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阻断型抗人IgE单克隆抗体的制备及其表位分析
目的 利用基因重组抗原免疫小鼠,制备抗人IgE单克隆抗体,研究其特异性和功能.方法 用表达的重组人IgE-Fc免疫BLAB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,以间接ELISA法筛选杂交瘤上清.用ELISA阻断分析鉴定其生物学功能；通过丙氨酸突变扫描分析确定其抗原表位.结果 利用杂交瘤技术获得了1株抗人IgE的单克隆抗体178,它具有IgE抗体特异性反应,其识别的抗原表位位于IgE与其受体结合的关键部位.经鉴定其具有体外阻断IgE与其受体结合的活性.结论 利用基因重组抗原制备了1株抗人IgE的单克隆抗体178,此单克隆抗体具有体外阻断IgE与其受体结合的生物活性.
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VEGF受体结合抑制肽的筛选及其特性鉴定
目的筛选能抑制VEGF与血管内皮细胞表面受体结合的VEGF模拟短肽,探讨小分子短肽作为血管内皮细胞生长抑制剂、肿瘤疫苗的可行性. 方法以抗-VEGF单克隆抗体分别对噬菌体随机7肽、12肽库进行筛选.通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定.用噬菌体克隆免疫小鼠检验这种短肽可否模拟VEGF的抗原决定簇诱发机体产生能与VEGF结合的抗体,研究小鼠抗血清、噬菌体表达的7肽和12肽以及人工合成7肽对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)生长的抑制作用. 结果对肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列:GWYYDAL、VASAVFYSALVE.这两种噬菌体短肽免疫小鼠能激发产生高效价的抗-VEGF抗体.噬菌体表达的7肽和12肽对HUVEC的生长有明显的抑制作用.由短肽GWYYDAL阳性克隆免疫的抗血清对VEGF诱导的内皮细胞生长起抑制作用,人工合成的7肽(GWYYDAL)呈剂量依赖性阻拮VEGF促HUVEC增殖作用. 结论从噬菌体肽库中筛选到的噬菌体短肽GWYYDAL、VASAVFYSALVE模拟了VEGF的抗原表位,为研究VEGF受体结合抑制肽和设计肿瘤疫苗奠定了实验基础.
关键词： 噬菌体随机展示肽库 血管内皮细胞生长因子 抗原表位 合成肽 疫苗 -
鲍曼不动杆菌外膜蛋白OMP33-36抗原多表位的构建与筛选
目的 筛选鲍曼不动杆菌外膜蛋白(outer membrane protein 33×103~36×103, OMP33-36)抗原的B细胞、T细胞表位.方法 运用生物信息学软件预测OMP33-36蛋白分子小鼠B细胞及T细胞表位并人工合成相应肽段;构建重组质粒pET-30a-OMP33-36并原核表达、纯化获得OMP33-36蛋白;以OMP33-36蛋白免疫BALB/c小鼠,5周后收集小鼠血清并分离小鼠脾脏细胞.间接ELISA法检测小鼠血清中B细胞表位抗体水平,双夹心ELISA法检测经候选T细胞表位体外刺激后脾细胞分泌IFN-γ量.结果 构建候选B细胞和T细胞表位各3条,分别为PB1、PB2、PB3,PT1、PT2、PT3;间接ELISA结果显示,PB1及PB2与OMP33-36蛋白免疫组小鼠血清发生反应,其A450值与对照组相比显著升高(P<0.05);双夹心ELISA结果显示,PT3刺激免疫组小鼠脾脏细胞产生的IFN-γ量与对照组相比显著升高(P<0.05). 结论 成功构建并筛选出鲍曼不动杆菌OMP33-36蛋白的2个B细胞表位PB1及PB2,1个T细胞表位PT3.
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卡氏肺孢子菌A12抗原表位及其蛋白质特征的预测
卡氏肺孢子菌A12抗原是近年来发现的一种相对分子质量为30×10~3的抗原蛋白.在SWISS-PROT数据库中检索其蛋白序列号为AAR20917.1.本实验通过DNAStar软件对A12蛋白的二级结构、亲水性、可及性及可塑性参数进行分析来综合性预测A12蛋白B细胞抗原表位;同时在SYFPE1THI服务器上预测A12蛋白T细胞表位.
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嵌合人偏肺病毒表位的重组流感病毒毒株的构建
目的 构建和拯救重组嵌合表达人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)表位的流感病毒株.方法 将通过生物信息学软件预测的hMPV B细胞表位、CTL表位和Th表位串联为不同表位组合,将其表位蛋白基因分别插入A/PR/8/34(PR8)流感病毒非结构蛋白NS1基因,利用8质粒系统共转染293T/MDCK细胞,拯救重组流感病毒毒株,全基因组测序鉴定重组流感病毒.同时测定重组病毒的血凝素(HA)活性和半数细胞感染量(TCID50)及生长曲线.结果 在hMPV不同表位间引入间隔序列GPGPG和KK,构建串联多表位抗原,将该抗原基因插入PR8流感病毒非结构蛋白NS基因,经反向遗传学成功拯救出3株重组流感病毒毒株.经MDCK细胞传代3次,鸡胚传代1次,3株重组流感病毒毒株增殖稳定.流感病毒全基因组测序证实,重组的3株流感病毒毒株分别嵌入了hMPV的B细胞表位、CTL表位/Th细胞表位和B细胞表位/Th细胞表位,命名为rFLU/hMPV/B、rFLU/hMPV/CTL-Th、rFLU/hMPV/B-Th.HA滴度分别为128、128、256,TCID50分别为107.0/ml、106.8/ml和107.0/ml.生长曲线试验结果表明重组流感病毒毒株可在MDCK细胞中有效复制.结论 成功拯救出3株嵌合有hMPV B细胞表位、CTL表位/Th细胞表位和B细胞表位/Th细胞表位的重组流感病毒株,为后续评价该重组病毒株的免疫效果及是否有潜在疫苗应用价值提供实验资料.
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HCV高变区合成多肽的抗原性研究
目的通过计算机同源模建,寻找丙型肝炎病毒高变区(HCV HVR1)中保护性多肽抗原表位.方法计算机同源模建,预测多肽的抗原性,然后用淋巴细胞转化的方法验证其抗原性.结果同源模建与实验结果一致,多肽抗原性有待进一步的提高.结论同源模建是一种高效寻找具有保护性抗原多肽的经济快速方法.
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抗SARS冠状病毒中和活性单克隆抗体的筛选及其结合位点分析
目的建立能分泌具有中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体(McAb)细胞株,制备有中和活性的抗SARS-CoV McAb,用于SARS-CoV感染的早期特异诊断和进行SARS-CoV结构蛋白的功能研究.方法用灭活纯化SARS-CoV(BJ01株)免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,建立能稳定分泌SARS病毒McAb的杂交瘤细胞系,然后用中和试验进一步筛选分泌具有中和活性的抗SARS-CoVMcAb细胞株.利用SARS-CoV的S和N蛋白的不同长度肽段通过ELISA鉴定McAb的特异结合区域,分析S和N蛋白不同区域诱导产生抗体的能力和特性.结果建立了12株能稳定分泌抗SARS-CoVMcAb的杂交瘤细胞株,间接免疫荧光法检测抗体效价在1:320～1:20 480之间,其中6株具有较好的中和SARS-CoV的能力.具有中和活性的McAb中,3株是针对S蛋白的,2株是针对N蛋白的,其中抗S蛋白的中和抗体活性比抗N蛋白的中和抗体活性高,另外1株可能是针对SARS-CoV的其他结构蛋白的.进一步对6株抗S蛋白的McAb的特异抗原结合表位分析,发现其中3株结合位点在S蛋白第12～311氨基酸之间,2株在第310～535氨基酸之间,后者中和效价高于前者,另1株是针对S2蛋白的,SARS病毒的受体结合区正位于第310～535氨基酸这一区段.具有中和活性的McAb通过间接免疫荧光、ELISA、酶标免疫组化法和胶体金方法对SARS病毒进行检测,都显示出高度的特异性和良好亲和力.结论成功制备了具中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体,并分别测定了McAb对S蛋白和N蛋白的特异抗原结合活性,初步确定了S蛋白的中和表位.为今后SARS病毒的特异诊断、结构蛋白的功能分析和重组疫苗的研制奠定了较好的基础.
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不同基因型戊型肝炎病毒的抗原表位分析
目的研究不同基因型戊型肝炎病毒(HEV)的抗原表位特点. 方法以HEV基因工程重组蛋白p166Bur、p166Mex为免疫原,制备单克隆抗体(McAbs).采用间接ELISA法及免疫印迹法(Western blot),检测所制备的McAbs与7种不同基因型和亚型p166(p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn)的交叉反应性. 结果获得4株稳定分泌基因型相关McAb的杂交瘤细胞株,即1B5、1D10、1G10和D4A3.经检测,1B5、1D10、1G10分泌的McAbs只与p166Bur及p166Mor特异结合,D4A3分泌的McAb只与p166Mex特异结合. 结论不同基因型HEV存在不同的抗原表位.
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登革2型病毒E蛋白免疫优势表位的筛选鉴定
目的用噬菌体展示肽库筛选登革2型病毒(DEN2)E蛋白的抗原表位,并确定该抗原表位性质. 方法以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体随机12肽库,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导,通过噬菌体展示肽序列与DEN2 E蛋白的氨基酸一级结构的对比,初步确定E蛋白的抗原表位;用模拟该表位线性序列的合成十肽进行抗体结合试验、噬菌体竞争抑制试验及与DEN感染患者的血清学试验,确定其为免疫优势线性表位. 结果肽库淘洗获得的11个ELISA阳性的噬菌体克隆有相似的结构基序WFKKGSS,其展示肽与DEN2 E蛋白390～398 AA序列有3～5个氨基酸相同.对应于DEN2 E蛋白390～399 AA的合成十肽能与淘洗单抗特异反应,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合.该合成肽与DEN2感染患者血清有较高的免疫反应性. 结论本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定的DEN2 E蛋白(E390～398 AA)线性序列为免疫优势表位,其对应的合成肽E10可望用于DEN2感染的快速诊断.
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G145R变异乙型肝炎表面抗原诱导的抗体性质研究
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)变异可导致抗原性改变.HBsAg a决定簇常见的变异位点是G145R.G145R变异可能改变原来的抗原表位,并形成新的抗原表位.本研究探讨G145R HBsAg能否刺激机体产生抗体及免疫应答的情况.
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自身免疫性肝炎患者中可溶性肝抗原B细胞抗原表位分布特征分析
目的 分析自身免疫性肝炎(AIH)患者中可溶性肝抗原(SLA) B细胞抗原表位分布特征.方法 以21例AIH患者为研究对象,以15例原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者、20例慢性病毒性肝炎患者、20例健康体检者为对照组.采用人工合成肽段与ELISA方法,检测SLA抗原的B细胞抗原表位,并与T细胞识别片段及SLA进化过程中的序列布进行对比.结果 21例AIH患者中,10例患者血清与SLA抗原肽库呈现阳性反应,阳性率为 47.62%,10例阳性反应血清与SLA连续一维肽库反应的A值以肽库7(aa385～441)反应强,均值为0.400±0.109,明显高于其他各组肽库A值(P<0.001),其是高度保守蛋白的不保守区域.T细胞识别的区域与B细胞识别的区域有所不同,主要位于肽库1及肽库2,反应频率分别为30%、40%,对肽库7 的反应频率为10%.结论 SLA B细胞线性抗原表位位于aa385～441,具有高度的一致性,并与T细胞识别的部位有交叉重叠现象,提示在AIH发病机制中存在细胞免疫与体液免疫的多重、相互关联的机制作用.
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核不均一性胞核核糖核蛋白Ⅰ(hnRNPI)抗原表位在系统性硬化症中临床意义的研究
目的 探讨核不均一性胞核核糖核蛋白Ⅰ(hnRNPI)抗原表位多肽在系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)中的临床意义,初步建立简便快捷的ELISA检测方法,为系统性硬化症的早期诊断寻找新的临床指标.方法 根据已知的hnRNPI蛋白的氨基酸序列,应用不同的蛋白质抗原表位图谱分析软件对其进行表位分析,经比对筛选后,化学合成hnRNPI短肽序列2个,分别命名为Ⅰ-1264-292及Ⅰ-2441-461,作为抗原对临床上包括硬皮病在内的多种结缔组织病患者血清相应抗体进行ELISA检测,包括SSc 42例、系统性红斑狼疮(SLE)102例、干燥综合征(SS)26例、混合型结缔组织病(MCTD)16例、未分化结缔组织病(UCTD)13例,其他结缔组织病(CTD)30例、类风湿关节炎(RA)26例及正常对照54例.结果 抗hnRNPI-1及抗hnRNPI-2多肽抗体在SSc组中阳性率均明显高于其他疾病组(P＜0.05),在SSc中敏感性分别为47.62%及38.1%,特异性分别为93.43%及91.08%,二者之间差异无统计学意义(P＞0.05).另外,除了与SSc患者病程相关外,该二抗体均与发病年龄、临床症状、器官受累、ESR、抗Scl-70抗体、抗着丝点抗体及抗核仁抗体之间未发现有统计学意义的相关性(P＞0.05).结论 I-1及I-2分别是位于hnRNPI蛋白表面的抗原表位之一,具有抗原性,其抗体对SSc的临床诊断具有较高的敏感性及特异性,且在病程早期具有更高的阳性率,有助于SSc的早期诊断.
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B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析
目的 应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白表位,结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析.方法 用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测B族链球菌C5a肽酶蛋白的表位,应用PCR技术扩增出编码该表位基因片段,克隆PCR产物构建重组质粒,测序验证.在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白.表达的蛋白经质谱分析和Western blot鉴定.纯化该融合蛋白并免疫C57/BL小鼠,萃取GBS表面蛋白,双向琼脂扩散试验检测抗体水平.结果 在SCPB中预测到1个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段.重组和表达了这一肽段,质谱得出与SCPB蛋白的相似性分数为79,Western blot证实能与抗SCPB的抗体反应,纯化后融合蛋白纯度＞90%.动物实验证实融合蛋白能产生特异性的抗GBS抗体.结论 重组表位具有一定免疫原性,为相关蛋白的毒力机制研究和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础.
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戊型肝炎病毒嵌合重组蛋白的表达及免疫原性研究
我国是戊型肝炎主要流行区之一,人群感染率达17.2%,且呈上升趋势.由于缺乏有效的病毒体外长期培养系统,阻碍了戊型肝炎病毒(HEV)疫苗的研制和诊断试剂的开发.用基因工程手段表达HEV主要结构蛋白已成为研究的热点.本文报道用原核表达系统表达含HEV主要抗原表位的ORF2和ORF3的嵌合蛋白,并对其免疫原性进行研究.
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钩端螺旋体外膜蛋白GroEL优势T-B联合抗原表位及其免疫原性鉴定
致病性钩端螺旋体（以下简称钩体）感染引起的钩体病是全球流行的人兽共患传染病［1-3］。现行钩体疫苗保护力微弱且有较大副作用［3-5］。多抗原肽（ multiple antigenic pep-tides，MAP）疫苗具有能同时提呈多种抗原表位、提呈作用强、形成共价表位提高抗原性等优点［6］。本研究中我们检测了groEL基因在我国流行的致病性钩体血清群中分布、筛选并确定了GroEL分子中优势T和B细胞（ T-B）联合抗原表位及其激活T细胞亚群的能力，以期为今后研制通用型钩体MAP疫苗提供候选抗原表位。
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登革病毒特异性抗原片段的筛选鉴定及其ELISA方法的建立
目的 筛选、鉴定登革病毒共同及型特异性抗原,用纯化抗原建立检测登革病毒抗体的ELISA方法.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E、NS1蛋白进行分析,预测可能的抗原表位.并根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析登革病毒的共有及型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革病毒株中的保守性.然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a、pMAl-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应特异性.Western blot检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化.结果经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒抗原表位18个,登革病毒型特异性抗原表位25个,并对其中得分值较高的5段进行了高效表达,经Western blot分析,获得登革1～4型(Den-Ag5),登革2、4型(Den-Ag3),登革1～3型(Den-Ag2)病毒共同抗原片段各一段,登革1、2、4型( Den-Ag1、Den-Ag4)共同抗原片段两段,与流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒及所用甲病毒多克隆抗体均无交叉反应.选择Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2作为检测用抗原,建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法,初步应用表明,所建立方法具备良好特异性,可检测50～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在15以上.结论 经系统筛选,获登革病毒特异性抗原片段5段,并建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法.
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1型登革病毒抗原表位嵌合人3型腺病毒六邻体重组病毒的构建及免疫学鉴定
目的：构建六邻体嵌入1型登革病毒（ DENV1）抗原表位的人3型重组腺病毒，鉴定其抗原性。方法以人3型腺病毒骨架质粒pBRAdΔE3GFP为模板，overlap PCR在六邻体高变区HVR1插入DENV1的抗原表位，突变的六邻体片段克隆到穿梭载体，酶切后与线性化的3型腺病毒骨架质粒pBRAdΔE3GFP在大肠杆菌BJ5183同源重组，获得阳性重组腺病毒质粒pBRAdΔE3GFP-DENV1。线性化后转染AD293细胞拯救重组腺病毒rAdΔE3GFP-DENV1并大量培养。纯化后腺病毒免疫BALB／c小鼠，通过ELISA和Western blot检测小鼠的体液免疫应答。结果在人3型腺病毒六邻体成功插入DENV1抗原表位并包装出重组腺病毒，ELISA和Western blot结果显示小鼠免疫后能产生血清识别DENV1。结论成功构建六邻体HVR1嵌入DENV1抗原表位的重组腺病毒，为多价登革病毒疫苗的研究奠定了基础。
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应用随机多肽文库测定BAC5单抗相关的抗原表位
目的鉴定能被BAC5单抗识别的定位于鼻咽癌细胞表面的抗原表位。方法应用BAC5单抗作为靶抗体对噬菌体展示的随机12肽文库进行3轮生物淘洗，用抗体捕获和竞争试验的夹心ELISA方法选择和鉴定阳性噬菌体克隆，对阳性和阴性噬菌体的外源性DNA片段进行序列分析，推导和比较由这些噬菌体所展示的多肽的氨基酸序列。结果通过3轮生物淘洗能被抗体捕获的噬菌体克隆为77% (35/45)。用竞争试验从所捕获的克隆中测得8个阳性克隆。来自这8个克隆的噬菌体展示3种外源多肽，即-H-Q-S-H-Y-P-Y-P-V-V-S-L-(4/8)，-Q-N-Q-A-W-F-S-Q-P-P-V-R-M-(3/8)和-T-Q-A-Y-K-G-F-P-V-L-P-S-(1/8)，与来自阴性克隆的多肽序列-N-H-Q-S-T-F-W-Q-K-W-T-A-(6/6)比较，前3个序列在靠近肽的N端都具有相同的脯氨酸(P)和缬氨酸(V)结构(-P-V-)。结论 BAC5单抗能识别近N端含有脯氨酸和缬氨酸结构的多肽。这些多肽可能模拟存在于鼻咽癌细胞表面，与BAC5单抗相关的抗原表位的构象。
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BPI N端优势抗原表位的模拟合成及其人源抗体的筛选
杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是存在于人及哺乳动物多形核白细胞中的一种阳离子抗菌蛋白.
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两种PTH载体蛋白连接法的特异抗体及载体抗体比较的初步探讨
人甲状旁腺激素(hPTH)是由84个氨基酸组成的一种重要的生物活性肽,对调节钙、磷代谢起着极为重要的作用,目前多使用针对限定抗原表位的抗体建立夹心法来测定人甲状旁腺激素(hPTH)分子.PTH结构简单,单独刺激机体不易产生抗体,只有与载体分子连接后才可得到较强的免疫应答效应.
