抵抗CVB3病毒感染实验中具有抑制病毒复制作用.
关键词： 小干扰RNA 柯萨奇B组病毒(CVB) 病毒性心肌炎 心肌细胞 -
特异性的VP1-siRNA对CVB3复制抑制作用的研究
目的研究特异性的CVB3-VP1 siRNA对CVB3体外复制的抑制作用的量效关系与时效关系.方法CVB3感染HeLa细胞,利用脂质体介导将CVB3-VP1 siRNA转染HeLa细胞,用RT-PCR法检测CVB3-VP1 RNA水平,免疫荧光检测CVB3-VP1蛋白的表达水平.结果60pmol/L CVB3-VP1 siRNA是抑制CVB3 RNA及VP1表达的佳剂量;在转染后的48 h,siRNA对CVB3-VP1的抑制作用达到佳状态.结论特异性的CVB3-VP1 siRNA对CVB3-VP1蛋白表达水平及CVB3-RNA复制水平呈明显的剂量依赖关系和时效关系,转染后48 h呈现出完全抑制作用.
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以腺相关病毒为载体的小干扰RNA对肝星状细胞中金属蛋白酶组织抑制因子的抑制作用
目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1的表达抑制作用.方法 针对大鼠TIMP-1 mRNA基因序列挑选一段22bp片段,在体外构建为短发夹siRNA(short hairpin siRNA,shRNA)表达载体后,将其包装为重组AAV并感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后,于感染后30 d及90d应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1 mRNA及蛋白质表达情况,同时通过PCR技术以感染后细胞的基因组DNA为模板扩增外源基因验证其长效表达.结果 经PCR、酶切及序列测定证实含有siRNA-TIMP-1基因的重组AAV载体质粒已成功克隆.将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,感染后30d及90d细胞TIMP-1 mRNA水平明显降低(P＜0.01),感染后30d TIMP-1蛋白表达水平较对照组细胞相比下降约60%,而感染后90d,TIMP-1蛋白表达几乎下降90%.PCR结果显示在重组病毒感染后90d细胞基因组DNA中仍可扩增出外源基因,证实外源基因可长期表达.结论 重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因的表达.
关键词： 金属蛋白酶组织抑制因子 小干扰RNA 腺相关病毒 肝星状细胞 -
TLR4基因小干扰RNA对缺氧复氧诱导BV-2细胞炎症因子分泌的影响
目的 研究Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)对体外缺氧复氧条件下诱导BV-2细胞分泌TNF-α的抑制作用.方法 小鼠小胶质细胞株BV-2置于六扎培养板培养,随机分为N组(正常培养组)、H组(缺氧复氧组)、T组(缺氧复氧+TLR4-siRNA转染组,转染质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA)、C组(缺氧复氧+对照siRNA转染组,转染含对照序列的质粒pEGFP-H1/对照-siR-NA)和B组(缺氧复氧+空白质粒转染组,转染pEGFP-H1空质粒)共5组.其中H组、T组、C组和B组细胞缺氧培养3 h后复氧培养24 h,运用脂质体转染技术介导质粒转染,流式细胞术检测转染后BV-2细胞EGFP的表达率,RT-PCR方法检测各组BV-2细胞TLR4 mRNA和NF-кB p65 mRNA的表达水平,Western blot方法检测各组BV-2细胞TLR4蛋白表达变化,ELISA方法检测各组上清液中TNF-α含量.采用方差分析进行统计分析.结果 转染后BV-2细胞EGFP的表达率为(67.58±7.16)%;经缺氧复氧处理后,H组、T组、C组和B绀的TLR4 mRNA、NF-кB p65 mRNA、TLR4蛋白水平较N组均明显上调(P＜0.01),各组卜清液TNF-α含量较N组也明显升高(P＜0.01);而T组TLP4 mRNA、NF-кBp65 mRNA、TLR4蛋白表达量和上清液TNF-α含量较H组、C组和B组均明显下凋(P＜0.01);C组和B组分别与H组相比,各项检测指标表达均无明显变化(P＞0.05).结论 针对TLR4 mRNA的小干扰RNA可以有效的抑制缺氧复氧诱导的BV-2细胞的炎症反应.
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小干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2Survivin基因表达的影响
目的 构建Survivin 基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究 survivin和 survivin siRNA 对细胞凋亡的影响.方法 设计survivin siRNA序列,构建靶向 Survivin siRNA 真核载体.利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡.结果 成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡.转染Survivin-siRNA 细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带.RT-PCR 结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h 后HepG2 Survivin mRNA 分别减少了56%、78%和50%,而siRNA 阴性对照与未转染细胞相比差异不显著.结论 转染的Survivin-siRNA 可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础.
关键词： Survivin基因 HepG2细胞 小干扰RNA 基因表达 检测 -
靶向性血小板衍生生长因子siRNA对肝星状细胞增殖的影响
目的 探讨小干扰RNA(siRNA)降低血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)基因对肝星状细胞(HSCs)增殖与细胞外基质表达的影响.方法 构建PDGF-B 靶向siRNA重组表达质粒pSilencer3.l-Hlhygro-PDGF-B siRNA,将重组质粒转染HSCs细胞,噻唑蓝(MTT)法测定转染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的增殖抑制率;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹检测转染后36 h HSCs细胞PDGF-B表达.放免法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达.结果 经酶切鉴定和测序结果证实PDGF-B靶向siRNA重组表达载体构建成功,转染重组质粒36 h后,PDGF-B siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干预组的HSCs增殖抑制率明显高于对照质粒转染组(34.04%、14.89%、25.53% VS 3.19%;均 P<0.01～0.05);RT-PCR和免疫印迹显示:各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF-B mRNA和蛋白表达明显降低,与空脂质体组及对照质粒组比较,差异具有统计学意义(均P<0.05),放免法显示:siRNAs干预组HSCs细胞透明质酸和Ⅲ型前胶原表达明显降低,与空脂质体组及对照质粒组比较,差异具有统计学意义(均P<0.05).结论 靶向PDGF-B链的siRNA可降低HSCs的PDGF-B基因表达,具有抑制HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力.
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靶向MMP小干扰RNA对视网膜母细胞瘤增殖和凋亡的影响
目的 研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因沉默对人视网膜母细胞瘤(RB)增殖和凋亡的影响.方法 设计并合成针对MMP-2和MMP-9的特异性小干扰RNA(siRNA)序列,按照实验要求进行分组:空白对照组(未转染的细胞);阴性对照组(转染空载体+阴性siRNA);干扰组(转染空载体+特异siR-NA).利用转染试剂转入体外培养人RB细胞,48 h后收集细胞,RT-PCR和Western blot验证siRNA的干扰效应,MTT法检测细胞增殖活性、AnnexinV/PI检测细胞凋亡.结果 RT-PCR及Western检测结果显示,MMP-2 siRNA和MMP-9 siRNA转染后,与空白组、阴性对照组相比,干扰组MMP-2及MMP-9mRNA水平明显下降,其蛋白表达也明显下调(P<0.05).MTT结果显示,干扰组细胞OD值及增殖抑制率明显低于空白组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05).细胞凋亡实验同样证实干扰组的细胞凋亡率明显高于空白组及阴性对照组(P<0.05).结论 siRNA沉默MMP-2和MMP-9的表达可诱导RB细胞凋亡,抑制细胞的增殖,为RB的临床治疗提出新的思路,可以作为RB治疗的一个新靶点.
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羟基磷灰石纳米颗粒/NR2B-siRNA复合物减轻小鼠福尔马林炎性痛
目的:观察羟基磷灰石纳米颗粒(hydroxyapatite nanoparticles,HA)/N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基(N-Methyl-D-aspartic Acid receptor 2B,NR2B)siRNA复合物(HA/NR2B-siRNA)鞘内转染对小鼠福尔马林炎性痛的影响及脊髓背角NR2B表达的变化,初步探讨HA作为NR2B-siRNA体内转染载体的可行性.方法:制备HA/NR2B-siRNA,检测HA对NR2B-siRNA的结合能力和稳定性.选18～20 g昆明小鼠48只,随机分六组(n=8):HANR组,PEINR组,HAGFP组,HA组,NS组,SO组.术后第7天,各组行福尔马林检测后,取腰段脊髓行NR2B免疫组化检测.结果:HA/NR2B-siRNA的佳质量比为35:1,在生理盐水重悬液中不解离.HN组和PN组的Ⅱ相痛行为显著减少(P＜0.05).HN组和PN组脊髓背角NR2B阳性细胞数明显减少(P＜0.05).结论:①HA能与NR2B-siRNA形成稳定的转染复合物;②鞘内注射HA/NR2B-siRNA能减少福尔马林致痛小鼠Ⅱ相痛行为并有效抑制脊髓背角NR2B的表达.
关键词： 炎性痛 NMDA受体2B亚基 小干扰RNA 小鼠 羟基磷灰石纳米颗粒 -
超声辐照微泡介导脂质体小干扰RNA转染视网膜色素上皮细胞
目的 探讨超声靶向破坏超声微泡介导脂质体小干扰RNA(siRNA)转染视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值. 方法将人及大鼠RPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×10~5/孔、1×10~5/孔),分5组处理:siRNA+超声(US)、siRNA+微泡(MBs)+US、siRNA+脂质体(L)、siRNA+L+US、siRNA+L+MBs+US.12小时后,荧光显微镜观察并应用流式细胞仪测定阳性细胞比例. 结果在无脂质体的条件下,超声或超声联合微泡不能促进siRNA转染人及大鼠RPE细胞.siRNA+L+US组siRNA转染人RPE细胞效率高.siRNA+L+US+MB组siRNA转染人及大鼠RPE细胞的效率显著低于siRNA+L+US组. 结论超声辐照可促进脂质体介导的siRNA转染人RPE细胞.
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干扰素诱导蛋白16对血管内皮细胞增殖的影响
目的 观察干扰素诱导蛋白16(IFI16)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管内皮细胞(VEC)增殖的影响及可能机制.方法 培养人脐静脉内皮细胞,分为阴性对照组(对照组)、α干扰素(IFN-α)诱导组(IFN组)和IFI16小干扰RNA(siRNA)干扰组(siRNA组),各组均用bFGF(终浓度为100 μg/L)刺激24 h后IFN组加IFN-α、siRNA组转染IFI16基因的siRNA,分别干预6h,干预后24、48和72 h,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,用半定量RT-PCR法和Western blot分别检测IFI16和p21 mRNA和蛋白表达,同时观察Ras蛋白的表达.结果 IFN-α可诱导VEC IFI16 mRNA和蛋白表达上调,降低VEC细胞活力和细胞周期G1/S转换[S期细胞(8.16±1.10)％比(13.84±0.92)％],伴p21 mRNA和蛋白表达上调及Ras蛋白表达下调.转染IFI16 siRNA可抑制IFI16和p21表达,促进Ras蛋白表达,提高VEC细胞活力和促进细胞周期G1/S转换[S期细胞(17.03±0.52)％比(13.84±0.92)％].结论 IFI16表达可抑制bFGF诱导的VEC的增殖,该效应可能与激活p21及抑制Ras的表达有关.
关键词： 干扰素诱导蛋白16 碱性成纤维细胞生长因子 血管内皮细胞 小干扰RNA 增殖 -
靶向Plk1的siRNA对肝癌细胞凋亡的影响
目的:观察靶向作用于Plk1的siRNA对肝癌细胞系BCL-7402细胞中Plk1基因和p53基因表达及细胞凋亡的影响,探求靶向该基因的治疗在肝癌基因治疗中的可行性及效应.方法:设计合成两对靶向作用于Plk1基因的双链siRNA序列,分别命名为siRNA1和siRNA2,应用脂质体法将其转入BCL-7402细胞中.实验分为siRNA1、siRNA2、无关对照及空白对照4组.通过RT-PCR检测各组细胞中Plk1mRNA表达的变化；Western blot检测各组细胞中Plk1和P53蛋白表达的变化；流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的改变；透射电镜观察细胞超微结构的变化.结果:转染后24 h和48 h,Plk1 mRNA相对水平siRNA1组分别较无关对照组和空白对照组下降了50％、51％和60％、62％,siRNA2组分别较无关对照组和空白对照组下降了42％、42％和54％、56％,siRNA1组、siRNA2组的Plk1 mRNA相对水平与无关对照组和空白对照组相比有统计学差异(P＜0.01).Plk1蛋白表达的变化趋势与Plk1 mRNA的变化趋势相似,P53蛋白的表达随着Plk1表达的抑制而明显增加(P＜0.01).转染后24 h,转染组中G2/M期的细胞数量明显增加(P＜0.01).转染后48 h,转染组中出现大量的凋亡细胞,透射电镜下可见凋亡早期及晚期形态学改变.结论:靶向作用于Plk1的siRNA能够抑制肝癌细胞系BCL-7402细胞中Plk1基因的表达,同时增加53基因的表达,促进转染细胞的凋亡,提示Plk1基因在对肝癌细胞的细胞周期及凋亡的调控中起重要作用.
关键词： 小干扰RNA 保罗样激酶1 肝脏肿瘤 BCL-7402细胞 细胞凋亡 -
肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞生物学行为的影响
目的:构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)的小干扰RNA(siRNA)的重组质粒,研究NOV对大鼠肝星状细胞(HSC)活化、增殖、凋亡、分泌细胞外基质(ECM)的影响.方法:以NOV为目的基因,以质粒psiRNA-hH1neo为载体,构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA(psiRNA1,2,3)和阴性对照重组质粒pconsiRNA.限制性酶切和测序鉴定构建成功后,脂质体介导重组质粒转染HSC,依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组,并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组.半定量RT-PCR检测HSC的NOV、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达情况,Western blot检测α-SMA蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果:限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOVsiRNA表达质粒;与阴性对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV、α-SMA的mRNA表达水平下降(73.0%vs 23.2%,51.4% vs 15.1%,均P＜0.05),Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显下降(59.8% vs 17.0%,37.1% vs 6.6%,P＜0.05),α-SMA蛋白表达水平下降.与空白对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内HSC增殖活性显著降低(24 h:0.172±0.005 vs0.318±0.018,P＜0.05;48 h:0.296±0.004 vs0.472±0.029,P＜0.05;72 h:0.432±0.024 vs0.672±0.050,P＜0.05).psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV mRNA、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达及HSC增殖活性均无明显下降(均P＞0.05).结论:NOV可促进HSC增殖、活化及分泌细胞外基质,提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点.
关键词： 肾母细胞瘤过度表达基因 小干扰RNA 肝星状细胞 半定量RT-PCR
