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CTGF siRNA联合电针治疗对大鼠损伤脊髓星形胶质细胞GFAP表达的影响
目的:探讨抗CTGF小干扰RNA(small interferon RNA,siRNA)局部注射联合电针治疗对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为SCI组、CTGF siRNA 干扰(CTGF)组、CTGF siRNA干扰联合电针(EA+CTGF)组.制作大鼠SCI模型,将含有CTGF siRNA/Invivofectamine复合物溶液的明胶海绵移植入CTGF组和EA+CTGF组大鼠的脊髓(T10)损伤断端,SCI组用Invivofectamine转染试剂代替.EA+CTGF组在模型制备后每天的固定时间给予电针治疗.各组在3 d、7 d、14 d后分别取材,应用免疫荧光组织化学、Western Blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察星形胶质细胞的形态、数量和GFAP、GFAP mRNA表达变化.结果:SCI组星形胶质细胞反应性增生、胞体肥大,损伤边缘区形成GFAP强表达的胶质界膜；CTGF siRNA干预后,GFAP表达减弱,胞体减小,GFAP阳性细胞数减少；EA+CTGF组GFAP免疫反应表达明显降低,损伤边缘区GFAP荧光强度与脊髓其它区域基本相同.Western Blot结果显示:与SCI组相比,CTGF组与EA+CTGF组的GFAP均减少,有统计学意义(P＜0.05),与CTGF组相比,EA+CTGF组的GFAP减少,有统计学意义(P＜0.05)；RT-PCR电泳结果表明损伤早期EA+CTGF组GFAP mRNA表达明显低于损伤组并有显著性差异(P＜0.01),变化与Western Blot结果是一致的.结论:SCI后,CTGF siRNA联合电针治疗能有效阻止GFAP表达,使胶质反应减轻,有助于神经功能恢复.
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siRNA沉默CCN5抑制人胶质母细胞瘤细胞的生长
目的 研究小于扰RNA (siRNA)沉默高半胱氨酸蛋白61/结缔组织生长因子/肾母细胞瘤过度表达基因5(CCN5)对人胶质母细胞瘤细胞系生长的影响.方法 Western blot方法检测胶质母细胞瘤患者脑组织CNN5蛋白水平的表达;合成CCN5 siRNA小片段,并,筛选佳干扰片段;siRNA沉默CCN5在胶质母细胞瘤细胞系中的表达,噻唑兰(MTT)方法检测细胞的生长;CCN5沉默表达后,检测半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)的酶活性.结果 胶质母细胞瘤患者脑组织中CCN5蛋白表达水平较正常人脑组织中高;siRNA沉默CCN5表达抑制细胞的生长并促进凋亡效应基因caspase-3活性升高.结论 CCN5基因沉默抑制人胶质母细胞瘤细胞系的生长,为探讨CCN5在胶质母细胞瘤细胞中的作用奠定基础,并为胶质母细胞瘤的基因治疗提供潜在的靶标基因.
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非编码RNA在后囊膜混浊中的研究进展
后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)是白内障手术后常见的并发症,如何预防和治疗PCO是我们当前亟需解决的问题.非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一类不具备蛋白编码功能的RNA.已有研究证明非编码RNA与人类疾病的发生和发展密切相关.本文就不同的非编码RNA在PCO中的研究进展作一综述,为PCO的防治提供新思路与新方法.
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小干扰RNA沉默 HlF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2表达的影响
目的：：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1( hypoxia inducible factor-1, HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤( human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组；对正常组细胞用含有浓度为10％的胎牛血清和1％的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM 高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/ L CoCl2以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR 检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA 的表达,行Western-blot 检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA 表达量无明显变化(P>0.05)； MMP-2 mRNA 及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA 表达下降(P <0.05),证实转染成功；干扰组HIF-1αmRNA 和MMP-2 mRNA 和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中 HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。
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正常氧及低氧环境下小干扰RNA抑制促红细胞生成素表达的研究
目的:研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的特异性小干扰RNA(siRNA)对EPO表达的抑制作用,为视网膜新生血管的治疗提供新的途径.方法:体外培养NIH/3T3细胞,分成正常氧状态培养组和低氧培养组.通过脂质体(LF2000)将EPO siRNA转染两组细胞.采用RT-PCR及Western blot技术观察正常氧及低氧环境下EPO siRNA对细胞内EPO表达的抑制效果.结果:正常氧及缺氧环境下,EPO siRNA能明显抑制NIH/3T3细胞内EPO mRNA及蛋白质的表达.结论:EPO siRNA能显著抑制EPO的表达,为视网膜新生血管的基因治疗提供了新途径.
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CTGF siRNA转染对体外培养人晶状体上皮细胞株B3转分化的抑制作用
目的:研究脂质体介导CTGF siRNA 转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)株B3 CTGF和α-SMA表达的影响.方法:5`-异硫氰酸荧光素标记的CTGF siRNA与脂质体混合,并转染HLECs,通过荧光转染评估转染率.我们用CCK-8来评价转染组和对照组的细胞活力并使用实时定量RT-PCR,细胞免疫化学和Western blot来分析CTGF和α-SMA在转染后的表达改变.结果:脂质体介导的CTGF siRNA转染呈现出高效的转染率.转染率在24h高达95%.CTGF siRNA 72h转染能有效抑制HLECs的增殖.CTGF siRNA转染24h后CTGF和α-SMA的表达量都显著下降,而对照组则无类似效应.结论:CTGF siRNA 能够有效降低CTGF和α-SMA的表达.
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大鼠IκBα基因siRNA序列的体外筛选及体内验证
目的：寻找可在体内有效抑制大鼠睫状肌核转录因子资B抑制物α( I资Bα)基因表达的小干扰RNA( siRNA)序列。方法：设计合成3对针对大鼠I资Bα基因的siRNA,体外转染表达I资Bα基因的大鼠A7 r5细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并经 Real Time-PCR 及 western blot 在mRNA及蛋白水平筛选对I资Bα表达抑制率高的序列。通过前房注射选出的siRNA进行大鼠体内转染,荧光显微镜下观察其在大鼠睫状肌的分布并利用Real Time-PCR及免疫荧光验证其对该部位I资Bα基因沉默的有效性。结果：体外筛选证明针对大鼠 I资Bα基因 CTACGATG ACTGTGTGTTT靶序列的 siRNA 对 I资Bα的表达抑制效果明显,大鼠前房注射该siRNA可到达睫状肌,并能有效抑制该部位I资Bα基因的表达, I资Bα mRNA水平在转染后24 h降低明显,抑制率达59.0%,而蛋白水平则在72h达低,抑制率为52.3%(P<0.01)。结论：针对大鼠I资Bα基因CTACGATGACTGTGTGTTT靶序列的siRNA是对大鼠睫状肌I资Bα基因进行体内RNA干扰的有效序列。
关键词： IκBα 小干扰RNA 大鼠睫状肌 青光眼 葡萄膜巩膜房水流出通道 -
干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的表达
目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的抑制作用.方法:构建HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α.选择7d龄C57BL/6J小鼠24只,其中6只为正常组(A);另18只建立缺氧诱导的视网膜新生血管模型,并随机分为:对照组(B)、空载体组(C组)和基因治疗组(D组),每组6只.于出舱前1d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER空载体质粒;基因治疗组注射HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α.采用FITC-Dextran 荧光造影视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态变化;SP免疫组织化学检测各组间HIF-1α的表达差异.结果:荧光造影视网膜铺片显示,A组整个视网膜血管分布呈均匀网状;B、C组视网膜中周部口丁见大片无灌注区,见新生血管丛,伴荧光渗漏;D组无灌注区较B,C组明显减少,周边部毛细血管网基本正常,新生血管丛明显减少.免疫组织化学染色显示,A组HIF-1α蛋白表达刚性;B,C组在神经节细胞层呈阳性表达;D组在神经节细胞层呈弱阳性表达,较B,C组明显减少.结论:采用玻璃体腔注射,通过脂质体介导HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α 转染视网膜,有效地抑制了缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α 蛋白质的农达及视网膜新生血管的形成.
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慢病毒介导的TGFβ-R2shRNA抑制人LECs细胞TGFβ-R2的表达
目的：观察转化生长因子β-R2特异性短发夹 RNA （ shRNA ）对人晶状体上皮细胞TGFβ-R2表达的影响。
方法：根据小干扰RNA （ siRNA ）的设计原则，针对转化生长因子β-受体2基因序列特征构建特异性 shRNA （ RNAi ）载体，与TGFβ-R2过表达载体共转染293 T细胞，经Western blot筛选出有效RNAi载体后，进行扩增、纯化、滴度测定，并转染培养的人LECs ， qPCR 检测TGFβ-R2 siRNA慢病毒载体对TGFβ-R2 mRNA表达的影响。
结果：经Western blot 筛选，TGFβ-R2/GV115RNAi＃1对目的基因的表达敲减效果明显，慢病毒包装，滴度为8E＋8 TU/mL，感染人LECs细胞后，对TGFβ-R2基因有显著的敲减效果，达到78．1％（P＜0．05）。
结论：TGFβ-R2 RNAi载体构建成功，并且能抑制人晶状体上皮细胞TGFβ-R2 mRNA的表达。 -
SPHK1在舌鳞癌中的表达及其表达下调对Tca8113细胞迁移能力的影响
目的:研究鞘氨醇激酶1(SPHK1)在舌鳞癌组织中的表达及其表达下调对Tca8113细胞迁移的影响.方法:采用免疫组织化学检测45例舌鳞癌组织、36例癌旁异常增生组织和45例正常舌上皮组织中SPHK1蛋白的表达.利用脂质体2000将SPHK1 siRNA和对照siRNA分别转染Tca8113细胞,Western blotting检测细胞中SPHK1蛋白的表达;分别采用CCK-8和Boyden小室检测细胞增殖和细胞迁移能力的变化;用Western blotting检测细胞迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达的变化.结果:舌鳞癌组织中SPHK1蛋白的表达显著高于癌旁异常增生组织和正常舌上皮组织(X2=55.608,P=0.000).SPHK1 siR-NA能显著下调Tca8113细胞中SPHK1蛋白的表达,其表达下调能明显抑制舌鳞癌细胞的增殖和降低细胞的迁移能力.SPHK1表达的下调能明显降低舌鳞癌细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达.结论:SPHK1的过表达可能在舌鳞癌的发生发展过程中发挥重要作用,其表达下调介导的舌鳞癌细胞迁移能力的降低可能与MMP-2和MMP-9的下调密切相关.
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siRNA干扰对Eca-109食管癌细胞株Skp2表达的影响
目的:探讨siRNA干扰后食管癌Eca-109细胞株skp2 mRNA表达及肿瘤细胞增殖活性的影响.方法:通过siRNA转染食管癌Eca-109细胞株后,分别用RT-PCR和CCK-8检测skp2 mRNA的表达和细胞增殖的活性.结果:食管癌Eca-109细胞株增殖活性及Skp2 mRNA明显减少.结论:运用siRNA可以有效抑制skp2 mRNA的表达及细胞增殖活性.siRNA有望成为治疗食管癌的重要手段.
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FAK阻断对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响
目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制黏附斑激酶(FAK)基因表达后对鼻咽癌HNE-1细胞株增殖和凋亡的影响.方法:利用免疫组化法检测鼻咽癌HNE-1细胞株中FAK基因的表达.根据基因库上的FAK mRNA序列,设计合成针对FAK的小干扰RNA(siRNA)并转染HNE-1细胞,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR,Western Blot等方法检测细胞中FAK基因表达的变化;利用MTT法检测细胞的生长增殖;流式细胞术观察其对细胞周期及凋亡的影响.结果:鼻咽癌HNE-1细胞株中FAK基因呈阳性表达.针对FAK的siRNA使鼻咽癌HNE-1细胞株FAK mRNA和蛋白表达水平分别下调71.4%,59.8%;MTT法检测显示,细胞的生长增殖受到明显抑制,抑制率可达36.8%;转染后48 h,鼻咽癌HNE-1细胞G0/GI期细胞量增加,而s期及G2-M期的细胞减少,同时凋亡率增加.结论:干扰鼻咽癌HNE-1细胞内FAK基因的表达,可抑制肿瘤细胞的生长增殖,使细胞周期重新分布并促进凋亡.
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CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用
目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.
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Osteopontin特异性siRNA真核表达载体的构建及其在GC9811胃癌细胞中沉默效应的鉴定
目的:构建骨桥蛋白(OPN)特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对OPN基因的沉默作用. 方法:采用基因克隆技术,将合成的特异性OPN RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体mU6pro, 构建OPN siRNA真核表达载体. 以脂质体法将mU6pro空载体和2个(mU6pro/OPN-siRNA1和mU6pro/OPN-siRNA2)重组质粒分别导入具有高转移特性的GC9811胃癌细胞系. 72 h后用RT-PCR和Western blotting技术检测各实验组胃癌细胞内OPN mRNA及蛋白水平的表达情况. 结果:成功构建OPN siRNA 真核表达载体. 转染OPN-siRNA的胃癌细胞,72 h后OPN mRNA及蛋白表达下调,而以mU6pro/OPN-siRNA1的抑制效果更为明显. 结论:构建的RNA干扰真核表达载体能明显干扰OPN mRNA及蛋白的表达,为将其进一步应用于胃癌的治疗研究奠定了基础.
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黄芩苷对人牙周膜细胞RANKL-OPG表达的影响及其作用机制
目的 研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子-κB受体激活物配基和骨保护素(RANKL-OPG)表达的影响及其作用机制.方法 首先构建转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βⅡR)靶向siRNA真核表达载体,转染正常人外周血T细胞,使T细胞表面的TGF-βⅡR基因沉默,继而将转染与未转染靶向性TGF-βⅡR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中,分为6组:①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞.共培养48h,RT-PCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达,计算RANKL/OPG比值.结果 ①酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的 序列完全一致;②转染siRNA1的T细胞组的TGF-βⅡR mRNA的表达被明显抑制;③RANKL/OPG的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建了TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGF-β的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGF-β信号传导通路,而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控.
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沉默 IFITM1基因对卵巢癌 CP70细胞增殖和侵袭能力的影响
目的：探讨siRNA沉默IFITM1基因表达对卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭的影响。方法利用脂质体转染法将靶向IFITM1的小干扰RNA（siRNA）转染卵巢癌细胞株CP70；qRT‐PCR和Western blot观察转染后CP70细胞IFITM1 mRNA和蛋白表达的变化；平板克隆形成实验和Transwell小室分别检测各组细胞增殖和侵袭能力的变化。结果转染组CP70细胞的IFITM1 mRNA和蛋白表达明显受抑制；转染组、阴性对照组及转染试剂对照组形成克隆数分别为84、181、178，克隆形成率分别为42％、90．5％、89％，迁移出的细胞分别约为59个、121个、126个，转染组结果与其他两组之间有统计学差异，说明转染IFITM1siRNA抑制了卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭能力。结论沉默IFIT M 1可以降低卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力，IFIT M 1可能成为卵巢癌治疗的潜在新靶点。
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siRNA抑制hTERT对脑胶质瘤T98G细胞增殖及周期的影响
目的 研究人端粒酶逆转录酶被抑制后胶质瘤细胞系体外增殖及周期的变化,以期寻找控制胶质瘤细胞恶性行为的有效途径.方法 人工合成小干扰RNA(siRNA)序列,并将其通过lip2000转入体外培养的T98G胶质瘤细胞系中,荧光显微镜观察转染效率,免疫印记检测蛋白表达情况,MTT法检测细胞体外增殖表现,绘制生长曲线图,流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 成功转染siRNA,并有效抑制人端粒酶逆转录酶的活性,免疫印记验证干扰效果可靠,体外可抑制胶质瘤细胞的增殖,与对照组比较其抑制效率的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 体外条件下,可以通过siRNA有效抑制人端粒酶逆转录酶,从而有效抑制胶质瘤细胞的体外增殖,使胶质瘤细胞周期发生变化.这可能为胶质瘤的治疗带来新的启示.
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针对livin的siRNA表达载体的构建
目的 设计能够有效抑制livin基因表达的小干扰RNA,构建针对livin基因的siRNA重组表达载体.方法 通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的一组寡核苷酸片段,克隆到 pSilencerTM3.1-H1 hygro载体,并经BamH Ⅰ /EcoR Ⅰ双酶切及测序鉴定证实,livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体中.结果 经BamH Ⅰ /EcoR Ⅰ双酶切及测序鉴定证实,人livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体pSilencerTM3.1-H1 hygro中,构建了表达载体,测序分析证实插入序列正确.结论 成功构建了livin表达载体,为后续研究奠定基础.
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RNA干扰及抗病毒研究进展
RNAi是一种高度特异化的mRNA降解过程,能在哺乳动物细胞中诱导特异的基因沉默.这一发现为人类某些疾病的治疗研究开辟了新的途径.随着研究的不断深入,RNAi在抗病毒研究中受到越来越多的关注.本文拟就RNAi的机制、siRNA靶系列的选择及制备和抗病毒研究现状作一综述.
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RNAi抗病毒感染的研究进展
RNAi是双链RNA在细胞内诱导产生的转录后基因沉默现象.它广泛存在于多种生物体内,是宿主细胞防御微生物感染的进化机制.近年来,RNAi的研究日渐深入,尤其是RNAi的抗病毒作用倍受关注,其研究也取得了显著成绩.本文概述了RNAi的抗病毒机制以及RNAi在抗病毒感染中的应用等方面的研究进展.
