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mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1与结直肠腺癌关系的研究
磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路正逐渐成为科研工作者关注的焦点,它调控肿瘤细胞生长增殖、分化代谢、自吞噬等过程,促进肿瘤的形成.国内外的许多研究中已经证实mTOR与胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌等消化系统恶性肿瘤的相关性.4EBP1(eukaryotic translation initi-ation factor 4E binding protein 1真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)和S6蛋白激酶1(protein S6 kinase 1,S6K1)是mTOR重要的下游分子,他们调节蛋白质的翻译,在结直肠腺癌的形成过程中起到重要作用,并与预后相关,可作为较为理想的分子靶点和预后指标.
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mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1与乳腺癌关系的研究
mTOR信号通路已被确定为几种癌症的致癌因素.癌症生物学的一个主要领域是基因组生物标记的发展它可以测量pi3k-akt-mtor途径的活动水平.PI3K-Akt-mTOR信号通路包含许多信号蛋白,包括Ras,PTEN,PIP,PI3K,AKTand mTOR.作为部分信号通路功能的串联功能是是由生长因子结合在细胞膜上的受体酪氨酸激酶引起的.重要的是PI3K-Akt-mTOR信号通路在癌症细胞的生长,增殖,以及生存有重要的作用,在众多癌症中被过度表达包括乳腺癌,卵巢癌和胰腺癌等.因此开发PI3K抑制剂不仅可以消灭肿瘤的生长,也可以协同其它的标记物治疗和化疗治疗相关的癌症.由于这条信号通路重要,已经有了几种相关基因组的方法来评估细胞系中PI3K-Akt-mTOR信号通路的活性以及原发性患者肿瘤的活动情况.
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EMD638683促进HCT116细胞凋亡机制探讨
目的 EMD638683是SGK1高度特异性的抑制剂,能够促进结肠癌细胞的凋亡,但其促进结肠癌细胞凋亡的机制仍然不清楚.本研究探讨了依赖帽状结构的转译在EMD638683诱导结肠癌细胞的凋亡中的作用.方法 蛋白质印迹法实验检测EMD638683对AHCT116细胞中mTOR及4EBP1磷酸化的影响,随后通过m7GTP pull down实验检测EMD638683对HCT116细胞中eIF4F蛋白复合物形成的影响,终通过蛋白质印迹法、流式细胞术和CCK8实验检测敲低4EBP1表达前后EMD638683对HCT116细胞中Survivin蛋白表达、细胞凋亡和存活的影响.结果 DMSO对照组pmTOR和p4EBP1相对值分别为1.00±0.07和1.00±0.08,而10、25和50 μmol/L EMD638683处理组pmTOR相对值分别为0.72±0.09、0.45±0.11和0.25±0.06,p4EBP1相对值分别为0.81±0.05、0.43±0.07和0.22±0.11;DMSO对照组与eIF4E相互作用的EIF4G的相对值为1.00±0.06,而10、25和50 μmol/L EMD638683处理组相对值分别为0.82±0.06、0.52±0.09和0.21±0.12;DMSO组Survivin相对值分别为1.00±0.05,而10、25、50 μmol/LEMD638683处理组Survivin相对值分别为0.61±0.15、0.39±0.12和0.19±0.07.细胞凋亡检测结果发现,DMSO对照组HCT116细胞的凋亡率为(3.16±0.6)％,25 μmol/L EMD638683处理组HCT116细胞的凋亡率为(29.66±2.89)％,而敲低4EBP1的HCT116细胞EMD638683处理组的细胞凋亡率为(7.83±1.16)％.CCK8细胞活性检测发现,DMSO对照组HCT116细胞的存活为1.00±0.04,25 μmol/LEMD638683处理组HCT116细胞的存活为0.44±0.06,而敲低4EBP1的HCT116细胞EMD638683处理组的细胞存活为0.83±0.05.结论 SGK1抑制剂EMD638683能够通过mTOR信号通路抑制依赖帽状结构的转译,从而抑制Survivin蛋白的表达诱发结肠癌细胞HCT116的凋亡.
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RNA干扰对宫颈癌Hela细胞中mTOR 4EBP1表达及细胞侵袭力的影响
目的 探讨mTOR蛋白与宫颈癌发生、发展过程的相关性和mTOR siRNA对宫颈癌细胞Hela中mTOR、4EBP1表达及细胞侵袭力的影响.方法 应用免疫组织化学方法检测宫颈鳞癌组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和正常宫颈鳞状上皮组织中mTOR蛋白的表达情况;应用RNAi技术处理宫颈癌Hela细胞,运用免疫细胞化学、原位杂交等技术检测处理前后Hela细胞中mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达情况;通过Boyden chamber体外侵袭实验,了解mTORsiRNA对Hela细胞侵袭力的影响.结果 mTOR蛋白在30例正常宫颈上皮组织、20例CIN组织和45例宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为36.7％ (11/30)、55.0％ (11/20)和71.1％ (32/45),正常宫颈组和CIN组与宫颈鳞癌组比较差异有统计学意义(P＜0.05);三种不同浓度的mTOR siRNA分别转染宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h,各组与各对照组相比,mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达差异均有统计学意义(P均＜0.05);转染mTOR siRNA的Hale细胞,穿越Matrigel的细胞数比各对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 mTOR蛋白的过表达可能与宫颈鳞癌的发生、发展有关;mTOR siRNA可下调宫颈癌Hela细胞中mTOR蛋白及mRNA的表达及抑制宫颈癌细胞的侵袭能力.
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非小细胞肺癌不同分期与4EBP1、S6K1的表达
目的:探讨非小细胞肺癌不同分期4EBP1、S6K1的表达,为非小细胞肺癌的临床治疗和预后判断寻求一条新的途径.方法:收集本院2003～2009年术前均未进行放疗和化疗的非小细胞肺癌不同分期手术患者标本;全部标本经体积分数为10%的甲醛水溶液固定,石蜡包埋,组织切片;采用免疫组织化学技术检测4EBP1、S6K1蛋白的表达.结果:随着非小细胞肺癌不同分期由0期到Ⅳ期的变化,4EBP1蛋白表达减弱而S6K1蛋白表达增强,其差异均具有统计学意义(P均<0.05).结论:在非小细胞肺癌不同分期4EBP1、S6K1的表达不同.
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二甲双胍对人食管癌KYSF450细胞系增殖和凋亡的影响
目的:探讨二甲双胍对人食管癌KYSE450细胞系增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法:体外常规培养KYSE450细胞,采用MTT法检测不同浓度二甲双胍对KYSE450细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测凋亡率,RT-PCR、Western blot检测药物作用后KYSE450细胞中4EBP1和S6K1 mRNA及蛋白表达的变化.结果:5、10、20和40 mmol/L二甲双胍对KYSE450细胞的增殖均有抑制作用,且呈剂量和时间依赖性(F剂量=470.513,F时间=743.696,F交互=22.359,P均＜0.001).5、10和20 mmol/L二甲双胍作用48 h后KYSE450细胞凋亡率显著增加,且呈浓度依赖性(F=282.076,P＜0.001).与对照组相比,5、10和20 mmol/L二甲双胍组KYSE450细胞中4EBP1、S6K1 mRNA和蛋白的表达量均明显下降(mRNA:F4EBP1=86.727,FS6K1=86.486,P均＜0.001;蛋白:F4EBP1 =43.137,FS6K1=118.924,P均＜0.001).20 mmol/L二甲双胍作用24、48和72 h后KYSE450细胞中4EBP1、S6K1 mRNA和蛋白表达亦降低(mRNA:F4EBP1=146.772,FS6K1=36.500,P均＜0.001;蛋白:F4EBP1=73.900,FS6K1=92.950,P均＜0.001).结论:二甲双胍能够抑制人食管癌KYSE450细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能与4EBP1和S6K1 mRNA及蛋白表达下调有关.
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隐丹参酮通过抑制帽子依赖的翻译促进人肺癌细胞A549的凋亡
目的 探索隐丹参酮对人肺癌细胞A549中帽子依赖翻译的影响及帽子依赖翻译在隐丹参酮促A549细胞凋亡中的作用.方法 免疫印迹实验检测隐丹参酮对A549细胞中mTOR及4EBP1磷酸化的影响,随后通过m7GTP pull down实验检测隐丹参酮对A549细胞中eIF4F蛋白复合物形成的影响,终通过免疫印迹实验、Annexin V和CCK8法检测敲低4EBP1表达前后隐丹参酮对A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达、细胞凋亡和存活的影响.结果 隐丹参酮以剂量依赖的方式抑制A549细胞中mTOR及4 EBP1的磷酸化、eIF4F蛋白复合物的形成和Bcl-2蛋白的表达.细胞凋亡分析发现,对照组中,隐丹参酮显著地诱导了A549细胞的凋亡[(4.68±0.77)％vs.(31.1±4.1)％,P＜0.05],但敲低4EBP1的表达显著抑制了隐丹参酮的促凋亡作用[(31.1±4.1)％vs.(8.85±1.2)％,P＜0.05].CCK8法检测结果发现,隐丹参酮显著抑制了A549细胞的存活[(1±0.09)％vs.(0.43±0.05)％,P＜0.05],但敲低4EBP1的表达拮抗了EMD638683的抑存活作用[(0.43±0.05)vs.(0.87±0.06),P＜0.05].结论 隐丹参酮通过抑制mTOR激酶的活性抑制4EBP1磷酸化,从而抑制A549细胞中帽子依赖的翻译,进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达诱发人肺癌细胞A549的凋亡.
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雷帕霉素及mTOR siRNA对宫颈癌HeLa细胞mTOR和4EBP1表达的影响
目的 探讨mTOR蛋白与宫颈癌发生、发展过程的相关性及雷帕霉素和mTOR siRNA对宫颈癌细胞中mTOR、4EBP1表达的影响.方法 应用免疫组织化学方法检测正常宫颈鳞状上皮组织、CIN组织和宫颈癌组织中mTOR蛋白的表达情况;应用RNAi技术及雷帕霉素分别处理宫颈癌HeLa细胞,运用原位杂交、免疫细胞化学技术分别检测处理前后HeLa细胞中mTOR、4EBP1 mRNA及蛋白的表达情况.结果 mTOR蛋白在30例正常宫颈上皮组织、20例CIN组织和45例宫颈癌组织中的阳性表达率分别为36.7％ (11/30)、55.0％(11/20)和71.1％ (32/45),正常宫颈组织、CIN组织与宫颈癌组织中mTOR阳性表达率比较差异有统计学意义(P＜0.05);三种不同浓度的雷帕霉素及mTOR siRNA分别处理宫颈癌HeLa细胞24、48和72 h后,各组与相应对照组相比,mTOR、4EBP1 mRNA及蛋白的表达量均有显著下降(P均＜0.05).结论 mTOR蛋白在宫颈癌组织中过表达,其过表达可能与宫颈癌的发生、发展过程相关;雷帕霉素和mTOR siRNA可抑制宫颈癌细胞mTOR mRNA及蛋白的表达,同时影响其下游4EBP1分子的表达.
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mTOR与4EBP1在喉鳞状细胞癌中的表达及相关性研究
目的:研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4EBP1)在喉鳞状细胞癌组织中的表达及相关性.方法:采用免疫组织化学方法检测mTOR、4EBP1在77例喉癌组织和18例癌旁组织中的表达,分析其表达与常见临床病理因素之间的关系.结果:mTOR、4EBP1在喉癌中的阳性表达率分别为54.5％、48.1％,均高于癌旁组织中的表达(P＜0.05).mTOR、4EBP1的阳性表达与淋巴结转移及组织病理学分级有显著相关性(P＜0.05),而与临床分期无相关性(P＞0.05).mTOR和4EBP1在喉癌中的表达呈正相关(P＜0.05).结论:①mTOR和4EBP1的高表达与喉癌的发病、侵袭、转移有关；②mTOR和4EBP1在喉癌组织中的阳性率呈正相关,联合检测对喉癌的治疗和预后判断具有重要临床意义.
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mTOR/eIF-4EBP1信号通路在粘液表皮样癌发生中的作用
目的:研究mTOR/eIF-4EBP1信号通路的激活在粘液表皮样癌发生中的作用.方法:用RT-PCR方法及Westen印迹分析测定粘液表皮样癌中mTOR和4EBP1的表达.结果:RT-PCR与Westen印迹分析的结果一致:和正常组织相比,粘液表皮样癌中mTOR的表达明显增加,4EBP1的表达明显降低.结论:口腔粘液表皮样癌中mTOR的表达增加和4EBP1的表达明显降低可能是介导粘液表皮样暴发生的主要机制之一.
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饥饿状态下CVB3对Hela细胞4EBP1表达的影响
目的 观察饥饿状态下柯萨奇病毒B3(CVB3)感染Hela细胞后对4EBP1表达的影响.方法 用RT-PCR法检测CVB3感染后非饥饿及饥饿状态下Hela细胞中4EBP1的表达.结果 饥饿与非饥饿状态下对照组及CVB3感染组(病毒组)Hela细胞中均有4EBP1表达,病毒组4EBP1表达降低(P＜0.05),随病毒感染时间延长,4EBP1表达下降更明显(P＜0.05);非饥饿组4EBP1表达低于饥饿组(P＜0.05).结论 CVB3感染Hela细胞后4EBP1表达下降,随时间的延长下降更明显,饥饿促进4EBP1的表达.
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P70s6k和4EBP1在膀胱癌中的表达及临床意义
目的:研究PI3K-Akt-mTOR信号传导通路中P70s6k和4EBP1在膀胱尿路上皮癌中的表达情况及与膀胱癌发生发展的关系.方法:用免疫组织化学法和Western blot法检测P70s6k和4EBP1在正常膀胱组织和肿瘤中的表达情况.结果:与正常组织比较肿瘤中的P70s6k和4EBP1蛋白水平表达显著增加(P＜0.05),表达量在浸润性癌中高于非浸润性癌且随膀胱癌病理级别增高而增高.二者表达有显著相关性(r=0.97,P＜0.05).结论:P70s6k和4EBP1在膀胱癌中呈高表达,并与肿瘤临床分期,病理分级密切相关,可能在肿瘤发生发展过程中起重要作用.
