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蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素特异性优势抗原表位肽的抗原性分析
目的 筛选蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫,Giardia lamblia)α-8贾第素(α-8 giardin)的优势抗原表位肽,并分析其抗原性. 方法 采用DNAstar、Biosun软件及CLUSTAL W软件进行生物信息学分析,筛选出贾第虫o-8 giardin的3个优势抗原表位肽,即G1 (7～17 aa)、G2 (30～40 aa)和G3(296～306 aa);3个抗原表位肽分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后(KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3)免疫雌性青紫蓝家兔(每组2只),分别行背部皮下多点(8～10点)免疫注射,首次免疫各偶联蛋白0.5 mg/只(每点100μl).分别于首次免疫后14、21、28 d进行加强免疫(各偶联蛋白0.2 mg/只),于每次免疫前进行兔耳缘静脉采血,末次加强免疫后7d颈动脉取血(各50 ml).用间接ELISA检测3种(KLH-G1、KLH-G2和KLH-G3)免疫抗血清中IgG抗体效价;蛋白质印迹(Western blotting)分析3种免疫抗血清与重组蛋白rGiardin的抗原性. 结果 利用生物信息学相关软件筛选出的贾第虫α-8giaMin 3个候选抗原表位肽分别与KLH偶联后获得3个偶联蛋白(KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3),经纯化后蛋白浓度分别为0.66、0.95和0.25 mg/ml.分别于加强免疫家兔后7d,ELISA检测结果显示,3种(KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3)免疫抗血清的抗体效价分别为1∶12800,1∶51200,1∶51200;SDS-PAGE分析结果显示,经纯化后的3种抗血清均在相对分子质量(Mr)约36 000处出现特异性的清晰条带,无其它杂带.West-ern blotting分析结果显示,3种抗血清均可特异性识别重组蛋白rGiardin. 结论 筛选出的贾第虫α-8 giardin 3个优势抗原表位肽与KLH偶联后免疫家兔,可诱导产生特异性IgG抗体;3种免疫抗血清中的特异性IgG抗体均可识别重组蛋白rGiardin;3个贾第虫o-8 giardin抗原表位肽均有较好的抗原性.
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间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的序列和重组抗原表位分析
目的 对间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)基因的序列及重组抗原的表位进行比较分析. 方法 根据GenBank中已知的pLDH基因序列(登录号为DQ198262和DQ060151)设计特异性引物,体外扩增间日疟原虫和恶性疟原虫LDH的全长基因,对两序列进行比对分析,用SYFPEITHI软件进行表位预测分析.将Pv-LDH和Pf-LDH基因克隆入pET28a表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blotting和中和ELISA法鉴定重组蛋白. 结果 Pv-LDH和Pf-LDH基因的编码区全长均为951 bp,编码316个氨基酸,Pf-LDH与参考序列DQ198262完全一致,而Pv-LDH与参考序列DQ060151仅在第666位有一个核苷酸的变异;两者的核苷酸和氨基酸序列的一致性分别为75.1%和90.2%.T细胞表位预测分析结果显示,能识别pLDH抗原表位的人类白细胞抗原(HLA)分子类型共28种,预测的表位数约为180个,相同或相似的表位约占总表位数的75%,Pv-LDH和Pf-LDH特异性表位分别为38个和45个.Western blotting分析显示,Pv-LDH重组抗原可被疟疾患者血清识别,但反应强度明显低于Pv-LDH重组抗原免疫兔血清.中和ELISA试验结果显示,Pv-LDH抗原对多克隆抗体高抑制率可达70.3%,而Pf-LDH抗原的高抑制率仅为30.5%. 结论 Pv-LDH和Pf-LDH基因的核苷酸序列及其重组抗原均有差异,特异性表位诱导的抗体在整个抗体谱中相对较少.
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约氏疟原虫与伯氏疟原虫侵入期抗原的初步研究
目的用针对鼠约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)侵入期的8种单克隆抗体,对约氏疟原虫和伯氏疟原虫(P.berghei)侵入期即动合子、裂殖子和子孢子棒状体和表面抗原检测分析.方法间接免疫荧光实验(IFA)对各侵入期抗原进行亚细胞结构定位,SDS-PAGE及Western印迹对两种鼠疟原虫的不同侵入期进行抗原组分分析.结果经上述两种方法检测发现,顶端复合体抗原成分复杂,约氏疟原虫和伯氏疟原虫的棒状体有共同的抗原表位,约氏疟原虫的动合子与其自身的裂殖子有类似成分,也有各自独特的抗原.两种鼠疟原虫动合子抗原有类似成分.约氏疟原虫的子孢子具有与裂殖子、动合子不同的抗原成分.结论疟原虫侵入期棒状体和表面抗原在同一虫种的不同侵人期和不同虫种中有共同的抗原表位,也有各自的独特组分.
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细粒棘球绦虫EgA31重组蛋白的抗原表位分析预测
根据GenBank中细粒棘球绦虫EgA31序列(GenBank登录号为AF067807)设计引物,以细粒棘球绦虫mRNA为模板,RT-PCR扩增EgA31基因,将其克隆入pUCm-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,经BamH Ⅰ、SacⅠ双酶切和PCR鉴定,获得阳性重组质粒pUCm-T/EgA31,并将测序正确的片段连接表达载体,成功构建重组质粒pET30a-EgA31.经序列分析和同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞和T细胞表位分析,结果表明PCR扩增的特异条带为636 bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为100％.编码产物B细胞和T细胞联合表位预测,氨基酸区域可能在32～79、79～95、105～124和141～154位.
关键词： 细粒棘球绦虫 pET30a-EgA31 抗原表位 生物信息学 -
表位疫苗:疫苗研制新策略
人类通过接种疫苗已控制了许多重大感染性疾病并且消灭了天花,这是有史以来,人类征服疾病为辉煌的成绩.传统疫苗是将病原体灭活或减毒而制成的,但存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题.表位疫苗(epitope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗,包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重组表位疫苗(recombinant epitope-based vaccine)及表位核酸疫苗(epitope DNA vaccine,minigenes/epigenes),是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向.
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重组血吸虫诊断抗原研究进展
免疫学方法为诊断血吸虫病的重要手段,目前,用于血吸虫病免疫诊断的常用的抗原是成虫抗原和虫卵抗原.成虫抗原和虫卵抗原成分复杂,针对两种抗原的血清抗体在宿主体内长期存在,不能区别早期感染和既往感染,不能考核疗效,并且这两种抗原不易大量获得.现代生物技术的发展为解决上述问题提供了机遇.基因克隆技术能够帮助寻找刺激宿主产生短程抗体的某些抗原表位,通过检测短程抗体来评价治疗效果.同时依靠基因重组技术可以生产出相应的重组抗原分子,为现场推广应用所需大量的抗原材料提供了保证.本文主要就国内外研制基因重组抗原及其在血吸虫病诊断中的应用加以综述.
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丙型肝炎病毒抗原表位基因在新的抗原呈递系统中的重组构建及高效表达
目的将人工合成的丙型肝炎病毒(HCV)E1区的抗原表位基因,构建到一种新的抗原表位呈递系统的高效表达载体pET-RNA2中进行高效表达.方法运用基因工程技术将人工合成的HCVE1区的抗原表位基因,构建到一种新的抗原表位呈递系统的高效表达载体pET-RNA2中,构成一个嵌合基因进行高效表达.在该载体适当的位置插入外源抗原表位可使其呈现一定的空间构象,使抗原表位位于重组蛋白的表面并有望改善其免疫原性.结果分别在载体的106、153、305位氨基酸处插入外源抗原表位基因,成功构建了重组质粒pET RNA HCV/A1、pET-RNA-HCV/A2和pET-RNA-HCV/A3,并分别在大肠杆菌中进行高效表达.表达产物相对分子质量约为45000.初步研究结果表明,在特定条件下不需要异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导就可使之获得高效表达,表达的嵌合蛋白占菌体总蛋白的40%以上.结论HCV抗原表位基因成功构建到一种新的抗原呈递系统中并获得高效表达,为深入研究HCV抗原表位的免疫学和生物学特性奠定了基础,并对今后设计诊断试剂及抗原表位特异性疫苗有一定意义.
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我国HIV-1 B'亚型毒株GAG蛋白抗原表位变异研究
在HIV-1感染者体内针对病毒病原体产生特异性免疫应答的过程中,病毒自身所携带的抗原表位是机体免疫系统直接作用的靶点,对激活机体免疫应答起着至关重要的作用.但HIV的抗原表位不是一成不变的,而是在宿主免疫压力下不断地发生着各种各样的变化,这种变化正是HIV-1病毒逃避机体免疫监视的重要机制之一.我们试从抗原表位的角度对我国HIV-1 B'亚型毒株gag基因的变异进行分析,以期获得的抗原表位变化的数据资料可以为我国HIV-1 B'亚型疫苗的研制提供指导.
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P-糖蛋白抗原表位分析及表达
目的:研究P-糖蛋白抗原表位和表达.方法:联合应用多种方法对P-糖蛋白的二级结构和表面特性进行分析,设计了一对引物,PCR扩增产物插入到pGEM-T中,经测序正确后,再克隆入表达载体pGEX-2T,构建高效表达载体pGEX-Pgp,转化大肠埃希菌DH5α,进行表达、鉴定及纯化.结果:位于P-糖蛋白胞外段的抗原表位位点仅见于氨基酸残基82～115(I)、741～760(IV)及800～816(V).SDS-PAGE分析,表达出约30×103(30 kDa)大小的蛋白.结论:该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体或筛选其特异性结合肽,进行靶向治疗等工作奠定了基础.
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CD20抗原及治疗性抗CD20抗体
CD20是人类B淋巴细胞表面特有的标识.它高表达于所有正常B细胞和多数恶性B细胞表面,不会发生明显的内化和脱落,是治疗非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)理想的靶抗原.其胞外区由43个氨基酸残基组成,但组成的抗原表位却异常多样.目前,已经有多种针对CD20抗原的抗体被FDA批准上市,用于B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗,都显示出良好的效果.
关键词： CD20 抗原表位 抗CD20单克隆抗体 -
ELISPOT技术在抗肿瘤疫苗研究中的应用
在肿瘤疫苗治疗前后,如何准确的定量、定性判定肿瘤抗原特异性T细胞反应,评价疗效,是影响抗肿瘤疫苗发展的关键.ELISPOT法是近年来逐渐建立起来的一种通过检测细胞因子评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法.它能够对T淋巴细胞直接进行检测,不需要体外扩增,特异性、敏感性都有所提高.经过可行性分析和多中心对比研究,该技术不仅可用于监测肿瘤疫苗的疗效,也能用来鉴定肿瘤抗原表位.很有可能在完成的与其他方法的比较后ELISPOT将会成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选.
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计算机模建和点突变分析抗人CD40单克隆抗体5C11识别的抗原表位
目的:通过计算机模拟与点突变实验初步探讨本课题组前期研制的抗人CD40激发型单克隆抗体5C11识别的抗原表位.方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,构建抗原抗体复合物模型,通过计算推测5C11单抗所识别的抗原表位.构建人野生型CD40( wtCD40)及其第70位苏氨酸突变型(70muCD40)和第114位谷氨酸突变型(114muCD40)的重组真核表达载体pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40,脂质体转染法将重组载体导入HEK293细胞,筛选稳定转染细胞株(即HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞).流式细胞术和Western blotting 检测5C11单抗与HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞的结合能力.结果:成功构建plRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40真核表达载体和相应稳定转染细胞株.5C11单抗与HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞结合能力较HEK293/wtCD40细胞明显减弱；Western blotting检测结果表明,5C11单抗仅识别HEK293/wtCD40细胞,不识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞.结论:人CD40氨基酸序列的第70位苏氨酸和第114位谷氨酸是其单抗5C11识别的抗原表位,对构建人源化CD40抗体具有潜在的临床意义.
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从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位
目的:筛选能识别庚型肝炎病毒 (HGV)E2区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽.方法:利用抗HG V E2区的3株单克隆抗体M6,M13,M30作为筛选配基,对构象限制性的随机环9肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定.结果:证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出16个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有14个克隆与M6抗体有较强的特异结合;其中10个克隆在竞争抑制实验中抑制率大于50%.DNA测序表明9个克隆具有氨基酸核心序列GYAPLS,该序列与HGV E2区第306～311位氨基酸有较好的同源性.用合成肽与核心序列相似的噬菌体克隆P9GC5和P9GC11进行HGV E2抗原抗体实验,显示它们的IC5 0分别为4.5和7.2 nmol/L.结论:从噬菌体随机肽库中筛选到能与H GV E2抗体特异性结合的HGV抗原表位,并确定与合成了具有活性的核心多肽序列.
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小鼠MHCⅠ类分子限制性MAGE-3多肽表位筛选
目的筛选小鼠MAGE-3抗原来源的MHC Ⅰ类分子限制性多肽表位.方法用计算机模拟设计,从MAGE-3中选取得分高的5个侯选表位.根据诱导T淋巴细胞增殖能力、对肿瘤细胞的特异性杀伤活性及释放细胞因子含量,评价多肽的免疫原性及免疫反应性.结果树突状细胞(DC)负载MAGE-341～49能够强效诱导T淋巴细胞增殖,DC负载MAGE-341～49诱导的T细胞以MHC Ⅰ类分子限制性方式,特异性识别表达MAGE-3抗原的肿瘤细胞.DC负载MAGE-341～49 诱导的T细胞群主要为CD8+T细胞,同时天然免疫系统中的NKT、γ/δT也得到活化.结论从小鼠MAGE-3抗原中筛选出CD8+T细胞识别的、MHC Ⅰ类分子限制性多肽表位MAGE-341～49 .
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含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究
目的研制基于表位的SARS-CoV基因疫苗,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择.方法通过网络数据库结合生物软件分析的方法,确定可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率,构建了含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗.结果多表位串联基因接入真核表达载体后,可在真核细胞内高效表达.多表位嵌合SARS-CoV基因疫苗免疫小鼠后,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应.结论该基于多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗可以诱导抗体应答,为该疫苗的深入研究奠定了基础.
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小鼠肝素酶H-2Kb限制性CTL表位的实验鉴定
目的 实验鉴定H-2Kb限制性小鼠肝素酶(mHpa)CTL表位.方法 5条mHpa表位分别负载C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞,并进一步诱导产生表位特异性的效应细胞,采用标准4 hCr释放试验检测效应细胞对不同靶细胞的免疫杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞分泌IFN-γ的能力.结果 5条mHpa CTL表位中,仅mHpa398-405和mHpa519-526可以诱导小鼠产生特异性CTL.对同来源的B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞和EL-4淋巴瘤细胞具有明显的免疫杀伤效应,而对H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有免疫杀伤效应,进一步研究发现,上述多肽特异性CTL对自体淋巴细胞和DC细胞不具有杀伤效应,另一方面,mHpa398-405和mHpa519-526还可促进效应细胞分泌IFN-γ的能力.结论 mH-pa398-405、mHpa519-526为小鼠肝素酶来源且受仟12Kb限制性CTL表位,小鼠体内可以诱导产生表位特异性的CTL反应.
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白免疫优势肽段的重组表达、纯化与鉴定
目的 构建结核分枝杆菌(MTB)ESAT-6免疫优势肽段(ESAT-6P)的基因表达工程菌,以获得大量重组肽段.方法 根据编码ESAT-6P的MTB基因序列,设计1对特异引物,通过PCR技术从H37Rv基因组DNA扩增出ESAT-6P编码基因,目的片段克隆到原核表达载体Pet-30a中,构建N端带有6His-tag的表达载体.将重组表达载体转化E. Coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达产物,斑点免疫结合法(DIBA)鉴定重组肽段的免疫反应性.结果 成功诱导表达ESAT-6蛋白的免疫优势肽段,与表达载体氨基酸序列融合后,表达产物相对分子质量约为16 500,该重组肽段以包涵体形式存在.DIBA结果表明,该重组肽段可被结核患者血清特异识别.结论 获得MTB ESAT-6免疫优势肽段的基因表达工程菌,为将此重组肽段应用于结核诊断试剂和新型疫苗的研制奠定了基础.
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妊娠相关血浆蛋白A的原核表达及蛋白纯化
目的 构建原核表达PAPP-A重组蛋白,并对蛋白质进行纯化.方法 根据DNAstar软件分析获得的编码PAPP-A特异抗原表位,利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以PAPP-A cDNA-质粒转化菌液为模板,进行PCR扩增.PAPP-A的DNA和pET42a质粒分别双酶切,经琼脂糖凝胶电泳及胶回收后进行连接反应,转化至大肠埃希菌Top10,筛选阳性克隆经测序鉴定正确后,转化至大肠埃希菌BL21,诱导产生PAPP-A重组蛋白,利用镍柱初步纯化及离子交换层析柱进一步纯化,用SDS-PAGE及DEAE层析鉴定重组抗原蛋白.结果 筛选出抗原表位集中区,在大肠埃希菌BL21中高效表达了重组的PAPP-A蛋白,经过镍柱及离子交换层析纯化后,PAPP-A浓度为0.22 g/L,DEAE层析分析证实其纯度较高.结论 成功筛选出PAPP-A的抗原表位集中区,并制备了重组抗原蛋白,为PAPP-A的后续临床研究提供依据.
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诱导T细胞免疫反应的日本血吸虫抗原表位的重组表达与免疫原性鉴定
目的 对预测的日本血吸虫T细胞免疫反应表位进行合成与融合表达,并对其免疫原性进行分析.方法 根据3个表位(P7、P17、P18)的基因序列,人工合成正、负链寡核苷酸序列,使正链的5'端带有Nco I酶切位点,负链的3'端带有Xho I酶切位点.将每条表位肽的正、负寡核苷酸链退火形成双链DNA后,定向克隆入表达载体pET32c(+),电转化至 E.coli DH5α,经PCR、酶切及DNA序列分析鉴定出分别含有P7、P17、P18序列的重组质粒.提取重组质粒电转化至E.coli BL21(DE3)中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷对表位肽融合蛋白进行诱导表达,经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.表位肽融合蛋白用Ni2+螯合亲和层析胶纯化.同时根据P7、P17及P18的氨基酸序列人工合成这3个表位肽段.用纯化的表位融合蛋白、人工合成的表位肽体外刺激紫外线致弱尾蚴免疫C57BL/6J小鼠脾细胞,3H-TdR掺入法检测其刺激淋巴细胞的增殖效果.结果 P7、P17、P18 3个表位肽基因序列被成功克隆到pET32c(+)中并获得重组质粒,重组质粒均能表达大小约20 kDa的融合蛋白.表达产物用Ni2+亲和层析胶纯化后获得纯化的肽融合蛋白.表位P7、P17重组蛋白或合成肽均能有效刺激小鼠淋巴细胞增殖.结论 P7、P17肽段是日本血吸虫的T细胞抗原表位.
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日本血吸虫保护性抗原模拟表位的筛选及其免疫保护作用的研究
目的在前期已建立日本血吸虫感染兔新模型的基础上,用该血清从噬菌体随机12肽库中筛选阳性单克隆噬菌体,并鉴定其诱导小鼠的免疫保护效果.方法通过给感染日本血吸虫家兔注射酚氧化酶抑制剂,抑制其体内日本血吸虫雌虫产卵,建立无虫卵肉芽肿的日本血吸虫感染动物新模型,用其血清筛选出阳性多克隆噬菌体,经与可溶性虫卵抗原(SEA)免疫兔血清充分吸附后,从中随机挑取14个单克隆分别纯化、扩增,用常规ELISA法检测阳性单克隆噬菌体的抗原性;挑选出与新模型兔血清呈强阳性反应,但与SEA免疫兔血清呈阴性或弱阳性反应的单克隆噬菌体,按1×10 15 pfu/次剂量,0-2-4周方案,皮下多点注射免疫小鼠.末次免疫4周后,每鼠经腹部皮肤攻击感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,感染42 d后观察减虫率及减卵率.结果所选14个单克隆噬菌体均能与新模型兔血清和常规感染模型兔血清反应,尤其是第8号和第13号2个克隆与新模型兔血清呈强阳性反应,但与SEA免疫兔血清呈阴性反应;8号、13号单克隆噬菌体及原始噬菌体肽库免疫小鼠后诱导抗攻击感染的减虫率及每克肝脏减卵率分别为35.81%和63.32%、32.09%和52.02%、14.90%和30.64%.结论阳性多克隆噬菌体与SEA免疫兔血清免疫吸附后能去除大部分表达SEA抗原模拟表位的克隆,所选14个单克隆噬菌体均表达了日本血吸虫抗原模拟表位.与阳性多克隆噬菌体及原始噬菌体肽库相比,2个单克隆噬菌体能诱导小鼠产生较高的免疫保护力,其表达的模拟抗原表位有可能作为多价疫苗的候选分子.
