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SiRNA沉默β-catenin对人牙周膜干细胞增殖能力的影响
目的:研究小干扰RNA(siRNA)干扰β-catenin基因表达对人牙周膜干细胞增殖能力的影响.方法:分离培养人牙周膜干细胞(periodontal ligament tissue-derived mesenchymal stem cells,PDLSCs).应用β-catenin基因的siRNA转染PDLSCs,荧光显微镜下观察转染后细胞形态,流式细胞仪检测转染后GFP细胞表达率.流式细胞仪分析转染后细胞周期,用实时定量PCR技术检测转染后β-catenin、LEF-1、Cyclin D1 mRNA表达.结果:RNA干扰β-catenin处理PDLSCs 24小时后可特异并有效地抑制β-catenin基因的表达.siRNA抑制β-catenin使PDLSCs“S”期细胞减少,“G0,G1”期细胞增多;LEF-1及Cyclin D1 mRNA表达水平显著降低.结论:β-catenin siRNA可特异性抑制PDLSCs细胞中β-catenin基因表达,并明显抑制细胞增殖.
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血管内皮生长因子小干扰RNA抑制人舌鳞状细胞癌细胞移植瘤生长及血管生成的实验
目的 观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对人舌癌Tca8113细胞移植瘤的治疗作用.方法 构建Tea8113细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,A组、B组为实验组,C组:以空载体注射为治疗对照组,D组:未治疗为空白对照组,每组5只.脂质体法将两对VEGF siRNA真核表达载体(PU-VEGF-siRNAl、PU-VEGF-siRNA2)作瘤体内及瘤周注射,1次/3 d,共10次后处死裸鼠;测量瘤体积及瘤重;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫组化法分别检测瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达,并检测瘤内微血管密度;流式细胞仪检测肿瘤细胞悬液的细胞周期比例,Tunel法检测组织细胞凋亡.结果 B组瘤体积(0.402±0.158)cm3、瘤重量(2.12±0.58)g,均低于C、D组,细胞G1期比例为(40.26±1.42)%,较C、D组增加,B组瘤组织VEGF mRNA(0.752±0.048)和蛋白表达(1.12±0.15),组织切片VEGF阳性细胞表达率(12.56±1.30)%、平均灰度值(164.2±15.42)及微血管密度(3.50±1.58)个,均低于C、D组(P<0.05),凋亡细胞增加(P<0.01).结论 siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,减少肿瘤血管生成,延缓肿瘤生长.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.
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负向调控基质金属蛋白酶-2的表达抑制成釉细胞瘤的侵袭性
目的 探讨基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)靶向小干扰RNA(siRNA)对成釉细胞瘤(AM)细胞MMP-2基因的负向调控作用及对AM侵袭性的抑制作用.方法 培养成釉细胞瘤细胞,应用免疫荧光法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达;体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体,并转染成釉细胞瘤细胞,激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效果,流式细胞仪检测转染效率,逆转录聚合酶链反应检测MMP-2 mRNA的改变,免疫印迹法检测细胞MMP-2蛋白表达,侵袭小室微侵袭分析检测细胞的侵袭性,对统计结果进行方差分析.结果 成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达,siRNA质粒表达载体对成釉细胞瘤细胞的转染率为63.6%;转染后,成釉细胞瘤细胞的MMP-2 mRNA表达减少69.3%,MMP-2蛋白表达减少64.2%,P ＜ 0.05,细胞的侵袭抑制率为61.2%.结论 MMP-2靶向siRNA表达质粒成功转染成釉细胞瘤细胞并沉默MMP-2基因,MMP-2与细胞的侵袭性密切相关.
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MACC1基因影响宣威肺腺癌细胞XWLC-05促血管生成的机制研究
目的：探讨结肠癌转移相关基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）影响宣威肺腺癌细胞XWLC-05促进血管生成的可能分子机制。方法将MACC1小干扰RNA（ siRNA）-3转染XWLC-05宣威肺腺癌细胞株，采用Western印迹法检测细胞中MET、MEK/p-MEK、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT蛋白的表达；ELISA法检测细胞中血管内皮细胞生长因子（ VEGF）、IL-8和碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）的表达。结果 Western印迹结果显示，MACC1 siRNA-3转染细胞中的MET、p-MEK和p-ERK表达水平显著降低，但总MEK和ERK蛋白表达无明显差异。同时，AKT及其磷酸化蛋白水平均未受影响。 ELISA结果显示，MACC1 siRNA-3转染细胞48和72 h后的VEGF、bFGF和IL-8细胞因子的表达水平明显受到抑制。结论推测MACC1基因通过抑制XWLC-05宣威肺腺癌细胞中的HGF/c-MET和MEK/ERK信号通路，减少细胞中VEGF、bFGF和IL-8细胞因子的分泌，终导致肺癌血管生成。
关键词： 结肠癌转移相关基因1 小干扰RNA MEK/ERK AKT 细胞因子 -
利用Mps1特异性siRNA抑制人宫颈癌HeLaS3细胞增殖的研究
目的 验证所设计的Mps1小干扰RNA(siRNA)的特异性,为其应用于肿瘤治疗提供研究基础.方法 针对Mps1基因的5’端设计合成一个siRNA(简称为siMps1),利用Western印迹检测siMps1的干扰效果,以及干扰后对肿瘤细胞的增殖和有丝分裂的影响.进一步构建稳定表达siMps1的细胞系SW480-YFPMps1 siR/shRNA,检测过表达外源Mps1能否恢复其内源基因缺失的表型.结果 转染siMps1能够降低细胞中的Mps1蛋白水平,导致有丝分裂指数降低,染色体中期排列异常；进而通过克隆形成实验发现,HeLaS3细胞转染siMps1后大量死亡,出现多核细胞；构建的稳定细胞系SW480-YFPMps1 siR/shRNA能够恢复Mps1缺失后的表型.结论 该设计得到的siMps1具有很高特异性,有望应用于肿瘤的治疗中.
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Sp1介导雌激素上调LRP16基因表达的研究
目的:研究Sp1在雌激素上调LRP16基因表达中的作用.方法:采用ERα,Sp1特异性单抗对雌激素作用不同时间点的MCF-7细胞进行染色质免疫共沉淀,snPCR扩增沉淀DNA上LRP16基因启动子区;化学合成Sp1小干扰RNA,与pS10荧光素酶报告重组子共转染MCF-7细胞,双荧光素酶测定法检测Sp1-SiRNA对LRP16基因表达的抑制作用.结果与结论:染色质免疫共沉淀结果提示Sp1蛋白直接结合于LRp基因-213 bp至-24 bp区域,雌激素激活的ERα增强其与DNA的结合力上调LRP16基因表达;应用Sp1小干扰RNA有效抑制了LRP16基因的雌激素反应性,明确了Sp1所结合的DNA顺式元件,从反面证实了Sp1蛋白对LRP16基因启动子区域递呈E2转激活活性的增强效应.
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STAT3 siRNA引起U251细胞凋亡的研究
目的:观察利用siRNA技术下调人脑胶质母细胞瘤细胞(U251)STAT3表达后对细胞凋亡的影响. 方法:分离培养并间接免疫荧光鉴定大鼠原代星形胶质细胞(NA),用STAT3干涉质粒载体(pSilence2.1-STAT3)及对照载体(pSilence2.1-GFP)转染U251细胞及NA细胞,用Hoechst 33258染色观察凋亡的形态学改变,用Annexin-V试剂盒定量检测凋亡.结果:分离培养了符合实验要求的NA细胞,转染pSilence2.1-STAT3后,U251细胞出现了明显的时间依赖性细胞凋亡,而NA细胞无显著凋亡发生.结论:pSilence2.1-STAT3能诱导U251细胞凋亡,而对正常细胞无显著影响.
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STAT3 RNAi联合γ射线照射对U251细胞增殖的影响
目的 构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)的小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测联合60Co γ射线照射对U251细胞STAT3表达及细胞增殖的抑制作用.方法 设计、合成STAT3特异性的19 bp短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到pSilence2.1-U6-H1载体中,构建STAT3特异siRNA的表达载体,Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定重组体,并转染U251细胞,免疫印迹法(Western blot)检测STAT3 mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性,克隆形成率及MTT实验确定放疗剂量.结果 经双酶切与测序鉴定成功构建pSilence2.1-STAT3表达载体,转染星形胶质瘤细胞株U251细胞可显著抑制细胞中STAT3蛋白的表达水平;确定2 Gy为放疗剂量.转染pSilence2.1-STAT3,细胞增殖活性较未转染U251细胞显著降低(P＜0.05),联合60Co γ射线照射U251细胞增殖活性单独转染进一步显著降低(P＜0.05).结论 运用pSilence2.1-U6-H1载体构建的pSilence2.1-STAT3表达载体可有效抑制STAT3的表达及星形胶质瘤细胞的增殖;联合2 Gy 60Co γ射线照射可增加抑制效果.
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小干扰RNA的靶向运送体系
靶向运送是小干扰RNA(siRNA)药物进入临床应用关键的环节.研究人员利用配体、抗体和适配子构建了非常有效的靶向特异性细胞组织的siRNA运送体系.制备运送体系分3步:先使脂质体或多聚物与siRNA自发结合形成微粒,利用聚乙二醇等作为桥接分子包被在微粒外层,后将配体、抗体或适配子等靶向性分子与桥接分子连接.
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可递送siRNA的非病毒纳米载体的设计
RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术可让不同水平的基因沉默，主要是通过双链RNA（dsRNA）在体内诱导靶基因mRNA产生特异性降解而实现的。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是RNAi的效应分子，需要借助递送载体进入细胞内发挥治疗作用。纳米载体具有很多优势：增加生物膜通透性、控制药物释放速度、改变体内分布、提高生物利用度等。本文综述了siRNA非病毒递送载体的相关研究，重点阐述了其结构和生物学特征。
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RNA干扰与药物的研究进展
RNA干扰是由双链RNA诱导的序列特异性的基因沉默,目前被广泛用于药物研究,特别是针对肿瘤、病毒感染性疾病、血液病及神经退行性疾病等的治疗药物.随着核酸药物在体内靶向转运技术的不断发展,RNA干扰有可能成为一种新型的治疗途径.
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基因沉默的维持——长效RNA干扰
自揭示了哺乳动物细胞中的RNA干扰(RNAi)现象以来,对其进行了大量的研究与资金投入,期望将其发展成一种切实可行的治疗手段.毫无疑问,RNAi是具发展潜力的基因治疗策略.由于许多采用RNAi治疗的疾病需要长期用药,因此,有关RNAi类药物长期应用的安全性问题成为关注重点.
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小干扰RNA的设计
小干扰RNA(siRNA)是产生RNA干扰的功能分子,在作为基因研究工具和治疗药物方面具有广泛的前景.为了有效地沉默靶基因并减少脱靶效应,需对siRNA进行精确设计.本文从提高siRNA的沉默效率、降低siRNA的序列特异性和非序列特异性脱靶效应、siRNA进入RNA诱导沉默复合物时的序列选择倾向性、化学修饰的种类和位点选择策略、靶序列的位置和结构选择等几个方面提出并分析了设计siRNA时需要遵循的原则.
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RNA干扰对宫颈癌Hela细胞中mTOR 4EBP1表达及细胞侵袭力的影响
目的 探讨mTOR蛋白与宫颈癌发生、发展过程的相关性和mTOR siRNA对宫颈癌细胞Hela中mTOR、4EBP1表达及细胞侵袭力的影响.方法 应用免疫组织化学方法检测宫颈鳞癌组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和正常宫颈鳞状上皮组织中mTOR蛋白的表达情况;应用RNAi技术处理宫颈癌Hela细胞,运用免疫细胞化学、原位杂交等技术检测处理前后Hela细胞中mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达情况;通过Boyden chamber体外侵袭实验,了解mTORsiRNA对Hela细胞侵袭力的影响.结果 mTOR蛋白在30例正常宫颈上皮组织、20例CIN组织和45例宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为36.7％ (11/30)、55.0％ (11/20)和71.1％ (32/45),正常宫颈组和CIN组与宫颈鳞癌组比较差异有统计学意义(P＜0.05);三种不同浓度的mTOR siRNA分别转染宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h,各组与各对照组相比,mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达差异均有统计学意义(P均＜0.05);转染mTOR siRNA的Hale细胞,穿越Matrigel的细胞数比各对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 mTOR蛋白的过表达可能与宫颈鳞癌的发生、发展有关;mTOR siRNA可下调宫颈癌Hela细胞中mTOR蛋白及mRNA的表达及抑制宫颈癌细胞的侵袭能力.
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hTERT siRNA对HepG2细胞hTERT表达及端粒酶活性的影响
目的 研究siRNA技术对肝癌HepG2细胞系hTERT mRNA表达及端粒酶的抑制作用,探讨siRNA抑制肿瘤细胞的作用及机理.方法 体外转录合成hTERT siRNA并转染入HepG2细胞株中,应用RT-PCR观察HepG2细胞中hTERT mRNA表达改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,应用末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定转染24h、48h后细胞端粒酶活性.结果 hTERT siRNA转染后,对HepG2细胞hTERT mRNA和蛋白表达明显抑制.转染后24h端粒酶活性转染组均数为(0.167±0.019),与未转染组均数(0.823±0.027)、空质粒阴性对照组均数(0.826±0.031)比较,差异有统计学意义(P<0.05);48h端粒酶活性转染组均数为(0.153±0.017),与未转染组均数(0.816±0.022)、空质粒阴性对照组均数(0.809±0.028)比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 靶向hTERT的siRNA,能有效抑制肝癌细胞系HepG2 hTERT-mR-NA和蛋白表达及端粒酶活性.
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RNA干扰技术的研究进展
1998年,Fire和Mello首次提出RNAi的概念.在生物细胞内,一类小的干扰RNA分子(siRNA)可以高效、特异地阻断体内同源基因表达,促使同源mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,即发生转录后基因沉默(postranscriptionalgene silencing,PTGS),被称为RNA干扰现象[1～3].
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多功能信封型纳米系统的研究进展
基因治疗的关键是将目的基因递送至靶标,因此安全高效的基因载体尤为重要.多功能信封型纳米系统是一种新型基因载体系统,具有包封率高、稳定性好、转染率高和易制备等优点,能够控制核酸物质(小干扰RNA、DNA)在细胞内的输送与分布,使目的基因在特定地点发挥疗效,在基因递送方面具有显著优势.此外,该纳米递送系统在蛋白/多肽类成分的运载方面也显示出巨大的潜力.本文对近年来多功能信封型纳米系统的研究进展进行概述.
关键词： 多功能信封型纳米系统 基因载体 小干扰RNA DNA 多肽 -
小干扰RNA介导的多靶点肿瘤治疗
在各种不同的肿瘤中估计有多达数百个基因失调,但大多数肿瘤治疗是针对单癌基因.近来,肿瘤治疗模式发生了变化,已开始思考从单靶点治疗向多靶点治疗转变.有相当多的证据表明,多靶点治疗比单靶点治疗有较高的成功可能性,多靶点治疗将是今后有吸引力的肿瘤治疗策略.本文综述了小干扰RNA在多靶点肿瘤治疗中的作用.
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基于RNA干扰技术的外排转运体体外模型及评价
为建立多药耐药相关蛋白2 (MRP2)和P-糖蛋白(P-gp)的体外RNA干扰模型,应用化学合成的siRNA转染HepG2细胞,并用实时PCR和Western blot检测mRNA和蛋白的表达变化,应用MRP2和P-gp底物罗丹明和甲氨蝶呤进行功能评价确定模型是否成功.siRNA筛选结果显示,MRP2 siRNA-3或P-gp siRNA-2能够显著地抑制MRP2或P-gp的mRNA表达,抑制率分别为68％和84％;MRP2 siRNA-3或P-gp siRNA-2 (80 nmol·L-1)作用48 h能够明显地抑制MRP2或P-gp的蛋白表达,抑制率分别为62％和70％,同时不影响其他转运蛋白的表达;给予MRP2或P-gp底物甲氨蝶呤或罗丹明孵育,发现MRP2 siRNA-3或P-gp siRNA-2 (80 nmol·L-1)作用48 h能够显著增加甲氨蝶呤或罗丹明的细胞内浓度,表明其外排受到抑制.以上结果表明利用化学合成的siRNA能够显著地抑制细胞MRP2和P-gp的表达和功能,提示细胞干扰模型建立成功.
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新型siRNA阳离子脂质体抑制乙肝病毒HBx基因表达
为解决siRNA药物应用过程中存在的siRNA筛选和体内转运的问题,以乙肝病毒基因HBx为研究对象,通过构建表达目的基因和荧光素酶融合蛋白的双荧光素酶质粒,体外筛选得到有效抑制HBx基因的表达siRNA序列的质粒,并将该siRNA表达质粒装载于PEG化修饰的新型阳离子脂质体中,在细胞和动物水平开展该阳离子脂质体的作用效果研究.结果表明,上述装载siRNA质粒的阳离子脂质体能够在细胞和动物水平有效地抑制乙肝病毒HBx基因的表达,解决了siRNA应用中序列筛选和体内转运的问题.
