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RNA干扰及其在肿瘤研究中的应用
RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法,该技术通过双链RNA的介导,可以特异性地阻断或降低相应基因的表达.在肿瘤研究中,通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长.该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法.本文综述了小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)的生成和作用机制以及RNAi在肿瘤研究中的应用.
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慢病毒为载体的siRNA抑制肝星状细胞TIMP-1的表达
目的 观察以慢病毒为载体,用含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、具有较强抑制作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后对TIMP-1表达的抑制作用.方法 针对大鼠TIMP-1 mRNA基因序列挑选2个不同短片段(nt161～181和nt 445～463),在体外构建为短发夹siRNA1、siRNA2表达载体后,将其包装为重组Lenti/siRNA1-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA2-TIMP-1/GFP,同时包装阴性对照Lenti/GFP(空载体组),并以滴度MOI=10感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,感染后3 d,用流式细胞仪及荧光显微镜检测病毒的感染效率.分别在感染后7、9 d用Western blotting方法 检测TIMP-1蛋白表达情况.结果 感染HSC-T6后细胞形态和增生速度未发生明显变化.流式细胞仪及荧光显微镜检查证实感染效率分别为:空载体组 68.23%,siRNA1感染组57.93%,siRNA2感染组 51.2%,与正常细胞相比,感染后7 d和9 d,siRNA1、siRNA2感染组TIMP-1蛋白表达均有所下降,但只有siRNA1感染组在感染后9 d能显著抑制TIMP-1表达,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的重组Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP可短期有效抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6 TIMP-1蛋白表达.
关键词： 小干扰RNA 金属蛋白酶组织抑制因子-1 慢病毒 肝星状细胞 -
抑制CD147表达对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响
目的 研究小干扰RNA抑制CD147基因对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响.方法 将CD147特异的siRNA,经LipofectamineTM2000转染Jurkat细胞48 h后,用半定量RT-PCR检测CD147 mRNA水平的变化,Western blot和流式细胞术(FCM)分别检测总蛋白和细胞表面蛋白水平的变化.通过荧光倒置显微镜比较特异性抑制CDl47表达后Jurkat细胞集落形成的变化.结果 与对照组相比siRNA干扰组细胞CD147 mRNA和蛋白水平的表达均降低,抑制率分别为(38.57±1.55)%和(47.4±1.47)%,细胞表面CD147的平均荧光强度(MFI)下降(50.5±4.7)%(P＜0.05).随着CD147被抑制,siRNA干扰组细胞集落形成明显少于对照组(P＜0.05).结论 通过siRNA能抑制Jurkat细胞CD147的表达,随着CD147表达下降细胞集落的形成减少,提示CD147可能在炎症细胞粘附聚集中起到一定作用.
关键词： 小干扰RNA CD147 Jurkat T 淋巴细胞 细胞集落 -
突触后致密物蛋白质95基因沉默及对神经病理性疼痛大鼠疼痛行为的干预
目的 评估小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对突触后致密物蛋白质95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)基因的沉默效率及PSD-95基因沉默对谷氨酸诱导的神经细胞毒性与信号转导的影响,观察用RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默大鼠脊髓PSD-95基因治疗神经病理性疼痛的效果.方法 用神经母细胞瘤/大鼠神经胶质细胞瘤杂交瘤细胞(NG108-15细胞)筛选大鼠PSD-95基因特异的siRNA,并用谷氨酸刺激PSD-95基因沉默的NG108-15细胞,检测细胞生长活力与信号通路蛋白质表达与磷酸化的改变.建立大鼠神经病理性疼痛的坐骨神经慢性压迫(chronic constriction injury,CCI)模型,预防性及治疗性鞘内给予PSD-95siRNA,留取脊髓标本,实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)分析PSD-95 mRNA表达水平,并测定大鼠后足机械痛阈及热痛阈的变化.结果 序列特异性高的siRNA在佳转染条件下使PsD-95基因表达水平下降91.5％；PSD-95基因沉默既可增强神经细胞对谷氨酸毒性的耐受能力,又可抑制Ca2/钙调蛋白依赖的蛋白质激酶Ⅱα (CaMKⅡα)异构型磷酸化.正常大鼠鞘内注射PSD-95 siRNA可降低大鼠脊髓背角PSD-95 mRNA的表达水平38％ (P ＜0.05),但对痛阈无显著影响；CCI模型大鼠鞘内注射PSD-95 siRNA可明显缓解神经病理性疼痛.结论 PSD-95基因在神经病理性疼痛的发生中起重要作用.鞘内注射PSD-95 siRNA可以显著缓解CCI模型大鼠机械性和热痛觉过敏,PSD-95 siRNA可能成为有效控制神经病理性疼痛的基因治疗方法.
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RNA干扰技术及其应用
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默.在此过程中,与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解,从而抑制了该基因的表达.从发现RNAi现象以来,对RNAi的了解已取得重大进展.包括从初的,对其干扰模式的预测,到如今,能够精确了解RNAi在多个物种中调节基因表达的作用机制及多面性.RNAi技术也已经在很多领域成为研究基因功能的重要工具.
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RNA干扰及其在医学研究中应用的进展
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的,序列特异的基因沉默现象.小干扰RNA(siRNA)是RNAi作用中的效应分子.RNAi技术作为新兴的基因阻断技术具有明显优势,已经广泛地应用于基因功能研究、抗病毒感染和抗肿瘤等热门领域.现就RNAi作用机制、siRNA的制备、设计及RNAi技术在医学研究中应用做一综述.
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RNA干扰表皮生长因子受体在皮肤鳞状细胞癌治疗中的研究进展
RNA干扰(RNAj)是利用同源性双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默现象,是研究基因功能的重要工具.表皮生长因子受体在皮肤鳞状细胞癌中过度表达,且EGFR信号通路的启动后可促进细胞增殖、转移、血管生成及阻断细胞凋亡,因此被作为开发肿瘤治疗方法的新靶点.现将对RNA干扰表皮生长因子受体在皮肤鳞状细胞癌中的治疗作用予以综述.
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肿瘤中DNA甲基化和小RNA的关联研究现状
表观遗传学研究无DNA序列改变时可遗传的基因表达改变,DNA甲基化和RNA干扰(特别是小RNA)是其中研究广泛的基因表达调控机制.异常DNA甲基化或RNA干扰会导致肿瘤发生,它们是肿瘤基因诊断和治疗的靶点.通常,DNA甲基化在转录水平调节基因表达,而小RNA在转录后水平调控之,但两者间却存在紧密联系.在此对DNA甲基化和小RNA基本理论作概述,并就它们在肿瘤中的关联研究进行综述,包括小RNA的DNA甲基化调控,间接及直接作用于DNA甲基化的小RNA等部分.
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RRM2对人胃癌细胞MKN-45增殖、侵袭及顺铂耐药作用的研究
目的 研究核糖核苷酸还原酶亚单位M2(RRM2)基因在人胃癌MKN-45细胞增殖、侵袭、耐药中的作用,并初步探讨其可能的机制.方法 设计两组靶向RRM2基因的小干扰RNA,分别转染胃癌细胞MKN-45以抑制RRM2基因的表达,并同时设立阴性对照组(NC组)及未转染组.转染后琼脂糖电泳检测各组细胞RRM2基因表达,Western-blot检测各组细胞RRM2蛋白表达.CCK-8法对各组细胞增殖能力进行检测.不同浓度顺铂处理各组细胞进行耐药能力检测.采用Transwell小室对各组细胞侵袭能力进行检测.结果 琼脂糖电泳及Western-blot检测显示转染RRM2-siRNA后,RRM2在基因水平及蛋白水平表达均明显下调.转染RRM2-siRNA的人胃癌MKN-45细胞的增殖能力、侵袭能力均显著低于未转染组及NC组(P<0.05),转染组顺铂IC50分别为0.081μg/mL及0.079μg/mL,明显低于未转染组(0.14μg/mL)及NC组(0.136μg/mL)(P<0.01).结论 RRM2基因具有促进胃癌细胞增殖、侵袭的作用,并与顺铂耐药相关.
关键词： 胃癌 核糖核苷酸还原酶亚单位M2 小干扰RNA -
小干扰RNA技术在膀胱癌研究中的应用和展望
膀胱癌是我国泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，临床上主要以手术治疗为主，辅以放化疗和免疫治疗，但膀胱癌具有多发性和易复发性，远期疗效及患者生活质量并不令人满意。肿瘤基因治疗作为可能根治肿瘤的治疗手段日益受到人们的关注。小干扰技术是近年发展的一项特异性抑制基因表达的新方法，因其具备高特异性、高效性、简便易行等特点，为膀胱癌的发病机制及基因治疗的研究开辟了一条新道路。
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RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展
RNA干扰（ RNAi）技术是利用双链 RNA，高效、特异性降解细胞内同源信使 RNA，从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。与反义寡聚核苷酸技术相比，RNAi技术具有更高的特异性，是更有效的方法。目前，RNAi技术是肿瘤基因治疗领域的一个热点技术，它抑制癌基因表达及肿瘤血管生成，沉默细胞凋亡相关基因、肿瘤转移相关基因及肿瘤耐药相关基因，在肿瘤基因治疗领域显示出广阔的应用前景。
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特异性基因沉默对Machado-Joseph病ATXN3变异表达的抑制作用
目的：利用RNAi技术，观察不同siRNA在体外对Machado-Joseph病变异基因表达的抑制作用，为其应用于临床打下基础。方法本研究分为变异型ATXN3组、野生型ATXN3组及空病毒载体组(对照组)。通过设计针对ATXN3变异基因的特异性siRNA，构建重组型慢病毒载体转染HEK293T细胞，采用Real-time PCR及West-ern blot检测ATXN3 mRNA和蛋白的表达水平，从而对siRNA体外抑制Machado-Joseph病变异基因的效果进行评估。结果 Real-time PCR分析表明，在共转染表达人变异型ATXN3基因和siRNA ATXN3 Mut载体的细胞中，变异型ATXN3组中ATXN3 mRNA的表达较对照组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而野生型ATXN3组中ATXN3 mRNA的表达较对照组仅轻微下降，差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果表明，与对照组比较，变异型ATXN3组ATXN3蛋白表达被siRNA ATXN3 Mut 1~4明显抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，野生型ATXN3组中ATXN3蛋白表达仅被siRNA ATXN3 Mut 1~4轻度抑制。结论特异性siRNA可以选择性沉默变异型ATXN3，说明RNAi是Machado-Joseph病治疗的潜在方向。
关键词： Machado-Joseph病 基因沉默 RNA干扰 小干扰RNA 慢病毒载体 -
siRNA沉默GPNMB对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响
目的 探讨小干扰RNA(siRNA)干扰非转移性黑色素瘤糖蛋白B(GPNMB)表达对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响.方法 将GPNMB siRNA片段通过脂质体转染人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44,Western blot检测GPNMB蛋白表达水平;Annexin V/PI双染法检测GPNMB-siRNA对细胞凋亡的影响;MTT法检GPNMB-siRNA对细胞增殖的影响;Transwell法检测GPNMB-siRNA对细胞侵袭性的影响.结果 GPNMB siRNA能有效抑制人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44中GPNMB的表达,与空白对照组比较,GPNMB的缺失对细胞凋亡影响不大,可显著抑制细胞的增殖和侵袭(P < 0.05).结论 GPNMB基因敲除对人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44的凋亡无显著影响,但可显著抑制其增殖力和侵袭力,表明GPNMB在人胶质母细胞瘤的发生、发展中起着重要作用,提示GPNMB可以作为治疗人胶质母细胞瘤的潜在靶点.
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沉默酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1基因对人前列腺癌细胞生物学行为的影响
目的 观察ACAT1在人前列腺癌PC-3细胞增殖和侵袭迁移中的作用.方法 体外培养人前列腺癌PC-3细胞,通过脂质体HiperFect将ACAT1 siRNA转染至人前列腺癌PC-3细胞中沉默酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因的表达,Rea1-time PCR验证沉默的效果.利用CFSE染色法分别检测加入无血清1640培养基的空白对照组、加入阴性-siRNA-HiperFect复合物的阴性对照组和加入ACAT1 siRNA-HiperFect复合物的A-CAT1组人前列腺癌PC-3细胞的增殖率,比较ACAT1基因沉默前后细胞增殖的变化.利用Transwell小室法检测ACAT1基因沉默前后人前列腺癌PC-3细胞侵袭和迁移能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,ACAT1 siRNA组转染48 h ACAT1 mRNA表达水平低(P＜0.05).与阴性对照组和空白对照组比较,ACAT1siRNA组细胞增殖率下降,侵袭和迁移实验中穿膜细胞数减少,差异有高度统计学意义(P＜0.01).阴性对照组与空白对照组比较,细胞增殖率、侵袭和迁移能力无变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ACAT1基因干扰能抑制PC-3细胞的增殖,减弱侵袭迁移能力,为探寻前列腺癌发病机制和治疗提供新的思路和手段.
关键词： 前列腺癌 酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1 小干扰RNA 生物学行为 -
Bcl2-siRNA增加人肺腺癌细胞化疗敏感性的研究
目的 探讨bcl2-siRNA增加人肺腺癌细胞株A549对顺铂敏感性的作用.方法 在人肺腺癌细胞株A549细胞中转染bcl2-siRNA,48 h后加入不同浓度(0、0.5、1、2、3 μg/mL)新鲜配置的顺铂溶液,药物作用48 h后,用CCK-8法检测细胞生长抑制率.荧光实时定量PCR(Realtime RT-PCR)检测A549细胞转染bcl2-siRNA后Bcl-2 mRNA的变化.Western Blot检测A549细胞转染bcl2-siRNA后Bcl-2蛋白的变化.结果 在A549细胞中转染bcl2-siRNA后,Bcl-2 mRNA的表达下降了93.2%(P = 0.037),Bcl-2蛋白表达也明显降低.同时,细胞对顺铂的敏感性明显增加69.8%(P = 0.024).结论 Bcl2-siRNA能降低A549细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白的表达,增加A549对顺铂的敏感性.
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靶向结缔组织生长因子的siRNA对于肝星状细胞介导肝纤维化的研究进展
肝纤维化是多种慢性因素导致肝内细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激,机体发生的修复反应,以肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积和肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化为特征.它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝病的共同病理过程,持续进展可导致肝内正常组织结构改建形成肝硬化并出现多种危及生命的并发症,预后极差.由于体内存在纤维降解过程,故肝纤维化逆转可以避免病情进展至肝硬化.研究表明靶向结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可能抑制HSC活化、增殖及ECM的合成,使肝纤维化进程受阻.siRNA介导的CTGF基因沉默为肝纤维化治疗开辟了新的途径.
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SiRNA 干扰慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节 MrgC表达及 PKCε磷酸化的研究
目的：观察鞘内注射小干扰 RNA （ small interference RNA， siRNA ）对完全弗氏佐剂（ complete freund’s adjuvant， CFA）诱导的慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节（dorsal root ganglion， DRG）中MrgC（Mas-related G protein-coupled receptor C， MrgC） mRNA与蛋白表达的干扰作用，并观察该作用对大鼠患足痛阈及患侧DRG PKCε丝氨酸729点位磷酸化（ phosphorylation of PKCε Ser729， p-PKCε Ser729）水平的影响。方法健康雄性 SD （ Sprague-Dawley，SD）大鼠16只，随机分为对照siRNA组，MrgC siRNA组，每组8只。大鼠脊髓鞘内插管成功后，两组大鼠给予相应药物鞘内注射4 d，1次／d，5μg／d／只。给药第4 d，大鼠右后足底注射CFA 0.1 mL建立慢性炎性痛模型，此后隔日注射药物，直至给药第11 d处死。分别于鞘内置管前、给药前、给药4 d（ CFA造模0 h）、给药5 d （CFA造模24 h）、给药11 d（CFA造模7 d）5个时点检测大鼠患足机械缩腿阈（Paw withdrawal thresholds， PWTs）的变化。荧光定量PCR法检测患侧DRG MrgC的mRNA的表达，免疫荧光法检测患侧DRG MrgC表达量及p-PKCεSer729的含量。结果与给药4 d比较，给药5 d两组大鼠的PWTs均有显著的下降（ P＜0.01）；给药前后各时点，两组大鼠之间PWTs没有明显差异。观察给药11d时大鼠患侧L4-L6 DRG MrgC mRNA的表达，与对照siRNA组比较，MrgC siRNA组各神经节MrgC mRNA的表达均明显下降（P＜0.01）；观察大鼠给药11d时大鼠患侧L4-L6 DRG MrgC与p-PKCεSer729的表达，与对照siRNA组比较，MrgC siRNA组患侧DRG的MrgC阳性细胞率明显减少（ P＜0.01），而p-PKCεSer729的阳性细胞率显著上升（P＜0.05）。结论 MrgC siRNA片段可有效干扰CFA慢性炎性痛大鼠患侧L4-L6 DRG MrgC mRNA与MrgC的表达，对MrgC的干扰作用能显著上调PKCεSer729磷酸化的水平，但不影响大鼠患足机械缩腿阈。
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两种不同病毒载体携带靶向大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1小干扰RNA抗肝纤维化作用的比较
目的 观察以腺相关病毒(AAV)及慢病毒(Lentivirus)为载体含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型的干预作用.方法 挑选针对大鼠TIMP-1基因具有较强抑制作用的siRNA序列,在体外构建为短发夹表达载体后,将其包装为重组AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1,同时包装对照病毒AAV/EGFP和Lenti/EGFP.将Wistar大鼠分为对照组、CC14模型组、AAV/EGFP组、Lenti/EGFP组、AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1组,观察CCl4造模4周后,经H&E及Masson染色评价各组动物的肝纤维化状况,经荧光定量RCR及Western blot方法检测TIMP-1的表达抑制情况.结果 H&E及Masson染色证实,与对照组相比,CCl4模型组、AAV/EGFP组、Lenti/EGFP组肝脏胶原纤维明显增加,纤维化评分多为3-4级,同时肝脏TIMP-1的转录与蛋白表达水平均明显上升；而AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1组肝纤维化程度明显减轻,纤维化评分多为2-3级,伴随肝脏TIMP-1的转录与蛋白表达水平均显著抑制.AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1组在组织学表现及TIMP-1基因的转录与表达水平上无统计学差异.结论 AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1均可有效抑制大鼠肝脏TIMP-1基因表达,进而发挥抗肝纤维化作用.
关键词： 腺相关病毒 慢病毒 小干扰RNA 金属蛋白酶组织抑制因子-1 大鼠 -
Raf-1基因重组腺病毒 siRNA 载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响
目的：构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体，并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列，经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中获得pAdTrack-siRaf-1质粒，PmeI线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siRaf-1质粒，后转染HEK293细胞，包装获得pAd-siRaf-1腺病毒颗粒，继而感染原代培养的心肌细胞，通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率，液体闪烁计数仪测定3 H-亮氨酸（[3 H]-leu）掺入率，用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确，制备的病毒感染效率高，携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3 H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了pAd-siRaf-1重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。
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小干扰RNA抑制真核翻译起始因子5A2对MKN28胃癌细胞恶性生物学行为的影响
目的 研究真核翻译起始因子5A2 (EIF5A2)在胃癌细胞增殖及迁移侵袭调控中的作用及其可能机制.方法 采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)及Western blot法检测EIF5A2在MKN28、HGC27细胞及正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)内的表达,评估小干扰RNA (siRNA)对EIF5A2的抑制效果.检测EIF5A2蛋白在2例人胃癌及匹配的非癌胃黏膜组织的表达.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移及侵袭力,Western blot法检测CyclinD1、CyclinD3、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、E-cadherin、Vimintin、C-myc及转移相关蛋白1(MTA1)的表达水平.结果 EIF5A2在MKN28细胞及人胃癌组织内呈高表达.EIF5A2 siRNA#1可明显抑制MKN28细胞内EIF5A2 mRNA及蛋白的表达.抑制EIF5A2后可明显抑制MKN28细胞增殖(P均＜0.01)、迁移(P＜0.001)及侵袭能力(P ＜0.001).抑制EIF5A2后,Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调,CyclinD1、CyclinD3、MTA1及C-myc表达明显受抑制.结论 siRNA下调EIF5A2可能通过抑制CyclinD1、CyclinD3抑制MKN28细胞增殖,并通过抑制MTA1、C-myc及上皮间质转化抑制MKN28细胞迁移及侵袭能力.
关键词： 真核翻译起始因子5A2 胃癌 小干扰RNA 增殖 转移
